对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途

对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
【专利摘要】本发明描述了以高亲和力结合GPC3或GPC3上硫酸类肝素（HS）链的人单克隆抗体的鉴定。本发明描述的抗体能够抑制HCC细胞生长和迁移。提供了对GPC3或GPC3上HS链特异的人单克隆抗体，包括免疫球蛋白分子例如IgG抗体以及抗体片段例如单结构域VH抗体或单链可变区片段（scFv）。还提供了包含结合GPC3或GPC3上HS链的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸分子、包含所述核酸的表达载体和表达所述核酸的分离的宿主细胞。还提供了治疗癌症和/或抑制肿瘤生长或转移的方法。还提供了检测受试者中的癌症以及确认受试者的癌症的诊断的方法。
【专利说明】对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年4月19日提交的美国临时申请N0.61/477，020的权益，该临时申请以引用的方式全文纳入本文。
【技术领域】 [0003]本公开内容涉及对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)或GPC3上的硫酸类肝素特异的抗体以及它们用于治疗癌症的用途。
【背景技术】
[0004]肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三(Bosch et al.，Gastroenterologyl27: S5-S16, 2004 ;El_Serag et al., Gastroenterologyl32:2557-76, 2007)。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75%。往往直到晚期肝癌才会有症状。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。免疫治疗代表一种新方法，但是其仍然是一个挑战，这主要是因为没有良好的肿瘤特异性靶位。
[0005]硫酸类肝素蛋白聚糖中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族通过与糖基磷脂酰肌醇(GPI)共价连接而锚定到细胞表面。在脊椎动物中，已经鉴定了六个家族成员(GPC1-6)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白能够改变细胞信号通路并且促进细胞增殖和组织生长。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)在HCC和一些其他的人癌症包括黑色素瘤、肺的鳞状细胞癌和卵巢的透明细胞癌中高表达，但是在正常的组织中不表达(Ho和Kim, Eur J Cancer47 (3):333-338, 2011)。GPC3基因编码70kDa的前体核心蛋白，所述前体核心蛋白可被弗林蛋白酶切割产生40kDa的氨基(N)端片段和30kDa的膜结合羧基(C)端片段。所述C端具有两个硫酸肝素(HS)聚糖链。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞膜。GPC3结合Wnt和Hedgehog信号蛋白(Capurro et al., Dev Cel114:700-711, 2008 ；Capurro et al., CancerRes65:6245-6254, 2005)，并且还能够通过其HS聚糖链结合碱性生长因子例如成纤维细胞生长因子 2 (Song et al., J Biol hCem272:7574-7577，1997)。
[0006]GPC3的功能丧失型突变引起过度生长综合症(Simpson-Golab1-Behmel
syndrome)-一种罕见的伴X染色体的过度生长疾病(Pilia et al., Nat
Genetl2:241-247, 1996)。GPC3 缺陷的小鼠具有类似的症状(Cano-Gauci et al., J CellBiol 146:255-264，1999)。在转基因小鼠中，过表达GPC3可抑制肝细胞增殖和肝再生(Liuet al.，Hepatology52 (3): 1060-1067，2010)。另外,Zittermann 等人最近指出，用慢病毒感染的表达可溶性GPC3 (sGPC3)的HCC细胞具有更低的细胞增殖速率(Zittermann etal.，Int J Cancerl26:1291-1301, 2010)。这一发现可能暗示由感染的细胞分泌的sGPC3蛋白以自分泌的方式抑制细胞增殖。新近一项在人HEK-293细胞中使用没有GP1-锚定结构域的重组sGPC3 (GPC3AGPI，氨基酸残基Q25-H559)的研究提供了 sGPC3蛋白可在体外抑制 HCC 生长的直接证据(Feng et al., Int J Cancerl28 (9): 2246-2247，2011 )。然而，GPC3的确切生物功能和其在肿瘤发生中的作用仍是未知的。
[0007]HS蛋白聚糖(HSPG)是关键的分子效应物并且由于它们能够与许多重要的分子相互作用而在癌症和血管发生中具有多种功能。HSPG的大部分蛋白结合活性归功于HS链(Kim et al., J Endocrinol209 (2): 139-151，2011)。平均 HS 链的长度为 50-200 个重复的二糖单元。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，但是对肿瘤转移的分子机制仍然知之甚少。已经广泛接受的是，蛋白酶例如基质金属蛋白酶的蛋白水解活性可促进癌症转移。最近，新出现的证据显示，癌症转移还伴随有能够切割HS蛋白聚糖的HS侧链的酶(例如类肝素酶)的活性(Arvatz et al., Cancer Metastasis Rev30 (2): 253-268，2011 )。

【发明内容】

[0008]本文提供了结合例如特异性结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体。所提供的抗体包括免疫球蛋白分子例如IgG抗体以及抗体片段例如单结构域VH抗体或单链可变区片段(scFv)。还提供了包括结合例如特异性结合GPC3或GPC3上HS链的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。还提供了包含本文公开的抗体和效应分子例如毒素的免疫缀合物。
[0009]本文提供的抗体和组合物可用于多种目的，例如用于在受试者中确认表达GPC3的癌症例如HCC的诊断。因此，本文提供了一种确认受试者中癌症的诊断的方法:使来自被诊断患有癌症的受试者的样品与结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体接触；并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合增加确认了所述癌症诊断。在一些实施方案中，所述方法还包括使特异性识别所述GPC3特异性抗体的第二抗体与所述样品接触并检测所述第二抗体的结合。
[0010]类似地，本文提供了一种在受试者中检测表达GPC3的癌症例如HCC的方法，其包括使来自所述受试者的样品与本文描述的人单克隆抗体接触；并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于对照样品，所述·抗体与所述样品的结合增加检测出所述受试者中的癌症。在一些实施方案中，所述方法还包括使特异性识别所述GPC3特异性抗体的第二抗体与所述样品接触，并且检测所述第二抗体的结合。
[0011]还提供了一种治疗患有癌症例如HCC的受试者的方法:选出患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的对GPC3或GPC3上HS链特异的单克隆抗体，或包含所述抗体的免疫缀合物。
[0012]在其他实施方案中，通过如下治疗或诊断所述癌症:给予包括SEQ ID N0:2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的单克隆抗体；或者给予包括SEQ ID NO: 14的氨基酸残基26-33、51-58 和 97-105 以及 SEQ ID NO: 16 或 SEQ ID NO: 31 的残基 27_32、50_52 和 89-97的单克隆抗体。在具体实施方案中，提供了一种抑制受试者中肿瘤生长或转移的方法:选出患有表达GPC3的癌症的受试者，给予所述受试者治疗有效量的本文公开的组合物。
[0013]从以下参照附图进行的详细描述中，本发明上述的和其他目的、特征以及优点会变得更加清楚。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1A和IB示出了重组GPC3蛋白的产生。(A)野生型GPC3蛋白和没有HS链的突变型GPC3的SDS-PAGE。(B)蛋白质印迹分析。Wt=野生型sGPC3_hFc ；mu=没有HS链的突变型 sGPC3 (AA) -hFc。
