一种多肽及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽及其制备方法和用途。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，多肽的N端经乙酰化修饰；从N端起，多肽中第22位的X8主链与第25位的X9侧链进行酰胺键环化。本发明提供的多肽保留了Astressin B的生物学活性，其代谢稳定性更高，可有效预防和治疗脱发；该多肽的制备方法具有生产成本低、收率高的优点。
【专利说明】一种多肽及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 脱发是指头发脱落的现象，包括生理性脱发和病理性脱发。生理性脱发是指处于 退行期及休止期的毛发脱落的现象，由于进入退行期与新进入生长期的毛发不断处于动态 平衡，故能维持正常数量的头发。病理性脱发是指头发异常或过度的脱落，主要原因是人 体血液内的热毒排不出来，从而使人体出现某些病症，表现在头发上就是毛囊萎缩，头发脱 落，易断，油多无弹性，较为严重的情况是普脱、全脱。按发病机制不同，病理性脱发主要分 为神经性脱发、内分泌脱发、营养性脱发、物理性脱发、化学性脱发、感染性脱发、症状性脱 发、先天性脱发、免疫性脱发、季节性脱发等。脱发会影响患者的形象，进而影响到人际关系 和心理健康，给患者带来极大的痛苦。
[0003] 目前，治疗脱发的药物主要有米诺地尔、非那雄胺等，但这两种药物均会引发严重 的不良反应。其中，米诺地尔用于内服可起降血压的作用，如果外部大剂量使用，该药经皮 肤吸收渗透到体内，易导致头痛、低血压；长期内服非那雄胺片治疗脱发可能会导致的副作 用包括：男性胸部增大，乳头发育，男性阳痿，阴茎红肿，阴囊疼痛，较严重的是可能导致永 久性的内生殖器官突变，影响精子质量，最终导致胎儿发育畸形，部分人长期服用后会产生 抑郁症等副作用。因此，开发新型、安全的治疗脱发的药物依然是目前药学研究的热点。
[0004] Astressin B是新近发现的可预防和治疗脱发的多肽类药物，分子式为 C199H298N52049，分子量为 3962.65，其结构如式I所示，其中，从N端起第22位的Glu和第25 位的Lys通过侧链进行酰胺键环化。
[0005] Ac-Asp1-Leu2-Thr3-D-Phe4-His 5-Leu6-Leu7-Arg8-Glu9-Val 10-Leu11-Glu12-Nle13-Al a 14-Arg15-Ala16-Glu17-Gln 18-Gml19-Ala20-Gln21-cyclo (Glu22-Ala23-His24-Lys25) -Asn26-Arg27-Lys28-Leu29-Nle 30-Glu31-Cml32-Ile33-NH2
[0006] 式 I
[0007] 在Astressin B的合成过程中，一般采用Fmoc固相合成策略进行合成。Astressin B中存在Cml残基，在合成过程中用到的氨基酸残基原料为Fmoc-Cml-OH，它的市场价格较 为昂贵，且在偶联过程中存在偶联困难的情况，导致Astressin B的收率偏低；从N端起 Astressin B的第22位氨基酸为Glu，该Glu和25位的Lys通过侧链进行酰胺键环化，在 固相合成过程中用到的氨基酸残基原料为Fmoc-Glu (0A11)-0H，它的市场价格也较昂贵。基 于这两点原因，使得Astressin B的生产成本高，且收率较低。因此，对于生产成本低、收率 高的可预防和治疗脱发的多肽类药物仍有需求。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供了一种多肽及其制备方法和用途。该多肽在保留了 Astressin B的生物学活性的同时，其代谢稳定性更高，可有效预防和治疗脱发；该多肽的 制备方法具有生产成本低、收率高的优点。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示，具体为：
[0011] Asp-Leu-Thr-X^His^-Leu-Arg-Xg-Val-Leu-X^Xg-Ala-Arg-Ala-Xg-Gln-Xy-Ala _Gln_X8_Ala_His _X9_X10_Arg_Lys _Leu_Xn_Glu_X 7_Ile ;
[0012] 其中，X7 为 N_Me_Leu ;
[0013] X8 为 γ-Glu 或 β-Asp ;
[0014] 父丨为 D-Phe 或 Phe ;
[0015] X2 为 lie 或 Leu;
[0016] X3 为 Asp 或 Glu;
[0017] X4 为 Asp 或 Glu;
[0018] X5Slle*Nle;
[0019] X6 为 Asp 或 Glu;
[0020] X9 为 Orn 或 Lys ;
[0021] Xi。为 Gin 或 Asn;
[0022] XnSlle*Nle;
[0023] 多肽的N端经乙酰化修饰；
[0024] 从N端起，多肽中第22位的X8主链与第25位的X9侧链进行酰胺键环化。
[0025] 在本发明提供的一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -Glu，Xi为D-Phe，X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示。
[0026] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -Glu，Xi为Phe，X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸 序列如SEQ ID NO :3所示。
[0027] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 lie, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0028] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 Leu, X3 为 Asp, X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0029] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Asp, X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :6所示。
[0030] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 lie, X6 为 Glu，X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :7所示。
[0031] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y-GluJ为D-Phe， X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Asp, X9 为 Lys, X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0032] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为β -Aspji为D-Phe， X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1(l 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :9所示。
