表达新型defensin抗菌肽的DNA的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种表达新型defensin抗菌肽的DNA，序列如SEQ：1。该DNA表达的抗菌肽及其衍生物可用于水产病害防治，具有广泛用途。
【专利说明】表达新型defens in抗菌肽的DNA
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及表达抗菌肽的DNA 。
【背景技术】
[0002]目前，由于过度追求经济效益，高密度、集约化的珍珠养殖模式快速发展，使得养殖病害日趋严重，各种病害频繁爆发，已成为淡水珍珠养殖业健康可持续发展的主要瓶颈。各类农药、抗生素盲目无序和频繁使用，不仅对病害的预防与治疗没有起到明显作用，而且，由于这些药物的大量使用严重破坏了自然生态环境，药品的残留已经直接威胁到人类的健康，因此，发现和寻找通用性强、防治效果好、广谱无污染的新型病害预防和治疗药物，成为人们亟待解决的重要课题之一。抗菌肽(Defensin)又称抗微生物肽，是参与动物先天性免疫防御功能的重要组分，具有广谱杀菌、抑病毒、抑真菌、抑寄生虫等作用的一类膜活性多肽，不易引进微生物的耐药性，成为抗生素药物的理想替代品。抗菌肽作用机理非常独特，研究表明，抗菌肽作用于细菌细胞膜，使细胞膜发生穿孔，破坏膜的完整性，使细菌因不能保证正常渗透压而死亡(Park, Y., Biochim Biophys Acta.2003, 1645(2):172-182)。
[0003]Defensin是贝类抗菌肽中的一大类群，其典型特征是分子内具有6个或8个保守的半胱氨酸残基组成的二硫键，二级结构包括一个α螺旋和两个反向平行的β折叠，分子量约 3-5 kDa。在紫贻贝(M.galloprovincialis)、太平洋牡贩(Crassostrea gigas)、海湾扇贝(Argopecten irradians)和菲律宾給仔(Ruditapes phiIippinarum)等海水贝类中都有研究过Defensins。研究表明，病原菌刺激贻贝(Mytilus.galloprovincialis)后可增强defensin在血淋巴中的转录表达。从牡贩(Crassostrea gigas)的觸组织中分离纯化到defensin蛋白对革兰氏阳性和阴性菌均具有较强抑菌活性(Seo, et al., BiochemBiophys Res Commun, 2005, 338 (4): 1998-2004)。此外，已证明无论是化学合成或体外重组表达的一些海水贝类defensins均能表现出较强的杀菌功效(Adhya, et al., CompBiochem Physiol B.2012, 161 (1):25-31; Gueguen, et al., J Biol Chem, 2006,281(1): 313-23; Xu and Faisal, Molecular Immunology, 2010, 47: 2138-2147;Zhao, et al., Molecular Immunology, 2007, 44 (4): 360-368; Zhao, et al., PLoSOne, 2010, 5(10): el3480)。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种表达新型Defensin抗菌肽的DNA,所表达出的新型Defensin抗菌肽具有良好的抗菌性能。
[0005]具体技术方案如下:
表达新型defensin抗菌肽的DNA,序列如SEQ:1所示。
[0006]所述DNA编码的新型defensin抗菌肽:(a)其氨基酸序列如SEQ: 2所示；或(b)将(a)中的序列经过一个或多个氨基酸的取代，缺失或添加具有抗菌肽功能的由(a)衍生的新型defensin抗菌肽。
[0007]本发明还涉及:
表达新型defensin抗菌肽的DNA的载体。
[0008]所述表达新型defensin抗菌肽的DNA的载体为pGEX-4T-l_defensin。
[0009]由于抗菌肽天然资源有限，鉴于化学合成肽类成本高，而基因工程方法大量生产抗菌肽的途径较为现实，并显示出良好应用前景。本发明主要是在一种淡水珍珠贝类鉴定发现了一种抗菌肽Defensin基因序列，并采用一种基因工程手段获得了其产物，抑菌实验分析证明其能够显示出较强抑菌活性。因此，我们有望通过较廉价大规模的基因工程重组方法获得大量的此类抗菌肽，将其应用在淡水珍珠养殖过程中既能有效地防治的各种疾病的发生，又可避免了滥用抗生素带来的日益严重的微生物对抗生素的耐药性问题，同时极大地降低了珍珠养殖过程中用于其病害防治的药物经济成本。
[0010]池蝶蛘可用于获取该分子的天然材料。从嗜水气单胞菌诱导池蝶蛘血细胞cDNA文库中，应用通用引物M13进行文库筛查，PCR扩增，测序，所得序列同源比对及蛋白三维建模等生物信息学分析鉴定为池蝶蛘抗菌肽Defensin基因。病原菌胁迫进一步表明其参与了池蝶蛘免疫防御反应，通过重组方法能够表达其重组蛋白分子(附图3)。该重组蛋白抑菌试验分析表明其具有较强的抑菌活性(附图4)。该产物可用于淡水珍珠蛘天然免疫防御机制的理论研究，也可作为病害治疗药物、饲料添加剂、免疫增强剂以及珍珠插核手术时用作抗感染药物等在生产方面进行应用。
[0011]与现有的各类农药、抗生素等药剂用于水产病害防控和治疗相比，本发明的积极效果是: (I)本发明充分利用了天然抗菌肽具有广谱杀菌、抑病毒、抑真菌等作用且不易引进微生物的耐药性等生物特征，在掌握该抗菌肽的基因序列和已证明其表现出较强抑菌作用的基础上，可应用基因工程技术对其进行大规模生产，成本低廉，可用于珍珠养殖及手术育珠过程中的各种病害防治，尤其是重组抗菌肽的在水产养殖中的应用不会产生任何水环境污染事件。
[0012](2)本发明充分利用了同为帆蛘属且均作为淡水育珠蛘源的池蝶蛘抗病力优于三角帆蛘的生物特征(徐毛喜，等。南昌大学学报(理科版)，2004，28 (3):262-269)，从池蝶蛘中鉴定到其抗菌肽defensin序列，且证明其重组蛋白表现出较强的抑菌活性，其产品可应用除池蝶蛘外的其他淡水珍珠蛘的病害防控。