[0015]图2示出了克隆HN3VH与来自公开数据库的已知人VH (SEQ ID N0:2_10)的序列比对。
[0016]图3A是示出HN3-hFc的SDS-PAGE分析的凝胶。泳道I，5 μ g非还原的；泳道2，5 μ g还原的。图3B是一系列的流式细胞术曲线，其示出HN3结合GPC3阳性的Gl细胞，而不结合GPC3阴性的A431细胞。順3还结合一组!10:细胞系(!1印38、!1印62、!11111-1、!11111-4、Huh7 和 SK-H印I)。
[0017]图4A和4B是示出HN3对GPC3的高亲和力的曲线图。㈧使用包被在96孔板上的纯化的GPC3蛋白的ELISA测定。(B)对Gl细胞系进行的流式细胞术。
[0018]图5A是多种重组GPC3蛋白的一级结构的示意图。His，六个组氨酸标记；hFc，人IgGlFc标记；HS，硫酸类肝素糖胺聚糖。ΙΑΒ-hFc被用作hFc同种型对照。图5B是示出噬菌体ELISA结果的曲线图，其证明了克隆HN3独立于其标记(Fe或His)结合全长GPC3，而不结合GPC3片段(单独的N端或C端)。
[0019]图6A-6D是示出HN3在体外抑制HCC细胞增殖的一系列图。(A)在暴露于慢病毒转染的靶向GPC3的shRNA或乱序(scr) shRNA后72小时，Hep3B细胞系中GPC3蛋白水平的免疫印迹分析。慢病毒的靶向GPC3的shRNA sh-Ι和sh_2有效地抑制了 GPC3蛋白表达。(B)和(C)通过WST-8测定评估用GPC3-shRNA或乱序shRNA (scr)处理的HCC细胞。(D)用HN3人mAb或HN125处理四种HCC细胞系(Huh_7、Huh_4、Hep3B和A431)持续5天。通过WST-8方法测量细胞增殖。HN125被用作不相关的hFc对照。
[0020]图7A-7D是示出HN3诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和yap失活的一系列图。
(A)细胞周期分析。将细胞用HN3或HN125处理48小时，通过FACS进行细胞周期作谱(profiling)。与未处理的细胞(培养基)相比p〈0.05。(B)细胞凋亡分析。将细胞用HN3或ΙΑΒ-hFc处理72小时，然后进行膜联蛋白(Annexin)V/PI双重染色。与未处理的细胞相比ρ〈0.05。(C)HN3诱导了 !fep3B细胞中的PARP切割。将细胞与HN3或IAB-hFc —起孵育指示的时间。泳道1，HN3 ;泳道2，HN125 ;泳道3，仅培养基。HN125被用作不相关的hFc对照。(D)示出在体外在HN3处理的HCC细胞中yap失活和细胞周期蛋白Dl下调的蛋白质印迹。Ctrl=HN125
[0021 ] 图8A是纯化的重组GPC3蛋白的蛋白质印迹。GPC3_hFc，GPC3-人Fe融合物；GPC3(AA)-hFc，没有HS链的GPC3-人Fe融合物。图8B是示出了 ELISA结果的曲线图。将一 μ g的纯化的重组蛋白包被在96-孔板上并用1G12抗_GPC3mAb探测。rFc_GPC3，兔Fc-GPC3融合物。
[0022]图9A和9B示出了针对GPC3的噬菌体Fv的富集的曲线图。(A)在每轮具有2X IO12个输入噬菌体的淘选之后，计数输出菌落。(B)通过ELISA针对不同来源的GPC3测试每个噬菌体克隆。rFc-MSLN (兔Fe对照)和BSA被用作阴性对照。
[0023]图10示出了选出的scFv与HS20可变区重链(SEQ ID NO: 14)和轻链(SEQ IDN0:16)结构域的氨基酸序列的比对。⑶R是带阴影的。示出了 ABQ50854.1 (B组链球菌III型多糖的肽模拟表位；SEQ ID NO: 17) ；ADP21081.1 (犬树突细胞，SEQ ID NO: 18)；ABD59019.1 (TREM 样转录物 I ；SEQ ID NO: 19)和 ABQ50855.1 (B 组链球菌 III 型多糖的肽模拟表位；SEQ ID N0:20)的序列。CDR区根据Kabat (下划线)和頂GT (阴影)确定。
[0024]图1lA是示出HS20结合细胞裂解物中的重组和天然GPC3的蛋白质印迹。图1lB是示出细胞上HS20的流式细胞检测分析结果的曲线图。将细胞(A431、G1和H印G2)用不同浓度的HS20探测。通过流式细胞术用缀合PE的山羊抗人IgG第二抗体使所述结合可视。
[0025]图12是示出HCC组织中HS20的免疫组织化学分析的一系列图像。
[0026]图13A-13D是示出HS20的结合特性的图。⑷测试了所述HS20mAb与GPC3_hFc、GPC3 (AA) -hFc和仅GPC3的结合。1G12被用作阳性对照。IAB-hFc(人Fe对照)和BSA被用作阴性对照。(B)HS20对GPC3和仅HS的结合特异性。HS20结合GPC3是仅HS的至少1000倍。(C)免疫沉淀。将Gl (A431.GPC3+)细胞或H印3B细胞裂解，用HS20或同种型对照进行沉淀(pull down),然后用小鼠抗GPC3抗体检测(左图)。箭头指示了 GPC3核心蛋白，括弧指示了糖基化的GPC3。还用相同的策略检测了 GPC3敲低细胞(右图)。(D)竞争ELISA。将指示浓度的硫酸类肝素或肝素与HS20mAb (5yg/ml)预孵育。然后进行ELISA测定来检测HS20/GPC3亲和力。
[0027]图14A-14E是示出HS20通过妨碍GPC3与Wnt3a之间的相互作用而抑制HCC细胞中的细胞迁移的一系列图。(A)将H印3B细胞和Huh-4细胞用100μ g/ml的HS20或同种型对照处理。所述图像示出了使用Ifep3B (上图)和Huh4 (下图)细胞时伤口愈合测定的结果。
(B)示出在H印3B细胞上进行的伤口愈合测定的剂量反应(左图)和时间过程(右图)。数据表示为开放性伤口面积的百 分数，表示为三个重复的平均值土标准差(*P〈0.05)。(C)将Hep3B细胞用50 μ g/ml的IgG对照或HS20预处理3天，然后将GPC3用小鼠抗GPC3抗体免疫沉淀。检测到了 GPC3与Wnt3a之间的相互作用。(D)将!fep3B细胞用50 μ g/ml的IgG对照或HS20预处理3天并进行RT-PCR以测量指示的Wnt-靶基因的RNA表达水平。(E)将Hep3B细胞用50 μ g/ml的IgG对照或HS20预处理3天,然后通过蛋白质印迹测量β -连环蛋白表达。
[0028]图15Α示出了用(+ )或不用(_)内切糖苷酶PNG酶处理的HS20野生型(Wt) mAb的SDS-PAGE。每个样品使用5 μ g的纯化蛋白。NR=非还原的；R=还原的。图15B是用(+ )或不用(-)PNG酶处理的HS20Wt mAb的蛋白质印迹。使用山羊抗人κ链抗体检测HS20轻链。图 15C 示出了 HS20Vl 序列(SEQ ID NO: 16)与 ABD59019.1 的 VJTREM 样转录物 I ；SEQID NO: 19)和ABQ50855.1的Vl (B组链球菌III型多糖的肽模拟表位；SEQ ID NO:20)的比较。通过在所述'结构域的⑶R2中将天冬氨酸(N)残基突变为丙氨酸(A)残基产生了HS20突变体(Mt)。
[0029]图16A示出了还原(R)和非还原(NR)条件下HS20Wt和HS20Mt的SDS-PAGE。每个样品使用5 μ g的纯化蛋白。M=分子量标记物。图16B是示出用于评估HS20Wt和HS20Mt对GPC3的结合亲和力的ELISA的结果的曲线图。将ELISA板用5 μ g/mL的GPC3_hFc或GPC3 ( Δ HS) -hFc包被并与I μ g/mL的HS20Wt或HS20Mt —起孵育。山羊抗人κ链-HRP被用作第二抗体(1:5000稀释)。图16C是示出HS20Wt或HS20Mt与多种细胞系的提取物的结合的蛋白质印迹(每种样品为30 μ g的总蛋白)。5 μ g/ml的HS20Wt或HS20Mt被用作第一抗体，山羊抗人K链-HRP被用作第二抗体(1:5000稀释)。
[0030]图17A-17C是示出HS20抑制HCC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长的一系列图。(A)通过皮下注射将1000万个H印G2细胞植入裸鼠中。当肿瘤达到IOOmm3的体积时,每周两次通过静脉内注射用20mg/kg的HS20治疗小鼠。肿瘤体积(V)使用公式V=ab2/2 (其中a和b分别表示肿瘤长度和宽度)定量。(B)用所述肿瘤组织通过co-1P测定检测GPC3和Wnt3A之间的相互作用。(C)检测Wnt信号转导下游基因的RT-PCR。
[0031]图18A-18B示出了使用Huh-7细胞作为异种移植物时HN3会抑制小鼠中的肿瘤生长。(A)示出在裸鼠中使用HCC异种移植模型时的结果的曲线图。箭头指示了注射HN3(60mg/kg)。(B)在小鼠中在HN3处理的HCC肿瘤中yap的失活和细胞周期蛋白Dl的下调。Ctrl:载体。
[0032]图19A是HN3(VH)_PE38免疫毒素的示意图。为了制备抗GPC3免疫毒素，将HN3VH与截短的PE38融合。图19B是示出从mono-Q柱洗脱的HN3(VH)_PE38免疫毒素蛋白过TSK凝胶过滤体积排阻柱的曲线图。图19C示出了 SDS-PAGE分析。从TSK柱收集的HN3 (VH) -PE38免疫毒素级分被加载到所述凝胶上。
