专利名称：结合乙型肝炎病毒表面抗原的多肽及其序列的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程与生物医药领域。本发明涉及利用噬菌体肽库展示技术(Phage Display)筛选获得的一种靶向乙型肝炎病毒表面抗原的线性多肽分子，以及此多肽的氨基酸序列。
背景技术：
乙型肝炎病毒(!fepatitis B Virus, HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的重要原因之一，全球3. 5亿慢性HBV感染者中约75%分布在亚洲，而我国又是全球HBV感染人数最多的国家。因此，针对乙型肝炎的防治研究一直是我国医疗卫生科研的重要领域。虽然国内乙肝疫苗的计划免疫大大降低了乙肝的发病率，但是对已经存在的HBV慢性感染仍缺乏长期有效的抗病毒药物，且大多数药物并非特异性作用于肝脏。将药物与肝脏靶向性载体结合，使其选择性靶向到特定的肝细胞，从而使药物更高效地传递到肝脏、更 好地发挥药物的治疗作用是极具前景的治疗方案。HBV感染肝细胞后能够在感染细胞表面表达病毒的表面抗原HBsAg，利用HBsAg作为靶子，将治疗药物运送到感染细胞内发挥作用是非常有前景的一种治疗设想。噬菌体肽库展示技术是将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体肽库展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子的多肽配体通过一种被称为淘选(panning)的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板(或磁珠)共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。筛选得到的小分子多肽具有结构简单、分子量小、穿透性好、不易引起机体免疫应答等优点，可以作为一种良好的靶向分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种线性多肽分子，通过特异性结合肝脏中感染乙型肝炎病毒的肝细胞来实现乙肝治疗药物运送的靶向性，可用于慢性乙型肝炎的诊断与治疗。本发明采用以下技术方案采用酵母表达的方法体外表达乙型肝炎病毒表面蛋白，以其为靶蛋白，采用噬菌体肽库展示技术筛选具有高亲和力的HBsAg特异性多肽分子，命名为SBP3。该多肽分子的氨基酸序列为SSYAPYVWQPIA。剂量依赖试验显示带有SBP3序列的No. 3号噬菌体克隆能有效结合包被的HBsAg。。竞争结合试验显示游离的HBsAg与No. 3号曬菌体预先结合后，能够抑制噬菌体与包被的HBsAg的结合，且游离的HBsAg浓度越高，抑制作用越强，提示No. 3号噬菌体与HBsAg的结合是特异性的。本发明的有益效果
(I)获得了一种能够特异高效结合乙型肝炎病毒表面抗原的线性多肽分子。该多肽分子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)为进一步筛选慢性乙型肝炎诊断和治疗药物奠定了基础。
图I :是噬菌体肽库技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合多肽分子的流程图。图2 :经过4轮筛选，与乙型肝炎病毒表面抗原结合的噬菌体文库得到了逐步富集。图3 :富集文库中与乙型肝炎病毒表面抗原结合的噬菌体克隆的结合力分析图。 图4 No. 3号曬菌体克隆与乙型肝炎病毒表面抗原结合的剂量依赖试验结果。图5 No. 3号噬菌体克隆与乙型肝炎病毒表面抗原结合的竞争抑制ELISA试验结果O
具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。实施例I噬菌体随机肽库的筛选利用酵母外源表达的HBsAg来源于中科院武汉生物制品研究所。将HBsAg用
O.lmol/LNaHC03 (pH 8. 6)包被缓冲液稀释成70 μ g/mL,每孔100 μ L包被96微孔板，4°C孵育过夜。倒掉包被液，每孔加满封阻液(O. lmol/L NaHC03, 5mg/ml BSA，O. 02%的NaN3)，4°C封阻 2h。用 TBST (50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 0. l%Tween_20)快速洗板 6次，每孔加入I. OX IO11Pfu的噬菌体，室温轻摇震荡60min，弃去未结合噬菌体液，用TBST洗板10次，每孔加入非特异性盐酸甘氨酸洗脱液(0.2mOl/L GlycineHCl, pH 2. 