海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF及其制备方法
【专利摘要】海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF及其制备方法，涉及一种微生物来源的抗真菌蛋白。海洋桔青霉W1为CCTCC?NO：M2013205。从海洋桔青霉W1发酵液上清中分离纯化到一种抗真菌蛋白，命名为PcPAF，经鉴定所得质谱信息在NCBI?Genbank数据库中未匹配到结果；进而通过N端测序检测该蛋白N端的15个氨基酸，所得氨基酸序列在NCBI?Genbank数据库中的比对结果同源性很低，判断PcPAF为一种新的抗真菌蛋白。经N端测序确定其N端15个氨基酸为AGNRPDFPRRHHPGG。PcPAF对4株植物致病真菌绿色木霉等具有明显抑制作用。PcPAF在80℃下加热20min仍具有抗菌活性。
【专利说明】海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物来源的抗真菌蛋白，尤其是涉及一种海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF及其制备方法。
【背景技术】
[0002]一些由病毒、细菌和真菌影响所引起的农作物疾病，导致了农产品的亏损和质量安全问题。目前，植物疾病的防治主要依靠化学农药，但是农药的使用受到了严格的监管和控制。抗真菌蛋白则被看做是能够保护植物健康的新兴化合物，因为目前正需要不仅能保护植物，同时又符合新规定的新型农药。生物体能够通过核糖体或非核糖体合成并分泌多种抗真菌蛋白。以一些抗真菌蛋白为基础而设计的新合成物已经在转基因植物中表达，赋予了植物抵抗微生物病害的能力，或者通过转基因微生物分泌出能够作为商业生物农药的有效成分([l]Emilio Μ.(2007)Antimicrobial peptides and plant diseasecontrol[J].FEMS Microbiology Letters270(I):1-11)。
[0003]抗真菌蛋白几乎存在于所有生物中，包括细菌、真菌、昆虫、软体动物、植物和哺乳动物。由于环境中存在大量的致病真菌，许多生物已经进化出多种强有力的防御机制，其中包括合成一些小分子量的具有抗真菌活性的多肽和蛋白质。抗真菌蛋白是先天性免疫反应中的进化保守组件，并且是主要的效应分子。抗真菌蛋白参与生物体的组成抗性或者诱导抗性机制，使生物体能够有效地抵抗致病真菌的侵害。([2]Claude P.S.(2001)AntifungalProteins[J].Applied And Environment Microbiology67(7):2883 - 2894)?
[0004]真菌来源的抗真菌蛋白，目前报道的还比较少，包括从曲霉Aspergi I Iusgiganteus 分离到的抗真菌蛋白 AFP([3]Wnendt S, Ulbrich N, StahlU.(1994)Molecular cloning, sequence analysis and expression of the gene encoding anantifungal-protein from Aspe`rgillus giganteus[J].Current Genetics25:519-523),从产黄青霉Penicillium chrysogenums分离到的抗真菌蛋白PAF以及从黑曲霉Aspergillus niger 中分离到的抗真菌蛋白 Anafp ([4]Marx F，HaasH, Reindl M, etal.(1995)Cloning, structural organization and regulation of expression of thePenicillium chrysogenum paf gene encoding an abundantly secreted protein withantifungal activity[J].Gene167:167-171;[5]Geisen R.(2000)P.nalgiovense carriesa gene which is homologous to the paf gene of P.chrysogenum which codes for anantifungal peptide[J].1nternational Journal of Food Microbiology62:95-101; [6]Rodriguez-Mamn A, Acosta R, Liddell S, et al.(2010).Characterization of the novelantifungal protein PgAFP and the encoding gene of Penicillium chrysogenum[J].Peptides31:541-547;[7]Gun LD,Shin SY, Maeng CY,et al.(1999).1solation andcharacterization of a novel antifungal peptide from Aspergillus niger[J].Biochemical and Biophysical Research Communications263:646-651)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供海洋桔青霉(Penicillium citrinum) Wl。