[0033] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Orn，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :10所示。
[0034] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Gln，Xn 为 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :11所示。
[0035] 在本发明提供的另一些实施例中，多肽的氨基酸序列中X8为Y -GluJ为D-Phe， X2 为 Leu, X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1(l 为 Asn，Xn 为 lie,其氨基 酸序列如SEQ ID NO :12所示。
[0036] 本发明还提供了一种本发明提供的多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0037] 步骤A :取lie与树脂偶联，得到lie-树脂；
[0038] 步骤B :取lie-树脂经逐步偶联，得到多肽片段-树脂；
[0039] 步骤C :多肽片段-树脂的N端经乙酰化修饰；
[0040] 步骤D:脱除从N端起第22位和第25位氨基酸残基的保护基，经环化、裂解、纯化、 冻干，即得；
[0041] 从N端起，多肽第22位氨基酸原料采用Fmoc-Asp-〇A11或Fmoc-Glu-〇A11 ;
[0042] 多肽片段-树脂中的多肽的序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0043] 作为优选，步骤C中乙酰化修饰采用的试剂为醋酸酐和DIEA的混合物。
[0044] 作为优选，步骤C中乙酰化修饰采用的试剂醋酸酐与DIEA的摩尔比为1: 2。
[0045] 作为优选，步骤D中脱除采用的试剂为苯基硅烷和Pd(PPh3)4的混合物。
[0046] 作为优选，步骤D中环化采用的试剂为PyBOP、HOBt和DIEA的混合物。
[0047] 作为优选，步骤D中环化采用的试剂中PyBOP、HOBt与DIEA的摩尔比为5:6:10。
[0048] 作为优选，步骤D中裂解采用的试剂为TFA。
[0049] 本发明还提供了本发明提供的多肽在制备防治脱发药物中的应用。
[0050] 本发明还提供了一种药物制剂，由本发明提供的多肽和药学上可接受的辅料组 成。
[0051] 作为优选，药物制剂的剂型为粉针剂、注射液、微球、微囊、脂质体、微乳、片剂、丸 齐U、胶囊剂、颗粒剂或散剂。
[0052] 本发明提供了一种多肽及其制备方法和用途。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0 : 1 所不，具体为：Asp-Leu-Thr-XfHis-^-Leu-Arg-Xs-Val-Leu-^-Xs-Ala-Arg-Ala-Xg-Gln -Xy-Ala-Gln-Xg-Ala-His-Xg-Xid-Arg-Lys-Leu-Xn-Glu-Xy-Ile ;其中，X7 为 N_Me_Leu ;X8 为 Y -Glu 或 β -Asp % 为 D-Phe 或 Phe ;X2 为 lie 或 Leu ;X3 为 Asp 或 Glu ;X4 为 Asp 或 Glu ;X5 为 lie 或 Nle ;X6 为 Asp 或 Glu ;X9S〇rn 或 Lys ;X1(I 为 Gin 或 Asn ;XnS lie 或 Nle ;多肽的 N端经乙酰化修饰；从N端起，多肽中第22位的&主链与第25位的&侧链进行酰胺键环化。 通过在体外对细胞内cAMP活性的影响研究可知，Astressin B和本发明提供的多肽均可剂 量依赖式地增加 PC-12细胞内cAMP含量，表明本发明提供的多肽保留了 Astressin B的生 物学活性；通过对多肽的代谢稳定性研究可知，本发明提供的多肽的半衰期要比Astressin B时间更长，表明其代谢稳定性更高；通过药效研究可知，处于较高的压力状态下的小鼠分 别注射本发明提供的多肽和Astressin B12周后，试验小鼠脱发面积均只占整个背部面积 的20%左右，而仅注射生理盐水的小鼠对照组几乎整个背部毛发全部脱光，表明本发明提 供的多肽可有效预防脱发，且与Astressin B的预防脱发效果基本一样；通过对脱发小鼠 的药效研究可知，毛发脱光的小鼠在注射本发明提供的多肽12周后，毛发的生长率为75% 左右，单纯注射生理盐水的小鼠毛发的生长率仍旧维持在5%左右，注射Astressin B的小 鼠毛发的生长率为70%左右，结果表明本发明提供的多肽可有效治疗脱发，且治疗脱发的 效果与Astressin B治疗脱发的效果基本一致或略好一些；本发明提供的多肽的氨基酸序 列中，采用N-Me-Leu取代Astressin B肽序中的Cml，采用γ-Glu或β-Asp取代Astressin B肽序中成环的Glu，可降低生产成本，提高产品的收率。由此可见，本发明提供的多肽保留 了 Astressin B的生物学活性，其代谢稳定性更高，可有效预防和治疗脱发；该多肽的制备 方法具有生产成本低、收率高的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 图1示实施例1制得的多肽粗品的HPLC图谱；
[0054] 图2示实施例1制得的多肽精品的HPLC图谱；
[0055] 图3示实施例1制得的多肽精品的质谱图；
[0056] 图4示实施例12提供的Astressin B和实施例1制得的多肽对细胞内cAMP活性 的影响；其中，线1示Astressin B对细胞内cAMP活性的影响；线2示实施例1制得的多肽 对细胞内cAMP活性的影响。
【具体实施方式】
[0057] 本发明公开了一种多肽及其制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和 应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0058] 说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
[0059] 缩写及英文 含义
[0060] Alloc 烯丙氧羰基
[0061] All 烯丙基
[0062] Cml C- α -甲基-亮氨酸
[0063] N-Me-Leu N-甲基亮氨酸
[0064] Biotin 生物素
[0065] DIC 二异丙基碳二亚胺
[0066] DIEA 二异丙基乙胺
[0067] DMF N, N-二甲基甲酰胺
[0068] DCM 二氯甲烷
[0069] EDTA 乙二胺四乙酸
[0070] Fmoc 9_芴甲氧羰基
[0071] HBTU 0-苯并三唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲鎗六氟磷
[0072] 酸盐
[0073] HOBt 1-羟基苯并三唑
[0074] mPEG 聚乙二醇单甲醚
[0075] mPEG-NH2 氨基聚乙二醇单甲醚
[0076] Pd (PPh3) 4 四三苯基膦钯
[0077] PhSiH3 苯硅烷
[0078] PyBOP (苯并三唑_1_氧）三吡咯烷子基磷鎗六氟磷
[0079] 酸盐
[0080] TFA 三氟乙酸
[0081] 本发明提供的多肽及其制备方法和用途中所用原料、辅料和试剂均可由市场购 得。
[0082] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0083] 实施例1多肽的制备