[0033]图20是示出HN3 (VH) -PE38免疫毒素抑制HCC细胞系的细胞增殖的一系列图。将癌细胞与不同浓度的含HN3(VH)-PE38的抗GPC3免疫毒素或BL22孵育72小时。通过WST测定确定细胞增殖。虚线表示50%的细胞增殖抑制，其是与未用所述毒素处理的细胞相比使细胞活力降低达50%的毒素浓度。BL22:对CD22特异的免疫毒素，用作非特异性的对照。
[0034]图21是示出所述异种移植模型中HN3(VH)_PE38免疫毒素的抗肿瘤活性的曲线图。用300万个Gl细胞皮下接种BALB/c nu/nu小鼠。当肿瘤达到IOOmm3的平均体积时，每隔一日给予小鼠0.4mg/kg的HN3 (VH) -PE38免疫毒素，持续约一周。箭头:HN3 (VH) -PE38注射。用公式V=ab2/2 (其中a和b分别表示肿瘤长度和宽度)定量肿瘤大小。*p〈0.05。
[0035]序列表
[0036]列于所附序列表中的核酸和氨基酸序列使用37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每个核酸序列的一条链，但是应理解任何提及所示链包括其互补链在内。在所附序列表中:
[0037]SEQ ID NO:1为单结构域(VH)抗体HN3的核苷酸序列。
[0038]SEQ ID NO: 2为单结构域(VH)抗体HN3的氨基酸序列。
[0039]SEQ ID N0:3_10为人抗体的VH结构域的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO: 11 为 HS20scFv 的核苷酸序列。
[0041]SEQ ID NO: 12 为 HS20scFv 的氨基酸序列。
[0042]SEQ ID NO: 13为HS20 (Wt)的VH结构域的核苷酸序列。
[0043]SEQ ID NO: 14为HS20 (Wt)的VH结构域的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO: 15为HS20 (Wt)的VL结构域的核苷酸序列。
[0045]SEQ ID NO: 16为HS20 (Wt)的VL结构域的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO: 17为结合B组链球菌III型多糖的肽模拟表位的VH结构域的氨基酸序列(GenBank 登录号 ABQ50854.1)。
[0047]SEQ ID NO: 18为结合犬树突细胞的VH结构域的氨基酸序列(GenBank登录号ADP21081.1)。
[0048]SEQ ID NO: 19为抗TREM样转录物I的抗体的VL结构域的氨基酸序列(GenBank登录号 ABD59019.1)。
[0049]SEQ ID NO: 20为结合B组链球菌III型多糖的肽模拟表位的VL结构域的氨基酸序列(GenBank 登录号 ABQ50855.1)。
[0050]SEQ ID N0:21 和 22 为引物序列。
[0051 ]SEQ ID NO: 23 为 PE-LR 的氨基酸序列。
[0052]SEQ ID NO:24 为 PE-LR/6X 的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO:25为具有降低的免疫原性的PE的氨基酸序列。
[0054]SEQ ID NO:26 为 PE-LR/8M 的氨基酸序列。
[0055]SEQ ID NO:27为PE38的氨基酸序列。
[0056]SEQ ID NO:28 为 HN3-PE38 的核苷酸序列。
[0057]SEQ ID NO:29 为 HN3-PE38 的氨基酸序列。
[0058]SEQ ID NO:30为HS20Mt的VL结构域的核苷酸序列。
[0059]SEQ ID NO:31为HS20Mt的VL结构域的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0060]1.缩写
[0061]BSA 牛血清白蛋白
·[0062]⑶R 互补决定区
[0063]cfu 菌落形成单位
[0064]CTL 细胞毒性T淋巴细胞
[0065]ECM 细胞外基质
[0066]ELISA酶联免疫吸附测定
[0067]FACS 荧光激活细胞分选
[0068]GPC3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3
[0069]HCC 肝细胞癌
[0070]hFc 人 Fe
[0071]HS硫酸肝素
[0072]HSPG 硫酸类肝素蛋白聚糖
[0073]Ig免疫球蛋白
[0074]mAb 单克隆抗体
[0075]PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0076]PE假单胞菌(Pseudomonas)外毒素
[0077]pfu 空斑形成单位
[0078]rFc 兔 Fe
[0079]SGPC3可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3
[0080]I1.术语和方法
[0081]除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于 Benjamin Lewin, genes V,由 Oxford University Press 出版，1994(ISBN0-19-854287-9) ；Kendrew 等(eds.)，The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)和 RobertA.Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0082]为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释:
[0083]抗体:包含至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其识别并结合(例如特异性地识别并特异性地结合)抗原例如GPC3或其片段的表位。免疫球蛋白分子由重链和轻链组成，所述重链和轻链各自具有可变区，称为重链可变区(Vh)和轻链可变区(')。所述Vh区和\区一起负责结合被抗体识别的抗原。
[0084]抗体包括完整的免疫球蛋白和变体以及本领域熟知的抗体的部分，例如单结构域抗体(例如VH结构域抗体)、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’ 2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物稳定的Fv蛋白(“ dsFv ”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链被突变以引入二硫键来稳定所述链的连接。该术语还包括遗传工程形式例如嵌合抗体(例如人化鼠抗体)、异缀合抗体(heteroconjugate antibody)(例如双特异性抗体)。还可见于 Pierce Catalog andHandbook, 1994-1995 (Pierce Chemical C0., Rockford, IL) ；Kuby, J., Immunology, 3rdEd., ff.H.Freeman & C0., New York, 1997。
[0085]通常,天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。轻链有λ和κ两种类型。有5类决定抗体分子功能活性的主要重链(或同种型):IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。
[0086]每条重链和轻链均含有 恒定区和可变区(所述区还称为“结构域”)。相结合，重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“⑶R”)隔开的“框架”区。已经根据Kabat等人(见Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Departmentof Health and Human Services, 1991),和 ImMunoGeneTics 数据库(IMGT)(见，Lefranc, Nucleic Acids Res29:207-9，2001 ;和 http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&0ption=humanIg)确定了框架区和Q)R的范围。Kabat数据库在线维持(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/igblast/)。不同的轻链或重链的框架区的序列在同一物种例如人内是相对保守的。抗体的框架区，也就是组成的轻链和重链的结合框架区，用于在三维空间中安置和排列所述⑶R。