[0006]本发明的目的之二在于提供一种海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF及其制备方法。
[0007]本发明的目的之三在于提供一种通过N端测序鉴定海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的部分氨基酸序列的方法，抗真菌蛋白PcPAF的N端15个氨基酸序列如下所示:AGNRPDFPRimHPGG。
[0008]本发明所述海洋桔青霉(Penicillium citrinum)Wl已于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013205，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。
[0009]所述海洋桔青霉(Penicillium citrinum) Wl是从中国大洋第21航次科学考查采集的西南印度洋深海沉积物样品中分离得到。将该菌株接种于YPTG液体或者固体培养基表面，在28 °C条件下培养，该菌株能够快速生长。该菌株在固体培养基上，菌落呈绿色，菌丝致密，与培养基连接紧密，产生的孢子较多，在培养基上产生黄绿色的色素，使背景呈黄绿色。
[0010]所述海洋桔青霉(Penicillium citrinum) Wl的ITS序列为:
[0011]I GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC
[0012]51 ATTACCGAGT GCGGGCCCCT CGGGGCCCAA CCTCCCACCC GTGTTGCCCG
[0013]101 AACCTATGTT GCCTCGGCGG GCCCCGCGCC CGCCGACGGC CCCCCTGAAC
[0014]151 GCTGTCTGAA GTTGCAGTCT GAGACCTATA ACGAAATTAG TTAAAACTTT
[0015]201 CAACAACGGA TCTCTTGGTT CCGGCATCGA TGAAGAACGC AGCGAAATGC
[0016]251 GATAACTAAT GTGAATTGCA GAATTCAGTG AATCATCGAG TCTTTGAACG
[0017]301 CACATTGCGC CCTCTGGTAT TCCGGAGGGC ATGCCTGTCC GAGCGTCATT
[0018]351 GCTGCCCTCA AGCCCGGCTT GTGTGTTGGG CCCCGTCCCC CCCGCCGGGG
[0019]401 GGACGGGCCC GAAAGGCAGC GGCGGCACCG CGTCCGGTCC TCGAGCGTAT
[0020]451 GGGGCTTCGT CACCCGCTCT AGTAGGCCCG GCCGGCGCCA GCCGACCCCC
[0021]501 AACCTTTAAT TATCTCAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG
[0022]552 AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGG。
[0023]所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF，表现为序列的新颖性，通过MALD1-T0F-T0F进行鉴定，所得质谱信息在美国国家医学图书馆国家生物技术信息中心(NCBI) Genbank数据库中未匹配到结果；进而通过N端测序检测蛋白N端的15个氨基酸，所得氨基酸序列在NCBI数据库中的比对结果同源性很低，说明该蛋白为一种新的抗真菌蛋白，其N端15个氨基酸序列为:AGNRPDFPRRHHPGG。
[0024]所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法,包括以下步骤:
[0025]1)从平板上挑取海洋桔青霉(Penicillium citrinum) Wl菌体接种于YPTG液体培养基进行发酵培养后，收集发酵液上清；
[0026]2)在步骤1)所收集到的发酵液上清中加入硫酸铵，配制成硫酸铵饱和的混合液，静置，使发酵液上清中的蛋白完全沉淀；
[0027]3)将步骤2)所得混合液进行离心，收集的沉淀用去离子水重新溶解，获得含盐的粗蛋白溶液；[0028]4)将步骤3)所得含盐的粗蛋白溶液转移到透析袋中进行透析，除去多余的盐离子，再通过离心除去溶液中的不溶性杂质，收集除盐后的粗蛋白溶液，分装后冻存；
[0029]5)将步骤4)所得结冻的粗蛋白溶液转移到冻干机中进行冻干，去除水相得到固体的粗蛋白，再用去离子水将粗蛋白溶解；
[0030]6)将步骤5)所得处理后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上进行第一步的分离纯化，根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，通过真菌拮抗实验追踪分离得到的活性组分，进行抗真菌活性检测，使用对该粗蛋白敏感的植物病原真菌作为敏感指示菌；
[0031]7)将步骤6)获得的具有抗真菌活性的非吸附组分继续在羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱上进行第二步分离纯化，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行离心超滤浓缩，通过真菌拮抗实验追踪分离出来的活性组分，同样采用滤纸片法，并使用对该粗蛋白敏感的植物病原真菌作为敏感指示菌，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度，确定活性组分为纯的单一蛋白；