[0084] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0085] 称取Rink Amide树脂25g (lOmmol)，加入到固相反应柱，用DMF洗漆2?3次， 用DMF溶胀30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100 mL，脱除Fmoc保护基20分 钟，用茚三酮方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0086] 称取Fmoc-Ile-〇H 10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1? 3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0087] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0088] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0089] 加入15m mol的醋酸酐和20m mol的DIEA，完成N-端的乙酰化。
[0090] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烧，反应5分钟，加入2mmolPd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0091] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0092] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0093] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :2所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量，其HPLC图谱如图1所示；检测结果为：多肽粗品的纯度 为78%，收率为98. 6%，含量为69. 5%。
[0094] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方法 检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列，其HPLC图谱如图2所示，其质谱图如 图3所示。检测结果为：多肽精品的纯度为96. 8%，总收率为64. 5%，含量为93. 7%，质谱的 检测结果为3962. 058 (目标分子量为3962. 65)。
[0095] 实施例2多肽的制备
[0096] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0097] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0098] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0099] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0100] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-〇H。
[0101] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0102] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0103] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0104] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0105] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :3所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为76. 5% ;收率为99. 7% ; 含量为65. 5%。
[0106] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为98. 8%，总收率为62. 5%，含量为90. 6%，质谱的检测结果为3963. 051 (目标分子量为 3962. 65)。
[0107] 实施例3多肽的制备
[0108] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0109] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0110] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0111] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0112] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0113] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0114] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0115] 分子内醜胺键环化，加入 50mmol PyBOP，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6 小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0116] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0117] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :4所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为72. 5% ;收率为96. 7% ; 含量为60. 3%。
[0118] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为96. 9%，总收率为61. 5%，含量为88. 4%，质谱的检测结果为3962. 854 (目标分子量为 3962. 65)。
[0119] 实施例4多肽的制备
[0120] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0121] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0122] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0123] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0124] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Asp (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0125] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0126] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0127] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0128] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0129] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :5所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为77. 2% ;收率为96. 7% ; 含量为59. 6%。