[0087]⑶R主要负责与抗原的表位结合。每条链的⑶R—般被称为⑶R1XDR2和⑶R3，从N端开始顺序编号，一般还通过所述具体⑶R所在的链来鉴定。因此，Vh⑶R3 (或H-⑶R3)位于其所在抗体的重链可变区，而' CDRl (或L-CDRl)是来自其所在抗体的轻链可变区的CDR1。例如，结合GPC3的抗体会具有特定的Vh区和\区序列，并因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(即，对不同的抗原有不同的结合位点)具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间的CDR不同，但是仅CDR内有限数量的氨基酸位置直接涉及抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
[0088]提及“VH ”或“VH”时，是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VJ或“VL”时，是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括FV、SCFV、dSFV或Fab的可变区。
[0089]“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单个克隆或由被单一抗体的轻链和/或重链基因转染的细胞产生的抗体。单克隆抗体是由本领域技术人员所知晓的方法产生的，例如通过将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞融合制备杂合的抗体形成细胞。单克隆抗体包括人化单克隆抗体。
[0090]“嵌合抗体”具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一物种的CDR (其一般赋予抗原结合)，例如特异性结合GPC3的鼠抗体。 [0091]“人”抗体(也称为“全人”抗体)是包括人框架区和人免疫球蛋白的全部CDR的抗体。在一个实例中，所述框架和所述CDR是源自于相同的人重链和/或轻链氨基酸序列。然而，可以设计来自一个人抗体的框架以包括来自不同的人抗体的CDR。“人化”免疫球蛋白是含有人框架区和一个或多个来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，在一种人化免疫球蛋白中，所有的CDR均来自供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但是如果存在则必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，具有至少约85-90%，例如约95%或更高的同一性。因此，可能除了所述CDR外，人化免疫球蛋白的所有部分均与天然的人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人化抗体”是含有人化轻链和人化重链免疫球蛋白的抗体。人化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人化免疫球蛋白或抗体的受体框架可能有有限数量的氨基酸被取自供体框架的氨基酸置换。人化或其他的单克隆抗体可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响的额外的保守性氨基酸置换。人化免疫球蛋白可以通过遗传工程方法构建(参见，例如，美国专利N0.5，585，089)。
[0092]结合亲和力:是指抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过由Frankel et al., Mol.1mmunol., 16:101-106, 1979 描述的 Scatchard 方法的修改方法计算的。在另一实施方案中，结合亲和力是通过抗原/抗体的解离速率测量的。在另一实施方案中，高结合亲和力是通过竞争性放射免疫测定测量的。在另一实施方案中，结合亲和力是通过ELISA测量的。“特异性结合”抗原(例如GPC3)的抗体是以高亲和力结合所述抗原并且不显著结合其他不相关抗原的抗体。
[0093]化学治疗剂:在特征为异常细胞生长的疾病的治疗中有治疗用途的任何化学试剂。这样的疾病包括肿瘤、新生物(neoplasm)和癌症以及特征为增生性生长的疾病，例如银屑病。在一个实施方案中，化学治疗剂是用于治疗肝癌例如HCC，或另一肿瘤的试剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是放射性化合物。本领域技术人员可容易地鉴定使用的化学治疗剂(见，例如，Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter86in Harrison’sPrinciples of Internal Medicine, 14th edition ；Perry et al., Chemotherapy, Ch.17inAbeloff，Clinical 0ncology2nd ed., ? 2000Churchi11 Livingstone, Inc ；Baltzerj L., Berkeryj R.(eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed.St.Louis, Mosby-Year Book, 1995 ;Fischer，D.S.，Knobf，M.F.，Durivagej H.J.(eds): TheCancer Chemotherapy Handbook, 4th ed.St.Louis, Mosby-Year Book, 1993)。联合化疗是给予多于一种的试剂来治疗癌症。一个实例是给予与放射性或化学化合物联合使用的可结合GPC3 (或GPC3上HS链)的抗体。
[0094]保守变体:“保守”氨基酸置换是基本上不影响或降低蛋白的亲和力例如抗体对GPC3的亲和力的那些替换。例如，特异性结合GPC3的人抗体可包括至多约1、至多约2、至多约5、至多约10或至多约15个保守替换，并且特异性结合GPC3多肽。术语保守变化还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，只要抗体特异性结合GPC3。非保守替换是降低活性或与GPC3结合的那些。
[0095]提供功能类似的氨基酸的保守氨基酸置换表是本领域技术人员所熟知的。以下六组是被认为是互为保守替换的氨基酸的实例:[0096]I)丙氨酸(A)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴；
[0097]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0098]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0099]4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；
[0100]5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和
[0101]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0102]互补决定区(CDR):共同限定天然Ig结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。Ig的轻链和重链各自具有三个⑶R，分别称为L-⑶Rl、L-raR2、L-raR3和 H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3。
[0103]接触:以直接物理联系方式放置；包括固体形式和液体形式。
[0104]细胞毒性:分子例如免疫毒素对意欲靶向的细胞的毒性，而不是对生物其他细胞的毒性。在一个实施方案中，相反地，术语“毒性”是指免疫毒素对意图被所述免疫毒素的靶向部分靶向的那些细胞除外的细胞的毒性，术语“动物毒性”是指免疫毒素对动物的毒性，这是由于免疫毒素对意图被所述免疫毒素靶向的细胞除外的细胞的毒性。
[0105]简并变体:在本公开的上下文中，“简并变体”是指编码GPC3多肽或结合GPC3 (或GPC3上HS链)的抗体的多核苷酸，所述多核苷酸包括遗传密码简并的序列。存在20种天然氨基酸，其中大多数由多于一种密码子编码。因此，所有的简并核苷酸序列都包括在内，只要所述核苷酸序列编码的GPC3多肽或结合GPC3的抗体的氨基酸序列没有改变。
[0106]诊断:鉴定病理状况例如但不限于肝癌、卵巢癌、黑色素瘤或肺癌的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性有所不同。诊断测定的“灵敏度”是检测为阳性的患病个体的百分数(真阳性的百分数)。诊断测定的“特异性”是I减去假阳性率，其中假阳性率定义为没有患所述疾病而被检测为阳性的那些个体的比例。虽然某一具体的诊断方法可能不能提供对状态的明确诊断，但是如果所述方法提供可帮助诊断的阳性指示那它就是满足需求的。“预后”是指病理状况例如肝癌或转移的发展(例如严重程度)的可能性。
[0107]效应分子:意欲对嵌合分子靶向的细胞具有需要的效应的嵌合分子的部分。效应分子还被称为效应部分(effector moiety, EM)、治疗剂或诊断剂或类似的术语。