[0032]8)通过15%SDS_PAGE 电泳在IOkDa附近得到单一条带,将凝胶上的单一条带切下，经过无菌去离子水洗涤后，通过MALD1-T0F-T0F进行鉴定，所得质谱信息在NCBI数据库中未匹配到结果；进而将单一的蛋白条带通过转膜处理转移到PVDF聚偏二氟乙烯膜上，通过N端测序鉴定蛋白N端的15个氨基酸，所得氨基酸序列在NCBI数据库中的比对结果同源性很低，判断为一种新的抗真菌蛋白。
[0033]在步骤I)中，所述YPTG液体培养基的组成成分及各组分质量百分比含量为:每IOOmLYPTG液体培养基中含酵母提取物0.5g，蛋白胨0.3g，甘露醇2.5g，葡萄糖lg，以及氯化钠0.25g ;所述发酵培养的条件为28°C、180r/min，发酵培养时间为7天；所述收集发酵液上清可通过抽滤的方法将所得发酵液中的菌体去除后获得。
[0034]在步骤2)中，所述静置的条件可于4°C条件下静置过夜。
[0035]在步骤3)中，所述离心的条件可将混合液于13000g、4°C条件下离心30min。
[0036]在步骤4)中，所述透析的条件可在4°C条件下进行；所述离心的条件可在10000g、4°C条件下离心20min。
[0037]在步骤5)中，所述冻干，是在冻干机中进行，冻干时间是2天。
[0038]在步骤6)中，所述超滤浓缩的条件可为4800g、4°C ;所述敏感指示菌包括但不限于绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉和长柄链格孢等；所述抗真菌活性检测方法可采用滤纸法，采用滤纸法的具体步骤如下:挑取直径为0.6cm的敏感指示菌菌块于PDA平板中央，28 °C倒置培养，在距敏感指示菌菌丝边缘0.8-Icm处放置直径为0.65cm无菌纸片，在各纸片上滴加40-50 μ L浓缩后的各分离组分以及空白对照，将平板置于28°C条件下培养，直到能观察到受试菌菌丝的生长受到明显的抑制。
[0039]在步骤8)中，所述N端测序鉴定可委托中科院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心进行N端测序鉴定。
[0040]本发明采用盐析、透析、冻干、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、超滤浓缩等方法从海洋桔青霉(Penicillium citrinum)Wl发酵液上清中分离纯化到一种抗真菌蛋白，将它命名为PcPAF，通过MALD1-T0F-T0F质谱鉴定该蛋白，所得质谱信息在NCBI Genbank数据库中未匹配到结果；进而通过N端测序检测该蛋白N端的15个氨基酸，所得氨基酸序列在NCBIGenbank数据库中的比对结果同源性很低，判断PcPAF为一种新的抗真菌蛋白。通过N端测序确定其N端15个氨基酸为AGNRPDFPRRHHPGG。PcPAF对4株植物致病真菌绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢具有明显抑制作用。经检测，PcPAF对绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢的最低抑制浓度分别为1.52 μ g/disc、
6.08 μ g/disc,3.04 μ g/disc 和 6.08 μ g/disc。PcPAF 在 80°C条件下加热 20min 仍具有抗菌活性。
[0041]本发明是从海洋桔青霉Wl发酵液上清中分离纯化到一种抗真菌蛋白，并判定为一种新的抗真菌蛋白。抗真菌蛋白PcPAF对典型的植物致病真菌绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢具有明显的抑制作用，显示出其在农业抗真菌药物、食品保藏等方面具有潜在的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为海洋桔青霉(Penicillium citrinum) Wl蛋白成分使用二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱进行色谱分离的情况。在图1中，横坐标表示洗脱运行时间(min)，纵坐标表示紫外吸收值(mAU) ;P1表示具有活性的非吸附组分。
[0043]图2为非吸附组分Pl使用羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱进行色谱分离的情况。在图2中，横坐标表示洗脱运行时间(min)，纵坐标表示紫外吸收值(mAU) ;P5表示非吸附组分。
[0044]图3为分离产物PcPAF进行SDS-PAGE电泳的图谱。在图3中，右边泳道M表示蛋白分子量标准Marker,左边泳道P表示分离产物PcPAF。
[0045]图4为分离产物PcPAF对敏感指示菌绿色木霉的抑制效果图。在图4中，I表示作为空白对照的溶解PcPAF的起始缓冲溶液，2表示PcPAF。
[0046]图5为分离产物PcPAF对敏感指示菌棉花枯萎病菌的抑制效果图。在图5中，I表示作为空白对照的溶解PcPAF的起始缓冲溶液，2表示PcPAF。
[0047]图6为分离产物PcPAF对敏感指示菌宛氏拟青霉的抑制效果图。在图6中，I表示作为空白对照的溶解PcPAF的起始缓冲溶液，2表示PcPAF。
[0048]图7为分离产物PcPAF对敏感指示菌长柄链格孢的抑制效果图。在图7中，I表示作为空白对照的溶解PcPAF的起始缓冲溶液，2表示PcPAF。