[0130] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为96. 8%，总收率为59. 4%，含量为88. 9%，质谱的检测结果为3949. 135 (目标分子量为 3948.62)。
[0131] 实施例5多肽的制备
[0132] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成多肽，其操作步 骤为：
[0133] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0134] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0135] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0136] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、 Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH。
[0137] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙酰化。
[0138] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0139] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0140] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0141] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :6所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为80. 3%，收率为94. 7%， 含量为68. 5%。
[0142] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为97. 8%，总收率为66. 5%，含量为93. 7%，质谱的检测结果为3949. 209 (目标分子量为 3948.62)。
[0143] 实施例6多肽的制备
[0144] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0145] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0146] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0147] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0148] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Asn (Trt)-〇H、Fmoc-Lys (Alloc)-〇H、Fmoc-His (Trt)-〇H、 Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln (Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-OH、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH。
[0149] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0150] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0151] 分子内醜胺键环化，加入 50mmol PyBOP，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6 小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0152] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0153] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :7所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为77. 5%，收率为96. 7%， 含量为64. 8%。
[0154] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为96. 9%，总收率为59. 8%，含量为86. 4%，质谱的检测结果为3962. 817 (目标分子量为 3962. 65)。
[0155] 实施例7多肽的制备
[0156] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成多肽，其操作步 骤为：
[0157] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0158] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0159] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0160] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H， Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0161] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0162] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0163] 分子内酰胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol H0Bt，100mmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0164] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0165] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :8所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为68. 8%，收率为99. 2%， 含量为56. 5%。
[0166] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为97. 2%，总收率为58. 1%，含量为91. 8%，质谱的检测结果为3948. 906 (目标分子量为 3948.62)。
[0167] 实施例8多肽的制备
