一种制备高纯度五味子甲素的方法
【专利摘要】一种制备高纯度五味子甲素的方法，将含有五味子甲素的粗提物经过硅胶柱，再用不同比例的溶剂进行洗脱，合并含有目标物组分，蒸干后进行结晶及重结晶，最终得到五味子甲素纯品。本发明方法载样量大，分离效率好，回收率高，成本低廉，可实现大批量工业化生产，所得五味子甲素含量达到99%以上，单一杂质小于0.1%。
【专利说明】一种制备高纯度五味子甲素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然植物提取领域，具体涉及一种制备高纯度五味子甲素的方法。
【背景技术】
[0002]五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物，《中华人民共和国药典》收录有两种五味子药材，分别为北五味子(Schisandra chinensis (Turcz) bail)和南五味子(华中五味子)(Schisandra sphenanthera r&d.etwils.)的果实。五味子植物中含有联苯环辛二烯结构的木脂素，是五味子中最主要的药理活性成分。五味子甲素(Schizandrin A)，又称五味子素A、去氧五味子素，是五味子中分离出的主要生物活性的木脂素，已广泛用作滋补药许多年。很多研究表明，其具有明确的药理作用，包括:①具有显著的肝细胞损伤拮抗作用，阻断多种毒物对肝细胞膜的损伤，抑制毒性产物的生成，降低血清转氨酶。②诱导肝微粒体细胞色素P450的活性，增强肝脏的解毒功能；③对活性氧自由基拮抗作用，抑制肝细胞膜的脂质过氧化；④促进肝糖原生成和蛋白质的合成代谢，有利于肝细胞功能恢复。最近，杨凌研究小组发现五味子甲素是人肝脏代谢酶P450 3A4的特异性底物，由于其毒性极低，因此有可能作为一种探针底物用于临床。【中国专利200910012552.3】。
[0003]目前获得高纯度五味子甲素的方法有采用高速逆流色谱(HSCCC)，[J.Chromatogr.A, 2005，1082，203-207 和中国专利 200910242188.X】，但高速逆流色谱仪器价格昂贵，制备量十分有限，不适于大规模生产。专利(申请号:201010510828.3)公开了一种制备五味子甲素的方法，利用柱色谱联用技术及重结晶方法，获得五味子甲素单体，但其工艺较为繁琐，且产品纯度不足98.5%，无法满足日后药用研究。孙文基等采用真空液相色谱法对北五味子中五味子甲素等进行提取分离，实验方法是五味子药材水浸后的药渣以80%乙醇渗漉，回收乙醇，浓缩液冰箱放置，取下层胶状物用乙醚溶解，伴少量硅胶后，用石油醚-乙酸乙酯(10:1)为流动相，进行真空液相色谱分离，将收集的木质素类，以苯-乙酸乙酯(10:1)流动相，进行第2次真空液相色谱分离，等分收集，TLC检查后，合并为两部分，其中第二部分用正己烷重结晶得白色针晶经检验为五味子甲素。该方法流动相中使用苯溶齐U，不适合规模化生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有分离五味子甲素生产工艺存在的缺点，提供一种制备高纯度五味子甲素的方法，该方法是一种工艺简便，适合工业化生产的生产工艺。
[0005]本发明提供了一种制备高纯度五味子甲素的方法，该方法具体步骤如下:
[0006](I)五味子甲素的提取:将五味子药材粉碎至60-80目，60-100%乙醇回流提取1-2次，每次1-2小时，合并提取液，提取液减压浓缩去除乙醇，加石油醚萃取，萃取相减压浓缩至干；
[0007](2)层析分离:将层析硅胶装入层析柱中，将步骤(I)样品用流动相溶解后上样，然后用流动相洗脱，洗脱后含五味子甲素部分合并蒸发至干；
[0008](3)结晶与重结晶:将层析后样品用乙醇溶解，再加入适量正己烷进行析晶，室温放置过夜得到结晶，结晶产品经过过滤后再减压烘干，得五味子甲素纯品；按照上述方法进行重结晶，获得最终的高纯度五味子甲素产品。
[0009]本发明提供的制备高纯度五味子甲素的方法，所述步骤(2)层析柱为动态轴向压缩柱，径高比为1:1?10 (优选1:3)。
[0010]本发明提供的制备高纯度五味子甲素的方法，所述步骤(2)样品与硅胶质量比为1:30?100 (优选1:50)，层析硅胶为200-800目(优选300-400)。
[0011]本发明提供的制备高纯度五味子甲素的方法，所述步骤(2)流动相为一种或几种低极性溶剂与一种或几种高极性溶剂的混合溶液。
[0012]本发明提供的制备高纯度五味子甲素的方法，所述低级性溶剂为石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷中一种；所述高极性溶剂为丙酮、乙酸乙酯、乙醇中的一种；考虑到溶剂的回收再利用，较优的，选择单一低极性溶剂和单一高极性溶剂的组合，更优的，选择石油醚和丙酮。所述低极性溶剂与高极性溶剂体积比为100:0.1?100:5