[0049]图8为通过二倍稀释法检测PcPAF对敏感指示菌绿色木霉的最低抑制浓度的检测结果。在图8中，I-6表示各纸片抗真菌蛋白浓度分别为97.30 μ g/disc, 48.65 μ g/disc,24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.1)。
[0050]图9为通过二倍稀释法检测PcPAF对敏感指示菌棉花枯萎病菌的最低抑制浓度的检测结果。在图9中，I-6表示各纸片抗真菌蛋白浓度分别为48.65 μ g/disc, 24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc, 1.52 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl，ρΗ8.I)。
[0051]图10为通过二倍稀释法检测PcPAF对敏感指示菌宛氏拟青霉的最低抑制浓度的检测结果。在图10中，I-6表示各纸片抗真菌蛋白浓度分别为24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc, 1.52 μ g/disc, 0.76 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.I)。
[0052]图11为通过二倍稀释法检测PcPAF对敏感指示菌长柄链格孢的最低抑制浓度的检测结果。在图11中，I-6表示各纸片抗真菌蛋白浓度分别为48.65 μ g/disc, 24.33 μ g/disc, 12.16 μ g/disc, 6.08 μ g/disc, 3.04 μ g/disc, 1.52 μ g/disc ；7 表不溶解 PcPAF 的起始缓冲溶液(20mmol/LTris-HCl，pH8.1)。
[0053]图12为不同温度处理后的活性蛋白PcPAF对敏感指示菌绿色木霉的抑制作用。在图12中，I表示未处理的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C处理20min后的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C处理20min后的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C处理20min后的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C处理20min后的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C处理20min后的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl,ρΗ8.I)。
[0054]图13为不同温度处理后的活性蛋白PcPAF对敏感指示菌棉花枯萎病菌的抑制作用。在图13中，I表示未处理的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C处理20min后的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C处理20min后的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C处理20min后的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C处理20min后的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C处理20min后的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始缓冲溶液(20mmol/LTris-HCl, pH8.1)。
[0055]图14为不同温度处理后的活性蛋白PcPAF对敏感指示菌宛氏拟青霉的抑制作用。在图14中，I表示未处理的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C处理20min后的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C处理20min后的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C处理20min后的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C处理20min后的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C处理20min后的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始缓冲溶液(20mmol/LTris-HCl, pH8.1)。
[0056]图15为不同温度处理后的活性蛋白PcPAF对敏感指示菌长柄链格孢的抑制作用。在图15中，I表示未处理 的抗真菌蛋白；2表示抗真菌蛋白在40°C处理20min后的抗菌活性；3表示抗真菌蛋白在60°C处理20min后的抗菌活性；4表示抗真菌蛋白在80°C处理20min后的抗菌活性；5表示抗真菌蛋白在100°C处理20min后的抗菌活性；6表示抗真菌蛋白在121°C处理20min后的抗菌活性；7表示溶解PcPAF的起始缓冲溶液(20mmol/LTris-HCl, pH8.1)。
