含sars病毒rbd抗原的重组蛋白及展示rbd蛋白的杆状病毒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白及展示RBD蛋白的杆状病毒，该重组蛋白SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒是由SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组，然后将重组杆状病毒基因组转染家蚕细胞，在其内包装得到的重组杆状病毒。重组杆状病毒将SARS病毒的RBD蛋白与家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64融合，实现RBD蛋白在病毒衣壳上的展示，具有良好的免疫原性。
【专利说明】含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白及展示RBD蛋白的杆状病 毒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及一种含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白， 及展示RBD蛋白的重组杆状病毒。
【背景技术】
[0002] 严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndromes)，又称传染性非典 型肺炎，简称SARS，是一种因感染SARS冠状病毒引起的新的呼吸系统传染性疾病。主要通 过近距离空气飞沫传播，以发热、头痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰等为主要临床表现，严重 者可出现呼吸窘迫。本病具有较强的传染性，在家庭和医院有显著的聚集现象。首发病例， 也是全球首例，于2002年11月出现在广东佛山，并迅速形成流行态势。2002年11月至 2003年8月5日，29个国家报告临床诊断病例共8422例，死亡916例。报告病例的平均死 亡率为9. 3%。该病毒很可能来源于动物，由于外界环境的改变和病毒适应性的增加而跨越 种系屏障传染给人类，并实现了人与人之间的传播。
[0003] 虽然SARS已被控制，但SARS病毒不大可能在短期内被"消灭"或自动消失，SARS 在人群中再次出现的可能性很大。再次发生SARS疫情的时间，主要与病毒侵袭人体的时间 有关，不一定表现为冬春高发。动物携带病毒的季节性分布、人接触感染动物的机会等都将 影响再次发生疫情的时间。动物仍然是病毒的可能来源，人群对SARS病毒仍然普遍易感， 其疫苗仍是目前的研究重点。
[0004] 目前SARS疫苗包括治疗性疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，已有一定进 展，但也存在相应的问题，具体见下表。
[0005] 表 1
【权利要求】
1. 一种含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白SP-RBD-TM，其特征在于，该蛋白是由SARS病 毒的RBD蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋 白GP64的跨膜域TM构成。
2. 根据权利要求1所述的含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白SP-RBD-TM，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 权利要求2所述的含SARS病毒RBD抗原的重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因，其特征 在于，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
4. 一种表面展不SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是由权利要 求3所述重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid 的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转 染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒。
5. 根据权利要求4所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒，其特征 在于，所述供体质粒为pFastBacDual，重组蛋白SP-RBD-TM的编码基因插入到供体质粒 pFastBacDual的pPolh启动子下，构建成重组转座质粒后再与穿梭载体Bacmid的基因组进 行同源重组。
6. 根据权利要求5所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒，其特征在于， 所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。
7. 权利要求4飞任一所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒的制备方法， 其特征在于，步骤如下： (1) PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因、SARS病毒的RBD蛋 白的编码基因和杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因； (2) 通过重叠 PCR扩增的方法拼接步骤（1)获得的三种基因序列，得到重组蛋白 SP-RBD-TM的编码基因，再将编码基因片段连接到载体pFastBacDual的pPolh启动子下，构 建成重组转座质粒； (3) 重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞， 进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝 白斑筛选，避光培养4(T48h后挑取白斑，白斑继续培养24?48h后抽提重组杆状病毒基因组 DNA进行PCR鉴定； (4) 取步骤（3)鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕细胞， 发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示 SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒； 所述PCR鉴定使用如SEQIDN0:3、SEQIDN0:4和SEQIDN0:9所示的引物序列。
8. 根据权利要求7所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒的制备方法，其 特征在于，步骤（1)中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷 酸序列如SEQ ID N0:4?5所示；扩增SARS病毒RBD蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列 如SEQ ID N0:6?7所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物 核苷酸序列如SEQ ID N0:8?9所示。
9. 权利要求4~6任一所述的表面展不SARS抗原RBD蛋白的重组杆状病毒在制备SARS 疫苗中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK104292339SQ201310301896
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】张耀洲, 闫晶晶, 舒特俊, 陈剑清, 盖其静 申请人:特菲(天津)生物医药科技有限公司