2, lmg/mLBSA)100yL,室温轻摇lOmin，洗脱特异性结合的噬菌体，收集洗脱液于微量离心管，加入中和缓冲液15 μ L( lmol/L Tris-HCl pH 9. 1)，留取5 μ L用于滴度测定，剩余洗脱物感染宿主菌ER2738进行扩增，回收后测滴度用于下一轮筛选。以同样的方法进行后面三轮筛选，TBST洗板时Tween-20浓度改为O. 5%。(图I、图2)实施例2夹心ELISA鉴定噬菌体克隆的结合特性用包被缓冲液将HBsAg稀释成20 μ g/mL,以每孔100 μ L包被微孔板，密封湿盒中4°C过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4°C封阻2h。O. 5%TBST洗板6次，然后按所测定的噬菌体滴度每孔加人5. OXKTpfu的噬菌体，室温作用两个小时，O. 5% Tween-20TBST洗板6次，再加入HRP标记的anti-M13phage VIII (1:5000)抗体，作用一个小时，O. 5%Tween-20TBST洗板6次，加入TMB显色液和终止液。以酶标仪读取A450值。同时以20 μ g/mL BSA 100 μ L包被微孔板作为对照，以了解各个克隆对BSA的亲和力，如图3所示，No. 3号曬菌体与HBsAg结合力最强。实施例3 No. 3号噬菌体与HBsAg的剂量依赖性结合试验将HBsAg和无关蛋白mlE⑶(原核表达和纯化的小鼠肝脏去唾液酸糖蛋白受体ASGPR 大亚基胞外段)以不同浓度(I μ g/mL、2. 5 μ g/mL、10 μ g/mL、40 μ g/mL 和 70 μ g/Ml)每孔IOOyL包被微孔板，4°C孵育过夜，并用封阻液4°C封闭2h，O. 5%TBST洗板6次。每孔加入5. OX IO10Pfu的No. 3号噬菌体和原库，室温作用两个小时，O. 5% Tween-20TBST洗板6次，再加入HRP标记的anti-M13phage VIII (1:5000)抗体，作用一个小时，O. 5%Tween-20TBST洗板6次，加入TMB显色液和终止液。以酶标仪读取A450值。结果如图4所示，No. 3号噬菌体与HBsAg的结合，随着HBsAg包被量的增加而增加，而No. 3号噬菌体与无关蛋白mlE⑶的结合、原库与HBsAg的结合没有剂量依赖性，表明No. 3号噬菌体与HBsAg的结合具有一定的特异性。实施例4竞争抑制ELISA试验按上述方法用20 μ g/mL H bsAg每孔100 μ L包被微孔板。将不同浓度(140 μ g/mL、70 μ g/mL、40 μ g/mL、20 μ g/mL、10 μ g/ml)的 HBsAg 取 100 μ L 与 I. 0X10lclpfu No. 3 号噬菌体上清混匀，室温作用2h。混匀物加入HBsAg包被微孔板内，室温震荡2h，O. 5%TBST洗板6次，加入HRP标记的anti-M13phage VIII (1:5000)抗体孵育Ih,再用O. 5%TBST洗板6次，加入TMB显色液和终止液。以酶标仪读取A450值，结果见图5。结果显示游离乙型肝炎病毒表面抗原能够阻断No. 3号曬菌体克隆与包被的乙型肝炎病毒表面抗原的结合,说明No. 3号噬菌体克隆与乙型肝炎病毒表面抗原的结合具有特异性。
权利要求
1.一种结合乙型肝炎病毒表面抗原的线性多肽分子，其特征在于该多肽分子的氨基酸序列为SSYAPYVWQPIA。
2.如权利要求I所述的一种线性多肽分子，其特征在于该多肽分子能特异性、高亲和力地结合乙型肝炎病毒表面抗原或靶向结合至感染乙型肝炎病毒的肝细胞。
全文摘要
本发明公开了一种靶向人感染乙型肝炎病毒肝细胞的线性多肽分子及其氨基酸序列，属于基因工程与生物医药领域。本发明应用噬菌体肽库展示技术，以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)为靶蛋白，从12多肽随机文库中筛选出了能与乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合的线性多肽分子SBP3，其氨基酸序列为SSYAPYVWQPIA。该多肽分子能特异性、高亲和力地结合乙型肝炎病毒表面抗原或靶向结合至感染乙型肝炎病毒的肝细胞。SBP3小肽为乙肝诊疗领域提供了一种特异高效的标记分子，并为开发慢性乙型肝炎诊断试剂与治疗药物提供了新的选择。
文档编号C07K7/08GK102850439SQ201210312579
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者杨燕, 马智勇, 杨东亮 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院