[0108]治疗剂包括化合物例如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸治疗物和诊断部分包括反义核酸、与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸、和三链形成寡核苷酸。或者，连接到靶向部分(例如抗GPC3的抗体)的分子可以为包裹系统(encapsulation system)例如脂质体或微团,所述脂质体或微团含有治疗组合物例如药物、核酸(例如反义核酸)或可被保护以免于直接暴露于循环系统的另一治疗部分。制备连接有抗体的脂质体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，美国专利 N0.4，957，735 ;和 Connor et al.，Pharm.Ther.28:341-365，1985)。诊断剂或诊断部分包括放射性同位素和其他可检测标记。用于这种目的的可检测标记在本领域也是熟知的，包括放射性同位素例如 35S、nC、13N、150、18F、19F、99niTc、1311、3H、14C、15N、9°Y、99Tc、mIn 和1251、荧光团、化学发光剂和酶。
[0109]表位:抗原决定簇。这些是具有抗原性(即可诱发特异性免疫应答)的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽(例如GPC3)上的特定抗原表位。
[0110]框架区:介于⑶R之间的氨基酸序列。框架区包括轻链可变框架区和重链可变框架区。框架区起到使CDR处于合适的方向以结合抗原的作用。
[0111]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3):硫酸类肝素(HS)蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员，其通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞表面(Filmus and Selleck, J ClinInvestl08:497-501, 2001)。GPC3基因编码约70kD的核心蛋白，所述核心蛋白可被弗林蛋白酶切割产生N端40kD片段和C端30kD片段。GPC3的C端部分上连接有两条HS链。GPC3和其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族蛋白在细胞分裂和细胞生长调节中起作用。GPC3在HCC和一些其他人癌症包括黑色素瘤、肺鳞状细胞癌和卵巢透明细胞癌中高表达(Ho andKim, Eur J Cancer47 (3): 333-338，2011 )，但是在正常组织中不表达。GPC3还被称为SGB、DGSX, MXR7、SDYS, SGBS, 0C1-5、SGBSl 和 GTR2-2。
[0112]人GPC3有四种已知的亚型(亚型1-4)。GPC3的四种亚型的核酸和氨基酸序列是已知的，包括 GenBank 登录号:NM_001164617 和 NP_001158089 (亚型 I) ;NM_004484 和NP_004475 (亚型 2) ；NM_001164618 和 NP_001158090 (亚型 3);以及 NM_001164619 和NP_001158091 (亚型4)。在本公开的一些实施方案中，本文公开的抗体可结合所述四种人GPC3亚型的一种或多种，或其保守变体。
[0113]HAMA (人抗鼠抗体)应答:人受试者中对已经给予所述患者的鼠抗体的可变区和恒定区的免疫应答。重复的抗体给药可能导致抗体从患者血清中清除的速率增加，并且还可能诱发患者中的变态反应。
[0114]硫酸类肝素(HS):碳·水化合物的糖胺聚糖家族的成员，其在结构上与肝素非常密切相关。HS是发现于所有动物组织的线性多糖。发现HS为蛋白聚糖(PG)，其中两条或三条HS链接近地连接到细胞表面或细胞外基质蛋白。HS以这种形式结合多种蛋白配体并调节多种生物活性，包括发育过程、血管发生、血液凝固和肿瘤转移。
[0115]肝细胞癌(HCC):—种原发性的肝恶性肿瘤，一般发生在具有由病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化(经常由酒精中毒引起)引起的炎症性肝的患者中。HCC也被称为恶性肝细胞瘤。
[0116]宿主细胞:在其中载体可以增殖并其且DNA可以表达的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这类后代被包括在内。
[0117]免疫应答:免疫系统的细胞，例如B细胞、T细胞或单核细胞，对刺激的应答。在一个实施方案中，所述应答对于具体抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在另一实施方案中，所述应答为B细胞应答，并且导致产生特异性抗体。
[0118]免疫缀合物:效应分子与抗体或其功能片段的共价连接。效应分子可以为可检测标记或免疫毒素。毒素的具体非限制性实例包括，但不限于，相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素(PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素，或其经修饰的毒素，或直接或间接地抑制细胞生长或杀死细胞的其他毒性试剂。例如PE和DT是一般通过肝毒性引发死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过除去所述毒素的天然靶向组分(例如PE的结构域Ia和DT的B链)并将其替换为不同的靶向部分(例如抗体)而被修饰为可用作免疫毒素的形式。“嵌合分子”是缀合(偶联)效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。术语“缀合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方案中，抗体被接合到效应分子。在另一实施方案中，接合到效应分子的抗体被进一步接合到脂质或其他分子形成蛋白或肽，以增加其在体内的半衰期。连接可通过化学或重组方式。在一个实施方案中，所述连接是化学连接，其中，抗体部分和效应分子之间的反应产生了在所述两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。在所述抗体和效应分子之间可任选地包括肽接头(短的肽序列)。因为免疫缀合物最初由两个具有独立功能的分子(例如抗体和效应分子)制备，它们有时还被称为“嵌合分子”。因此，本文使用的术语“嵌合分子”是指缀合(偶联)效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。
[0119]分离的:“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器)已经与所述组分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物组分(即，其他染色体和额外染色体DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本分离或被纯化。已经被“分离”的核酸和蛋白质包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
[0120]标记:直接或间接地缀合到另一分子例如抗体或蛋白质以便于检测该分子的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括荧光标签、酶连接物和放射性同位素。在一个实例中，“标记的抗体”是指在抗体中纳入另一分子。例如，所述标记为可检测的标记物，例如纳入放射性标记的氨基酸或连接到可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素基多肽(例如可以通过光 学或比色方法检测的含有荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)。多种标记多肽和糖蛋白的方法是本领域已知的并且可以使用。可用于多肽的标记的实例包括，但不限于如下:放射性同位素或放射性核苷酸(例如35S、nC、13N、150、18F、19F、99mTc、1311、3H、14C、15N、9°Y、"Tc、mIn和1251)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、稀土荧光体(lanthanide phosphor))、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标示物、生物素基团、由第二报告物识别的预设多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性试剂例如钆螯合物。在一些实施方案中，标记被不同长度的间隔臂连接以减少可能的空间位阻。
[0121]接头:在一些情况中，接头是抗体结合片段(例如Fv片段)内的肽，其起到使重链可变区与轻链可变区间接结合的作用。“接头”还可以指用于将靶向部分(例如抗体)与效应分子(例如细胞毒素或可检测标记)连接的肽。