[0168] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0169] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0170] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0171] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0172] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp-〇A11、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc_Leu-〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0173] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙酰化。
[0174] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0175] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0176] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0177] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :9所 示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为71. 8%，收率为96. 3%， 含量为64. 3%。
[0178] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为96. 9%，总收率为64. 1%，含量为89. 7%，质谱的检测结果为3949. 005 (目标分子量为 3948.62) 。
[0179] 实施例9多肽的制备
[0180] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0181] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0182] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0183] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0184] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-〇rn (Alloc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H， Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0185] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0186] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0187] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0188] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0189] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 : 10所示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为72. 3%，收率为 97. 3%，含量为 65. 7%。
[0190] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为98. 9%，总收率为67. 4%，含量为92. 1%，质谱的检测结果为3949. 364 (目标分子量为 3948.62) 。
[0191] 实施例10多肽的制备
[0192] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0193] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0194] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0195] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0196] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Gln (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0197] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙酰化。
[0198] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0199] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0200] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0201] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 : 11所示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为79. 1%，收率为 96. 7%，含量为 59. 5%。
[0202] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为97. 8%，总收率为59. 5%，含量为89. 2%，质谱的检测结果为3976. 950 (目标分子量为 3976.68)。
[0203] 实施例11多肽的制备
[0204] 用Rink Amide树脂类型的固相载体，选用Fmoc保护氨基策略合成，其操作步骤 为：
[0205] 称取Rink Amide树脂25g，加入到固相反应柱，用DMF洗涤2?3次，用DMF溶胀 30分钟。用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0206] 称取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA为激活剂，活化3?5分钟，加入反应柱反应1?3 小时，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 树脂。
[0207] 用体积比为1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脱除Fmoc保护基20分钟，用茚三酮 方法检测Fmoc是否脱除完全，树脂有颜色，表明Fmoc已脱除。
[0208] 按照上述偶联Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide树脂上依次偶联 Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0209] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙酰化。
[0210] 脱除赖氨酸Alloc侧链保护基和谷氨酸主链上的0A11保护基，具体操作为：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烧，反应5分钟，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反应120分钟，用茚三 酮方法检测，树脂有颜色，表明Alloc已脱除。