【具体实施方式】
[0057]以下实施例将结合附图对本发明作详细说明。
[0058]1.菌种
[0059]本发明涉及菌株海洋桔青霉(Penicillium citrinum)Wl,已于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013205，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学；是从中国大洋第21航次科学考查采集的西南印度洋深海沉积物样品中分离得到，它的发酵上清对绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉、以及长柄链格孢的菌丝生长具有明显抑制活性。
[0060]2.培养基[0061 ] YPTG液体培养基:0.5%酵母提取物，0.3%蛋白胨，2.5%甘露醇，1%葡萄糖，及
0.25%NaCl，用去离子水配制。
[0062]实施例1:海洋桔青霉(Penicillium citrinum)Wl蛋白成分使用二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱进行色谱分离
[0063]使用起始缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.1)平衡二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱，将2ml左右的海洋桔青霉Wl粗蛋白成分在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上样，使用两个柱体积的起始缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.1)冲洗层析柱，获得低盐浓度条件下在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上的非吸附成分P1，再用洗涤缓冲液(lmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl,pH8.1)继续冲洗二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱，将其余的吸附组分洗脱下来(图1)。
[0064]实施例2:非吸附组分Pl使用羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱进行色谱分离
[0065]使用起始缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.1)平衡羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱，将浓缩至2ml左右的非吸附组分Pl在羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱上样，使用两个柱体积的起始缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, pH8.1)冲洗层析，获得非吸附组分P5，再用洗涤缓冲液(lmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl, pH8.1)继续冲洗羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱，将其余的吸附组分洗脱下来(图2)。
[0066]实施例3:分离产物PcPAF进行SDS-PAGE电泳
[0067]分离到的的组分P5在电压180V，常温条件下跑15%SDS_PAGE电泳，使用硝酸银快速染色方法检测分离组分P5的纯度，在电泳染色图谱上，分离到的组分P5只有一条单一条带被显色出来，大小在IOkDa附近，将该蛋白命名为PcPAF(图3)。
[0068]实施例4:分离产物PcPAF`对4株敏感指示菌绿色木霉，棉花枯萎病菌，宛氏拟青霉以及长柄链格孢的抑制效果
[0069]挑取直径为0.6cm的敏感指示菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28 °C条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8-Icm处放置直径为
0.65cm的无菌滤纸片，在滤纸片上滴加40-50μ L的PcPAF抗真菌蛋白溶液，而在作为空白对照的另一滤纸片上，滴加等体积的溶解PcPAF的起始缓冲溶液(图4-7)。
[0070]实施例5 =PcPAF对4株敏感指示菌的最低抑制浓度的测定
[0071]挑取直径为0.6cm的敏感指示菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28°C条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8-Icm处均匀放置直径为0.65cm的无菌滤纸片，各滤纸片距离菌丝边缘相等距离。采用二倍稀释法将高浓度的PcPAF抗真菌蛋白溶液依次进行梯度稀释，稀释液使用起始缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.1)，将各稀释样品过滤除菌，在每个滤纸片上滴加40-50 μ L的各浓度的PcPAF抗真菌蛋白质溶液，以起始缓冲液作为阴性对照，在超净台中将平板上所加的液体样品吹干，将做好的PDA抑菌板置于28°C条件下倒置培养，不同敏感指示菌培养时间不同，直到能够观察到真菌菌丝受抑制的最低程度。采用二倍稀释法，最低抑制浓度(MIC，minimalinhibition concentration)可定义为随着各个滤纸片上抗真菌蛋白含量的降低，滤纸片周围出现的对霉菌菌丝的抑制程度逐渐减弱，最终与阴性对照无差别，即能够观察到对霉菌菌丝抑制现象的最低蛋白含量，记为μ g/disc。