[0122]术语“缀合”、“接合(join)”、“键合”、“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子，或者是指将放射性核素或其他分子与多肽例如scFv共价连接。在具体上下文中，所述术语包括提及连接配体例如抗体部分与效应分子。所述连接可通过化学或重组的方式。“化学方式”是指所述抗体部分与效应分子之间的反应，其使得所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
[0123]哺乳动物:该术语包括人和非人哺乳动物。类似的，术语“受试者”包括人受试者和兽医受试者。
[0124]黑色素瘤:一种源于黑色素细胞(产生黑色素的细胞)的癌症形式。黑色素细胞主要存在于皮肤，但是也存在于肠和眼睛。皮肤中的黑色素瘤包括浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端黑色素瘤和恶性雀斑样痣(黑色素瘤)。上述类型中的任一种可产生黑色素或可以是无黑色素的。类似地，任何亚型可能表现出粘连形成(具有向神经性的稠密纤维反应)，其是攻击行为和局部复发趋势的标记物。其他黑色素瘤包括透明细胞肉瘤、粘膜黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
[0125]瘤形成、恶性肿瘤、癌症和肿瘤:新生物是由过度细胞分裂引起的组织或细胞的异常生长。新生物生长可产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以以肿瘤的数目、体积或重量来测量。不转移的肿瘤称为“良性的”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性的”。血液肿瘤的实例包括白血病,其包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin’sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级别形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0126]实体瘤例如肉瘤和癌的实例，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经胶质瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜神经胶质瘤(menangioma)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤) 。
[0127]在若干实例中，肿瘤为肝癌，例如HCC或肝母细胞瘤、黑色素瘤、鳞状细胞癌例如肺鳞状细胞癌、透明细胞癌例如卵巢的透明细胞癌、甲状腺癌、维尔姆斯氏瘤、神经母细胞瘤或睾丸生殖细胞瘤。
[0128]可操作地连接:当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能关系的方式放置时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子例如异源性启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子与所述编码序列是可操作地连接的。当需要将两个蛋白编码区域连接时，所述可操作地连接的DNA序列通常是连续的并且位于相同的读码框中。
[0129]药剂:当正确地给予受试者或细胞时能够诱导预期的治疗或预防效应的化合物或组合物。
[0130]可药用载体:使用可药用载体是常规的。Remington’ s PharmaceuticalSciences, by E.ff.Martin, Mack Publishing Co, Easton, PA,第 15 版，1975 描述的组合物和制剂适用于本文公开的抗体的药物递送。
[0131]通常，所述载体的性质取决于采用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体作为运载体(vehicle)，所述可注射流体包括可药用和生理上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体之外，待给予的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0132]预防、治疗或改良疾病:“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改良其征象或症状的治疗性干预，例如减少肿瘤负荷或减小转移灶的数量尺寸。“改良”是指降低疾病例如癌症的征象或症状的数量或严重程度。
[0133]启动子:启动子是指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如聚合酶II型启动子中的TATA元件。启动子还任选地包括位于离转录起始位点可以多达几千碱基对处的远端增强子或抑制子元件。可包括组成型和诱导型启动子(参见，例如，Bitter et al., Methods in Enzymologyl53:516-544，1987)。
[0134]启动子的具体非限制性实例包括衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。还可使用通过重组DNA或合成技术产生的启动子。可将多核苷酸插入到含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列有助于宿主中所插入的基因序列的有效转录。表达载体一般含有复制起点、启动子以及允许对转化的细胞进行表型选择的特定核酸序列。
[0135]纯化的:术语纯化的并不需要绝对的纯净，而是一个相对的术语。因此，例如，纯化的肽制剂是其中肽或蛋白质比所述肽或蛋白在其细胞中的天然环境下更加富集的肽制剂。在一个实施方案中，纯化制剂以使所述蛋白质或肽占所述制剂总肽或蛋白质含量的至少50%。基本纯化表示从其他蛋白质或细胞组分进行纯化。基本纯的蛋白质是至少60%、70%、80%、90%、95%或98% 纯的。因此，在一个具体非限制性实例中，基本纯的蛋白质是90%不含其他蛋白或细胞组分的。
[0136]重组体:重组核酸是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个原本分离的序列片段而制备的序列的核酸。该人工组合往往通过化学合成或者通过人工操作分离的核酸片段(例如通过基因工程技术)完成。
[0137]重组毒素:其中细胞靶向部分与毒素融合的嵌合蛋白(Pastan etal.，Science, 254:1173-1177，1991)。如果细胞靶向部分是抗体的Fv部分，那么所述分子被称为重组免疫毒素(Chaudhary et al., Nature, 339:394-397, 1989)。在遗传上改变所述毒素部分以使其不能结合大多数正常细胞上存在的毒素受体。重组免疫毒素选择性地杀死被抗原结合域识别的细胞。这些重组毒素和免疫毒素可用于治疗癌症，例如表达GPC3的癌症。
[0138]样品(或生物样品):犾自受试者的含有基因组DNA、RNA (包括mRNA)、蛋白质或其结合物的生物样本。实例包括，但不限于，外周血、组织、细胞、尿、唾液、组织活检物、细针抽出物、外科手术样本和尸检材料。在一个实例中，样品包括HCC组织活检样品。
[0139]序列同一性:氨基酸或核酸序列之间的相似性被表示为所述序列之间的相似性，或者称为序列同一性。序列同一性经常通过同一性(或相似性或同源性)百分比来度量；所述百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，多肽或核酸分子的同系物或变体具有相对高程度的序列同一性。
[0140]用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。多种程序和比对算法描述于:Smith 和 Waterman, Adv.Appl.Math.2: 482，1981 ；Needleman 和 Wunsch, J.Mol.Biol.48:443, 1970 ; Pear son 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85: 2444, 1988 ；Higgins 和 Sharp, Gene73:237，1988 ;Higgins 和 Sharp, CAB10S5:151，1989 ;Corpet 等Nucleic Acids Researchl6:10881, 1988 以及 Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444, 1988。Altschul 等 Nature Genet.6:119, 1994 提供了了序列对比方法和同源性计算的详细思路。
[0141]NCBI基础局部比对基本检索工具(BLAST) (Altschul等J.Mol.Biol.215:403, 1990)可以从若干来源获得，包括美国国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,NCBI,Bethesda, MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。互联网上的NCBI网站提供了如何使用该程序确定序列同一性的描述。