[0013]本发明提供的制备高纯度五味子甲素的方法，所述步骤(3)高纯度五味子甲素产品中五味子甲素含量大于99%,单个杂质含量小于0.1%。
[0014]利用高效液相色谱(HPLC)分析各步骤样品。HPLC条件:色谱柱:phenomenexPFP (250 X 4.6mm，5 μ )，检测波长:220nm，柱温:30°C，流动相:乙腈/水，流动相流速:
1.0mL/min,进样量:1uL0
[0015]产物鉴定:应用AgilentG6410A QQQ Mass Spectrometer质谱仪和Bruker500MHz核磁共振波谱仪分别进行MS/H-NMR谱的测定。
[0016]本发明的优点是:
[0017]1.本发明方法中溶剂可反复回收利用，成本低廉。
[0018]2.本发明所使用的溶剂安全、低毒、可重复利用，有利于操作人员的劳动保护和环境保护。
[0019]3.本发明工艺路线简单易操作，可实现实验室小量制备到工业化批量生产。
[0020]4.所得产品质量高,五味子甲素含量大于99%,单个杂质含量小于0.1%。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1五味子提取物的液相色谱图；
[0022]图2本发明终产品的液相色谱图；
[0023]图3本发明终产品与对照品的LC-MS图，其中，上面的图为对照品LC-MS图，下面的图为本发明产品LC-MS图；
[0024]图4本发明终产品的1H-NMR谱；
[0025]图5本发明终产品的13C-NMR谱。
【具体实施方式】
[0026]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0027]实施例1
[0028]将五味子药材Ikg粉碎至60目，80%乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩溶液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物55g，进行柱层析。色谱柱为轴向压缩柱，内径为200mm，硅胶粒度200-300目，将3kg硅胶倒入柱中，用30bar的压力将柱子装实，流动相选用二氯甲烷:乙酸乙酯=98:2 (体积比)进行等度洗脱，收集含五味子甲素的流份，通过液相色谱进行检测，将合格组分合并蒸干后得到8.Sg淡黄色固体，五味子甲素含量为94.1%，收率为90%。
8.8g淡黄色固体用150ml乙醇溶解，然后加入50ml正己烷，室温静置过夜，有大量白色晶体析出，过滤烘干，再按上述方法进行重结晶，过滤后70度真空(真空度-0.1Mpa)干燥8h得到五味子甲素产品7.lg，产品经液相色谱测定，五味子甲素含量达到99.8%，其余杂质均小于 0.1%。
[0029]实施例2
[0030]将五味子药材1.5kg粉碎至80目，90%乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩溶液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物89g，进行柱层析。色谱柱为轴向压缩柱，内径为200mm，硅胶粒度300-400目，将5kg硅胶倒入柱中，用20bar的压力将柱子装实，流动相选用正己烷:乙醇=99:1 (体积比)进行等度洗脱，收集含五味子甲素的流份，通过液相色谱进行检测，将合格组分合并蒸干后得到14.3g淡黄色固体，五味子甲素含量为93.6%，收率为86%。14.3g淡黄色固体用400ml乙醇溶解，然后加入200ml正己烷，室温静置过夜，有大量白色晶体析出，过滤烘干，再按上述方法进行重结晶，过滤后70度真空(真空度-0.1Mpa)干燥8h得到五味子甲素产品12.2g，产品经液相色谱测定，五味子甲素含量达到99.6%，其余杂质均小于0.1%。
[0031]实施例3
[0032]将五味子药材3kg粉碎至80目，80%乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩溶液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物156g，进行柱层析。色谱柱为轴向压缩柱，内径为200_，硅胶粒度600-800目，将5kg硅胶倒入柱中，用30bar的压力将柱子装实，流动相选用石油醚:丙酮=100:1 (体积比)进行等度洗脱，收集含五味子甲素的流份，通过液相色谱进行检测，将合格组分合并蒸干后得到24.9g淡黄色固体，五味子甲素含量为94.5%，收率为89%。24.9g淡黄色固体用500ml乙醇溶解，然后加入200ml正己烷，室温静置过夜，有大量白色晶体析出，过滤烘干，再按上述方法进行重结晶，过滤后70度真空(真空度-0.1Mpa)干燥12h得到五味子甲素产品21.2g，产品经液相色谱测定，五味子甲素含量达到99.8%，其余杂质均小于 0.1%。