[0211] 分子内醜胺键环化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶联6小时， 收缩，抽干，得到肽树脂。
[0212] 将肽树脂用TFA裂解，反应1?5小时，将多肽从树脂上裂解下来，同时脱除侧链 保护基。
[0213] 对裂解下来的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 : 12所示，用HPLC方法检测其纯度和含量。检测结果为：多肽粗品的纯度为73. 7%，收率为 98. 2%，含量为 64. 1%。
[0214] 用C18色谱柱，用常规的流动相洗脱，收集组分，冻干得到多肽精品，用HPLC方 法检测其纯度和含量，用质谱和Edman降解分析其序列。检测结果为：多肽精品的纯度 为96. 9%，总收率为63. 8%，含量为88. 2%，质谱的检测结果为3963. 333 (目标分子量为 3962. 65)。
[0215] 实施例12多肽在体外对细胞内cAMP活性的影响
[0216] 将PC-12细胞（肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）培养48小时，弃去培养液，并用缓冲液清 洗2?3次，加入lmL含有1%牛血清蛋白的缓冲液，将Astressin B和实施例1提供的多 肽分别与浓度为100 μ Μ的IBMX共同孵育半小时，弃去培养基，加入盐酸终止酶对cAMP的 降解。收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按cAMP酶联免疫试剂 盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450nm 波长下测定光吸收值，用该光吸收值在标准曲线上读出对应的cAMP浓度，最后计算样品中 cAMP浓度，结果如图4所示。
[0217] 由上述试验结果可知，Astressin B呈剂量依赖式地增加 PC-12细胞内cAMP含量， 增加 cAMP 最大值（Emax)为 161·2±7·2ρπι〇1/10〇μ8 (蛋白），EC5。值为 1·7Χ10_9Μ;实施例 1 提供的多肽在体外对PC-12细胞内cAMP的影响与Astressin Β非常相似，其增加 cAMP最 大值（Emax)为152.4±7.8ρπι〇1/10〇μ8 (蛋白），EC5Q值为2. 1X10_9M，结果表明实施例1提 供的多肽保留了 Astressin B的生物学活性。
[0218] 取实施例2?11制得的多肽进行细胞内cAMP活性研究，结果显示，实施例2?11 制得的多肽同样可增加 PC-12细胞内cAMP含量，且呈剂量依赖性，表明实施例2?11制得 的多肽也保留了 Astressin B的生物学活性。
[0219] 实施例13多肽的代谢稳定性研究
[0220] 取Astressin B和实施例1制得的多肽，分别溶解在辛醇/水（1:1, v/v)的混合 溶剂中（0. 5mg/ml)，然后加入到25%大鼠血清溶液中，在37°C条件下培养，每隔30min取样 进行HPLC分析，测定Astressin B和实施例1制得的多肽完全降解的时间。
[0221] 结果显不，Astressin B在2. 5h后已经完全降解，而实施例1制得的多肽在3. 5h 后才完全降解。该结果表明，实施例1制得的多肽的半衰期要比Astressin B时间更长，其 代谢稳定性更高。
[0222] 取实施例2?11制得的多肽进行代谢稳定性研究，结果显示，实施例2?11制得 的多肽的半衰期均比Astressin B时间长，表明其代谢稳定性高。
[0223] 实施例14多肽预防脱发的效果研究
[0224] 试验动物为雌性昆明小鼠(体重30?38g)，实验前小鼠不禁食禁水，随机分为3 组，每组6只。然后分在第0、1、2、4、6、8、10、12周，单次通过腹腔注射等体积的生理盐水 (10mL/kg)、Astressin B (5mg/kg)和实施例 1 制得的多肽（5mg/kg)。注射后，每 30min 对 鼠群进行一次强光照射使得鼠群经常处于惊吓状态下生活。然后每周观察小鼠背部毛发的 变化。
[0225] 实验的结果显示，在较高的压力状态(惊吓状态）下，对照组中单纯注射生理盐水 的小鼠群在2周后就开始发生脱发现象，4周后每只小鼠的平均脱发面积约占整个背部面 积的20%左右，而注射Astressin B和实施例1制得的多肽的小鼠在4周内并没有明显的 脱发现象发生。12周后，仅注射生理盐水的小鼠对照组几乎整个背部毛发全部脱光，而注射 Astressin B和实施例1制得的多肽的试验组脱发面积均只占整个背部面积的20%左右。 上述试验结果表明，Astressin B和实施例1制得的多肽均有一定的预防脱发效果，实施例 1制得的多肽和Astressin B的预防脱发效果基本一样。
[0226] 取实施例2?11制得的多肽进行预防脱发效果研究，结果显示，实施例2?11制 得的多肽均有一定的预防脱发效果，且与Astressin B的预防脱发效果基本一样。
[0227] 实施例15多肽治疗脱发的效果研究
[0228] 取4?8周大小的雌性昆明小鼠（体重25?32g)，实验前通过光照、噪音等外界 压力刺激得到小鼠的毛发基本脱光。然后实验前小鼠不禁食禁水，随机分为3组，每组6 只。然后分在第〇、1、2、4、6、8、10、12周，单次通过腹腔注射等体积的生理盐水（10mL/kg)、 Astressin B (5mg/kg)和实施例1制得的多肽（5mg/kg)。注射后，保持小鼠在正常环境小 生活，每天定期供食供水。然后每周观察小鼠背部毛发的变化。
[0229] 实验的结果显示，1周后，注射有实施例1制得的多肽的小鼠均有少量毛发长出， 其余两个对照组均无明显变化；2周后，注射实施例1制得的多肽的小鼠背部已经约长出2% 左右的毛发，而注射有Astressin B的小鼠也有少量毛发长出，单纯注射生理盐水的小鼠背 后无任何毛发长出；8周后，单纯开始注射生理盐水的小鼠有5%左右的毛发长出，而注射实 施例1制得的多肽的小鼠毛发的生长率约占整个背部面积的60%，注射Astressin B的小 鼠的毛发生长率约占整个背部面积的50% ;12周后，单纯注射生理盐水的小鼠毛发的生长 率仍旧维持在5%左右，而注射Astressin B的小鼠毛发的生长率为70%左右，注射实施例 1制得的多肽的小鼠毛发的生长率为75%左右。结果表明，Astressin B和实施例1制得的 多肽均有一定的治疗脱发效果，同时实施例1制得的多肽治疗脱发的效果比Astressin B 的治疗脱发的效果略好一些。
[0230] 取实施例2?11制得的多肽进行治疗脱发效果研究，结果显示，实施例2?11制 得的多肽均有一定的治疗脱发效果，与Astressin B的预防脱发效果相比，效果基本一致或 略好一些。
[0231] 实施例16粉针剂的制备
[0232] 取实施例1制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得粉针剂。
[0233] 实施例17注射液的制备
[0234] 取实施例2制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得注射液。
[0235] 实施例18微球的制备
[0236] 取实施例3制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得微球。
[0237] 实施例19微囊的制备
[0238] 取实施例4制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得微囊。
[0239] 实施例20脂质体的制备