[0142]特异性结合GPC3多肽的抗体\或Vh的同系物和变体通常特征在于，当使用NCBIBlast2.0、空隙blastp设置为默认参数时，具有与所述抗体的氨基酸序列在全长比对上计得的至少约75%，例如至少约80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列,使用了 Blast2sequences功能、采用设置为默认参数(空隙存在值为11，每个残基空隙值为I)的默认BL0SUM62矩阵。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，比对应使用Blast2sequences功能、采用设置为默认参数(开放空隙9，延伸空隙I罚分)的PAM30矩阵来进行。通过该方法评估时，与参考序列有更高相似性的蛋白会显示增加的同一性百分比，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。当比较不完整的序列的序列同一性时，同系物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80%的序列同一'I"生，并且取决于它们与参考序列的相似性，可具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。确定在这样的短窗口上的序列同一性的方法可以从互联网上的NCBI网站获得。本领域的技术人员会理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导，完全有可能获得落在所提供范围之外的强显著性同系物。
[0143]鳞状细胞癌:一种源于鳞状上皮细胞的癌症类型，所述鳞状上皮细胞是形成皮肤、眼睛、多种内脏器官的表面和中空器官的内层以及一些腺体导管(duct)的薄的、扁平的细胞。鳞状细胞癌还称为表皮样癌。一种类型的鳞状细胞癌是肺鳞状细胞癌。
[0144]受试者:活的多细胞有脊椎生物一一个包括人受试者和兽医受试者的类别，包括人和非人哺乳动物。
[0145]治疗有效量:足以在被治疗的受试者中达到需要效果的具体物质的量。例如，这可以是抑制或遏制肿瘤生长所必需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是清除肿瘤、降低肿瘤的大小或防止肿瘤转移所必需的量。当给予受试者时，一般使用会达到靶组织浓度(例如在肿瘤中)的剂量，所述靶组织浓度已被表明可达到需要的体外效果。
[0146]毒素:对细胞有细胞毒性的分子。毒素包括相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、皂草素、局限曲菌素或白树毒素，或其经修饰的毒素。例如PE和DT是一般通过肝毒性引发死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过除去所述毒素的天然靶向部分(例如PE的结构域Ia或DT的B链)并将其替换为不同的靶向部分(例如抗体)而被修饰为可用作免疫毒素的形式。
[0147]载体:被导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含本【技术领域】已知的一个或多个选择标记基因以及其他遗传元件。
[0148]除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属【技术领域】普通技术人员通常所理解的相同。除非文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。类似地，除非文中另有明确说明，“或”意欲包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A或B，或A和B。还应该理解，为核酸或多肽给出的全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值，用于表述目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开的实施或测试，但适合的方法和材料在下文描述。本文提到的所有的出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。所有GenBank登录号以引用的方式纳入本文，如同它们在2011年4月14日出现在所述数据库中一样。如果出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的，不意欲进行限制。
[0149]II1.引言
[0150]本公开描述了结合GPCjI^n GPC3或GPC3上的硫酸类肝素(HS)链的单克隆抗体的鉴定。具体的实施方案公开了靶向人GPC3的单结构域VH人mAb (称为HN3)的分离和表征。本文公开的具体数据证明了 HN3以高亲和力结合细胞表面相关的GPC3。还表明，HN3结合GPC3的核心蛋白中的构象敏感表位。HN3在体外和体内抑制HCC细胞生长，这为GPC3结合物(binder)可直接抑制HCC细胞增殖提供了证据。
[0151]本文还公开了 GPC3上HS链特异性的人mAb (称为HS20)的产生和表征。HS20单链可变区片段(scFv)通过噬菌体展示被分离，并被转换为人IgG分子。HS20结合GPC3而不结合没有HS链的突变体形式的GPC3，指示了 HS20的表位位于HS链上。免疫组织化学分析显示了 HCC细胞的细胞膜上有强免疫染色，非癌细胞例如基质细胞上没有染色。此外，本文公开的伤口愈合测定的结果证明了 HS20可抑制HCC细胞迁移，并且异种移植(xenograft)研究证明了 HS20可在体内抑制HCC肿瘤生长。
[0152]IV.结合GPC3或GPC3上HS链的人单克隆抗体
[0153]本文公开了结合(例如特异性结合)GPC3核心蛋白或GPC3上HS链的人单克隆抗体。在一些实施方案中，所述人单克隆抗体为抗体片段，例如单结构域抗体，例如VH结构域。在其他实施方案中，所述抗体功能片段为scFv。在其他实施方案中，所述抗体为免疫球蛋白分子，例如IgG。
[0154]A.HN3——对GPC3特异的单(VH)结构域单克隆抗体
[0155]在本公开的一些实施方案中，对GPC3特异的人单克隆抗体是称为HN3的单结构域(VH)抗体。HN3的DNA和蛋白质序列示于下文，并且分别以SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2列于序列表中。表1A和IB列出了通过Kabat (表1A)和IMGT (表1B)确定的HN3⑶R的核苷酸和氨基酸位置。
[0156]HN3DNA 序列(SEQ ID NO:1)
[0157]CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTTATTTCGATTTCGATTCTTATGAAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTAGAGTGGATTGGGAGTATCTATCATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCA·AATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAGAGTAAATATGGACCGATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAAGT[0158]HN3 蛋白质序列(SEQ ID NO:2)
[0159]QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASYFDFDSYEMSWVRQAPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTATYYCARVNMDRFDYWGQGTLVTVSSS
[0160]表1Α.HN3序列中CDR的位置(根据Kabat)
【权利要求】
1.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基26-33、SEQ ID NO:2的氨基酸残基51-57和SEQ IDNO: 2的氨基酸残基96-105。
2.权利要求1的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
3.一种结合GPC3上硫酸类肝素(HS)的分离的人单克隆抗体，其中: (i)所述抗体的重链包含SEQID N0:14的氨基酸残基26-33、SEQ ID NO: 14的氨基酸残基51-58和SEQ ID NO: 14的氨基酸残基97-105 ； (ii)所述抗体的轻链包含SEQID NO: 16或SEQ ID NO:31的氨基酸残基27-32、SEQID NO: 16 或 SEQ ID NO:31 的氨基酸残基 50-52 和 SEQ ID NO: 16 或 SEQ ID NO:31 的氨基酸残基89-97 ;或
(iii)(i)和 Qi)。
4.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基27_32、50_52和89-97。