[0033]实施例4
[0034]将五味子药材1.3kg粉碎至60目，90%乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩溶液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物70g，进行柱层析。色谱柱为轴向压缩柱，内径为200mm，硅胶粒度300-400目，将5kg硅胶倒入柱中，用20bar的压力将柱子装实，流动相选用二氯甲烷:正己烷:丙酮=90:7:3 (体积比)进行等度洗脱，收集含五味子甲素的流份，通过液相色谱进行检测，将合格组分合并蒸干后得到11.2g淡黄色固体，五味子甲素含量为95.2%，收率为92%。11.2g淡黄色固体用400ml乙醇溶解，然后加入10ml正己烷，室温静置过夜，有大量白色晶体析出，过滤烘干，再按上述方法进行重结晶，过滤后70度真空(真空度-0.1Mpa)干燥8h得到五味子甲素产品9.5g，产品经液相色谱测定，五味子甲素含量达到99.7%，其余杂质均小于0.1%。
[0035]实施例5
[0036]将五味子药材2.1kg粉碎至70目，80%乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩溶液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物103g，进行柱层析。色谱柱为轴向压缩柱，内径为200mm，硅胶粒度300-400目，将5kg硅胶倒入柱中，用50bar的压力将柱子装实，流动相选用三氯甲烷:乙醇=100:05 (体积比)进行等度洗脱，收集含五味子甲素的流份，通过液相色谱进行检测，将合格组分合并蒸干后得到11.2g淡黄色固体，五味子甲素含量为93.2%，收率为92%。16.4g淡黄色固体用300ml乙醇溶解，然后加入200ml正己烷，室温静置过夜，有大量白色晶体析出，过滤烘干，再按上述方法进行重结晶，过滤后70度真空(真空度-0.1Mpa)干燥8h得到五味子甲素产品13.9g，产品经液相色谱测定，五味子甲素含量达到99.5%，其余杂质均小于0.1%。
【权利要求】
1.一种制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:该方法具体步骤如下: (1)五味子甲素的提取:将五味子药材粉碎至60-80目，60-100%乙醇回流提取1-2次，每次1-2小时，合并提取液，提取液减压浓缩去除乙醇，加石油醚萃取，萃取相减压浓缩至干; (2)层析分离:将层析硅胶装入层析柱中，将步骤(I)样品用流动相溶解后上样，然后用流动相洗脱，洗脱后含五味子甲素部分合并蒸发至干； (3)结晶与重结晶:将层析后样品用乙醇溶解，再加入适量正己烷进行析晶，室温放置过夜得到结晶，结晶产品经过过滤后再减压烘干，得五味子甲素纯品；按照上述方法进行重结晶，获得最终的高纯度五味子甲素产品。
2.按照权利要求1所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述步骤(2)层析柱为动态轴向压缩柱，径高比为1:1?10。
3.按照权利要求1所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述步骤(2)样品与硅胶质量比为1:30?100，层析硅胶为200-800目。
4.按照权利要求1所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述步骤(2)流动相为一种或几种低极性溶剂与一种或几种高极性溶剂的混合溶液。
5.按照权利要求4所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述低级性溶剂为石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷中一种。
6.按照权利要求4所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述高极性溶剂为丙酮、乙酸乙酯、乙醇中的一种。
7.按照权利要求4所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述低极性溶剂与高极性溶剂体积比为100:0.1?100:5。
8.按照权利要求1所述制备高纯度五味子甲素的方法，其特征在于:所述步骤(3)高纯度五味子甲素产品中五味子甲素含量大于99%,单个杂质含量小于0.1%。
【文档编号】C07C43/21GK104230680SQ201310245419
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月19日 优先权日:2013年6月19日
【发明者】杨凌, 刘兴宝, 王子阳, 刘勇, 刘爽 申请人:中国科学院大连化学物理研究所