[0013](3)本发明不同于已报道的池蝶蛘抗菌肽Defensin序列(Peng K，et al.,Aquaculture, 2012, 334-337:45 - 50)，两序列差异性比较如图 9:
因此，本发明作为用于淡水珍珠养殖或水产养殖病害治疗药物、饲料添加剂、免疫增强剂以及淡水珍珠插核手术时用作抗感染药物等，同源也可应用于淡水珍珠蛘天然免疫防御机制的理论研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1池蝶蛘基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。
[0015]图2池蝶蛘Defensin氨基酸序列同其他物种抗菌肽defensin同源比较
池蝶蛘，Hyriopsis schlegelii defensin (本发明)；牡贩，Crassostrea gigasdefensin: ACQ76287 ;給，phiIippinarum defensin:AFP50003 ;长角血蝶，Haemaphysalis longicornis defensin: ABW08117。
[0016]图3池蝶蛘中鉴定到抗菌肽Defensin同其他物种抗菌肽Defensin蛋白同源建模分析
池蝶蛘，Hyriopsis schlegelii, defensin (本发明)；牡贩，Crassostrea gigasdefensin: ACQ76287 ;給，phiIippinarum defensin:AFP50003 ;长角血蝶，Haemaphysalis longicornis defensin: ABW08117。
[0017]图4嗜水气单胞菌刺激后抗菌肽在池蝶蛘血淋巴中转录变化。
[0018]图5 PCR 扩增获得 Defensin-ORF 片段。
[0019]图6重组质粒pGEX-4T-l_defensin的双酶切验证。
[0020]图7池蝶蛘抗菌肽defensin重组蛋白的诱导表达。
[0021]M:Protein Marker 1:未诱导的宿主菌所表达的蛋白量2，3，4:分别表示宿主菌在2h、4h、6h诱导后所表达的蛋白量，箭头所指为目的蛋白。
[0022]图8抑菌效果图。
[0023]图9本发明序列与已报道现有序列对比。 【具体实施方式】
[0024]材料
池蝶蛘
池蝶蛘取自江西抚州市洪门水库开发公司池蝶蛘良种养殖基地，外壳完好，喷水有力；壳长为(107±6.5) mm。蛘置实验室水族箱充气水中暂养一周，水温为18 — 25°C。
[0025]菌株与载体。
[0026]嗜水气单胞菌购自中国工业微生物菌种保藏中心、大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌珠购自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司。pGEX-4t-l表达载体购自Amersham公司。
[0027]主要酶和试剂
Ex Taq酶(TaKaRa)、DNA快速回收试剂盒、质粒抽提试剂盒(QIAGEN)、限制性内切酶(TaKaRa)；T4 DNA连接酶、MMLV反转录试剂盒(Progmeg公司)、TRIZ0L Reagent (Invitrogen公司)均为进口原装试剂。其余试剂均为常规试剂，不再赘述。
[0028]实施例1
1.2.1 cDNA文库PCR筛查(注:基因工程应用生产重组蛋白则直接从1.2.4步骤开
始)
池蝶蛘血细胞cDNA文库为本实验室应用Creator? SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit (Clontech)已构建(谢凯，等。水生生物学报。2011,35 (5):783_789)。
[0029]本发明中，应用M13引物对文库菌液涂板后挑单克隆摇菌取菌液进行PCR大规模筛查，具体实施如下:取稀释后的文库菌液涂布平板，挑取单克隆利用菌液PCR检测插入片段的大小。PCR程序为94°C预变性5min; 94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 90s, 33个循环；72°C延伸7min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶跑电泳参照分子Marker鉴定大小、对选定一定大小的片段送上海生工测序。测序获得序列利用NCBI vecscreen和BLASTN
2.2.21+程序识别并去除测序结果中的载体序列。[0030]M13引物设计如下:
M13-F: 5， GTAAAACGACGGCCAGT3，；
M13-R: 5’ AACAGCTATGACCATG3’ ；
1.2.2池蝶蛘抗菌肽defensin基因序列确定及蛋白分析
利用NCBI的ORF Finder程序对去除载体序列的样品序列做开放阅读框分析，并翻译所得氨基酸序列在NCBI网上进行BLASTP比对鉴定其同源序列。运用ClustalW方法对序列对应蛋白与其他物种同源序列进行蛋白保守性分析，用Mega4.1软件NJ(NeighbourJoining)算法产生系统进化树。利用SWISS-MODEL(版本3.5)程序做同源建模分析。
【权利要求】
1.表达新型defensin抗菌肽的DNA,序列如SEQ:1所示。
2.权利要求1所述DNA编码的新型defensin抗菌肽:(a)其氨基酸序列如SEQ:2所示；或(b)将(a)中的序列经过一个或多个氨基酸的取代，缺失或添加具有抗菌肽功能的由(a)衍生的新型defensin抗菌肽。
3.包含权利要求1表达新型defensin抗菌肽的DNA的载体。
4.如权利要求3所述表达新型defensin抗菌肽的DNA的载体为pGEX-4T-l_defensin。
【文档编号】C07K14/435GK103642811SQ201310301542
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】彭扣, 洪一江, 王军花, 盛军庆 申请人:南昌大学