5.权利要求3的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 14的氨基酸残基26-33、51-58和97-105，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 31的氨基酸残基27_32、50_52和89-97。
6.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 14的氨基酸序列。·
7.权利要求3-5任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO: 16或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
8.权利要求1-7任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体为VH单结构域抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’ 2片段、单链可变区片段(scFv)或二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)。
9.权利要求8的人单克隆抗体，其中所述抗体为VH单结构域抗体。
10.权利要求8的人单克隆抗体，其中所述抗体为scFv。
11.权利要求1-7任一项的人单克隆抗体，其中所述抗体为IgG。
12.权利要求1-11任一项的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体被标记。
13.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述标记为荧光标记、酶标记或放射性 T 己 O
14.一种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求1-13任一项的抗体。
15.一种分离的免疫缀合物，其包含权利要求1-13任一项的人单克隆抗体和效应分子。
16.权利要求15的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为毒素。
17.权利要求16的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或其变体。
18.权利要求17的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为包含SEQID NO: 27的氨基酸序列的PE38。
19.权利要求16-18任一项的分离的免疫缀合物，其中所述人单克隆抗体为包含SEQID NO: 2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的VH单结构域抗体。
20.权利要求19的分离的免疫缀合物，包含SEQID NO:29的氨基酸序列。
21.权利要求15的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为可检测标记。
22.—种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求15-21任一项的分离的免疫缀合物。
23.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的权利要求14或权利要求22的组合物，从而治疗所述受试者的癌症。
24.一种抑制肿瘤生长或转移的方法，其包括选择患有表达GPC3的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的权利要求14或权利要求22的组合物，从而抑制肿瘤生长或转移。
25.—种确定受:试者是否患有癌症的方法，其包括: 使来自所述受试者的样品与权利要求1-13任一项的人单克隆抗体接触；和 检测所述抗体与所述样品的结合， 其中与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合增加可鉴定所述受试者患有癌症。
26.一种确认受试者的癌症的诊断的方法，其包括: 使来自被诊断患有癌症的受试者的样品与权利要求1-13任一项的人单克隆抗体接触；和· 检测所述抗体与所述样品的结合， 其中与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合增加可确认所述受试者的癌症的诊断。
27.权利要求25或权利要求26的方法，其中所述人单克隆抗体被直接标记。
28.权利要求25-27任一项的方法，还包括: 使特异性结合所述人单克隆抗体的第二抗体与所述样品接触，和 检测所述第二抗体的结合， 其中与所述第二抗体和对照样品的结合相比，所述第二抗体与所述样品的结合增加可检测所述受试者的癌症或确认所述受试者的癌症的诊断。
29.权利要求23-28任一项的方法，其中所述癌症为肝细胞癌(HCC)、黑色素瘤、肺癌或卵巢癌。
30.权利要求29的方法，其中所述癌症为HCC。
31.权利要求25-30任一项的方法,其中所述对照样品为来自未患癌症的受试者的样品O
32.权利要求25-31任一项的方法，其中所述样品为血液样品或组织样品。
33.一种编码权利要求1-13任一项的人单克隆抗体的分离的核酸分子。
34.权利要求33的分离的核酸分子，其中编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含 SEQ ID NO:1。
35.权利要求33的分尚的核酸分子，其中: (i)编码所述人单克隆抗体的重链的核苷酸序列包含SEQID NO: 13 ； (ii)编码所述人单克隆抗体的轻链的核苷酸序列包含SEQID NO: 15或SEQ ID NO:30 ；或
(iii)(i)和(ii)。
36.权利要求35的分离的核酸分子，其中所述人单克隆抗体的重链包含SEQIDNO: 13，所述人单克隆抗体的轻链包含SEQ ID N0:30。
37.权利要求33-36任一项的分离的核酸分子，与启动子可操作地连接。
38.一种表达载体,其包含权利要求33-37任一项的分离的核酸分子。
39.一种分离的宿主细胞，其转化有权利要求33-38任一项的核酸分子或表达载体。
40.治疗有效量的权利要求1-13任一项的抗体或权利要求14或权利要求22的组合物在用于治疗患有表达GPC3的癌症的受试者的方法中的用途。
41.治疗有效量的权利要求1-13任一项的抗体或权利要求14或权利要求22的组合物在用于抑制表达GPC3的癌症的生长或转移的方法中的用途。
42.权利要求40或权利要求41的抗体，其中所述癌症为HCC。
43.一种结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO:2的氨基酸残基50-65和SEQ IDNO:2的氨基酸残基96-1 05。
44.一种结合GPC3上硫酸类肝素(HS)的分离的人单克隆抗体，其中: (i)所述抗体的重链包含SEQID N0:14的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO: 14的氨基酸残基50-66和SEQ ID NO: 14的氨基酸残基97-105 ； (ii)所述抗体的轻链包含SEQID NO: 16或SEQ ID NO:30的氨基酸残基24-34、SEQID NO: 16 或 SEQ ID NO:30 的氨基酸残基 50-56 和 SEQ ID NO: 16 或 SEQ ID NO:30 的氨基酸残基89-97 ;或
(iii)(i)和(ii)。
45.一种分离的免疫缀合物，其包含权利要求43或权利要求44的人单克隆抗体和效应分子。
46.权利要求45的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为毒素。
47.权利要求46的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为假单胞菌外毒素或其变体。
48.权利要求47的分离的免疫缀合物，其中所述毒素为包含SEQID NO:27的氨基酸序列的PE38。
49.权利要求46-48任一项的分离的免疫缀合物，其中所述人单克隆抗体为包含SEQID NO: 2的氨基酸残基26-33、51-57和96-105的VH单结构域抗体。
50.权利要求49的分离的免疫缀合物，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列。
51.权利要求45的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子为可检测标记。
52.一种组合物，其包含可药用载体中的治疗有效量的权利要求45-51任一项的分离的免疫缀合物。
【文档编号】C07K16/30GK103596985SQ201280029201
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月19日
【发明者】M·何, 丰明乾, W·高, 金兴男, D·S·迪米特洛夫 申请人:美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表)