[0240] 取实施例5制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得脂质体。
[0241] 实施例21微乳的制备
[0242] 取实施例6制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得微乳。
[0243] 实施例22片剂的制备
[0244] 取实施例7制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得片剂。
[0245] 实施例23丸剂的制备
[0246] 取实施例8制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得丸剂。
[0247] 实施例24胶囊剂的制备
[0248] 取实施例9制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得胶囊剂。
[0249] 实施例25颗粒剂的制备
[0250] 取实施例10制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得颗粒剂。
[0251] 实施例26散剂的制备
[0252] 取实施例11制备的多肽与常规辅料混合，按照常规方法制备获得散剂。
[0253] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，具体为： Asp-Leu-Thr-X^His^-Leu-Arg-Xg-Val-Leu-X^Xg-Ala-Arg-Ala-Xg-Gln-Xy-Ala-Gln _X8_Ala_His_X 9_X10_Arg_Lys _Leu_Xn_Glu_X 7_Ile ; 其中，X7 为 N-Me-Leu ; X8 为 Y -Glu 或 β -Asp ; Xi 为 D-Phe 或 Phe ; X2 为 lie 或 Leu ; X3 为 Asp 或 Glu ; X4 为 Asp 或 Glu ; X5 为 lie 或 Nle ; X6 为 Asp 或 Glu ; X9 为 Orn 或 Lys ; X10 为 Gin 或 Asn ; Xn 为 lie 或 Nle ; 所述多肽的N端经乙酰化修饰； 从N端起，所述多肽中第22位的X8主链与第25位的X9侧链进行酰胺键环化。
2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Gli^Xi 为 Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle， 其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所不。
4. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 lie，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
5. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Asp，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示。
6. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Asp，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示。
7. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 lie，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示。
8. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Asp，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
9. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为β-Asp， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示。
10. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Orn，X1Q 为 Asn，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :10所示。
11. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Gln，Xn 为 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :11所示。
12. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&为Y-Glu， Xi 为 D-Phe，X2 为 Leu，X3 为 Glu，X4 为 Glu，X5 为 Nle，X6 为 Glu，X9 为 Lys，X1Q 为 Asn，Xn 为 Ile，其氨基酸序列如SEQ ID NO :12所示。
13. -种如权利要求1至12中任一项所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步 骤： 步骤A :取lie与树脂偶联，得到lie-树脂； 步骤B :取所述lie-树脂经逐步偶联，得到多肽片段-树脂； 步骤C :所述多肽片段-树脂的N端经乙酰化修饰； 步骤D :脱除从N端起第22位和第25位氨基酸残基的保护基，经环化、裂解、纯化、冻 干，即得； 从N端起，所述多肽第22位氨基酸原料采用Fmoc-Asp-OAll或Fmoc-Glu-OAll ; 所述多肽片段-树脂中的多肽的序列如SEQ ID NO :1所示。
14. 根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤C中所述乙酰化修饰采用的试 剂为醋酸酐和DIEA的混合物。
15. 根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤D中所述脱除采用的试剂为苯 基硅烷和Pd (PPh3) 4的混合物。
16. 根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤D中所述环化采用的试剂为 PyBOP、HOBt和DIEA的混合物。
17. 根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤D中所述裂解采用的试剂为 TFA。
18. 如权利要求1至12中任一项所述的多肽在制备防治脱发药物中的应用。
19. 一种药物制剂，其特征在于，由权利要求1至12中任一项所述的多肽和药学上可接 受的辅料组成。
20. 根据权利要求19所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为粉针剂、注 射液、微球、微囊、脂质体、微乳、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂。
【文档编号】C07K1/04GK104231059SQ201310243117
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月19日 优先权日:2013年6月19日
【发明者】戴政清, 刘剑, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司