[0072]通过二倍稀释法，检测到PcPAF对绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢的最低抑制浓度分别为1.52 μ g/disc、6.08 μ g/disc、3.04 μ g/disc和6.08 μ g/disc (图 8 -11)。
[0073]实施例6:温度对抗真菌蛋白PcPAF抗菌活性的影响
[0074]将pcPAF抗真菌蛋白溶液于40℃、60:、80℃:、100℃:条件下分别处理201min以及121 °C高压灭菌条件下处理20min ;处理后的PcPAF抗真菌蛋白溶液于4°C放置Ih后离心，以未处理的PcPAF蛋白溶液为阳性对照，以溶解PcPAF抗真菌蛋白的缓冲液为阴性对照，检测各样品对4株敏感指不囷的抑囷活性。
[0075]挑取直径为0.6cm的敏感指示菌圆形菌块接种于普通PDA培养基平板上，在28 °C条件下倒置培养，使菌丝在平板上呈圆形伸展，在距离菌丝边缘0.8-Icm处均匀放置直径为0.65cm的无菌滤纸片，各滤纸片距离菌丝边缘相等距离。在纸片上分别滴加40-50 μ L经不同温度处理后的PcPAF抗真菌蛋白溶液。检测到PcPAF在100°C条件下处理20min会失去抗菌活性(图12-15)。
【权利要求】
1.海洋桔青霉(Penicilliumcitrinum)W1，已于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013205。
2.如权利要求1所述海洋桔青霉(Penicilliumcitrinum) Wl,其特征在于其ITS序列为:
I GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC
51 ATTACCGAGT GCGGGCCCCT CGGGGCCCAA CCTCCCACCC GTGTTGCCCG
101 AACCTATGTT GCCTCGGCGG GCCCCGCGCC CGCCGACGGC CCCCCTGAAC
151 GCTGTCTGAA GTTGCAGTCT GAGACCTATA ACGAAATTAG TTAAAACTTT
201 CAACAACGGA TCTCTTGGTT CCGGCATCGA TGAAGAACGC AGCGAAATGC
251 GATAACTAAT GTGAATTGCA GAATTCAGTG AATCATCGAG TCTTTGAACG
301 CACATTGCGC CCTCTGGTAT TCCGGAGGGC ATGCCTGTCC GAGCGTCATT
351 GCTGCCCTCA AGCCCGGCTT GTGTGTTGGG CCCCGTCCCC CCCGCCGGGG
401 GGACGGGCCC GAAAGGCAGC GGCGGCACCG CGTCCGGTCC TCGAGCGTAT
451 GGGGCTTCGT CACCCGCTCT AGTAGGCCCG GCCGGCGCCA GCCGACCCCC
501 AACCTTTAAT TATCTCAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG
551 AACTTA AGCA TATCAATAAG CGGAGG。
3.如权利要求1所述海洋桔青霉(Penicilliumcitrinum)Wl,其特征在于其抗真菌蛋白PcPAF的N端15个氨基酸序列为:AGNRPDFPRRHHPGG。
4.海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)从平板上挑取海洋桔青霉(Penicilliumcitrinum) Wl菌体接种于YPTG液体培养基进行发酵培养后，收集发酵液上清； 2)在步骤I)所收集到的发酵液上清中加入硫酸铵，配制成硫酸铵饱和的混合液，静置，使发酵液上清中的蛋白完全沉淀； 3)将步骤2)所得混合液进行离心，收集的沉淀用去离子水重新溶解，获得含盐的粗蛋白溶液； 4)将步骤3)所得含盐的粗蛋白溶液转移到透析袋中进行透析，除去多余的盐离子，再通过离心除去溶液中的不溶性杂质，收集除盐后的粗蛋白溶液，分装后冻存； 5)将步骤4)所得结冻的粗蛋白溶液转移到冻干机中进行冻干，去除水相得到固体的粗蛋白，再用去离子水将粗蛋白溶解； 6)将步骤5)所得处理后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上进行第一步的分离纯化，根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行超滤浓缩，通过真菌拮抗实验追踪分离得到的活性组分，进行抗真菌活性检测，使用对该粗蛋白敏感的植物病原真菌作为敏感指示菌； 7)将步骤6)获得的具有抗真菌活性的非吸附组分继续在羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱上进行第二步分离纯化，同样根据依次出现的280nm紫外吸收峰收集各洗脱组分，使用超滤浓缩管对各洗脱组分进行离心超滤浓缩，通过真菌拮抗实验追踪分离出来的活性组分，同样采用滤纸片法，并使用对该粗蛋白敏感的植物病原真菌作为敏感指示菌，活性组分确定后，通过SDS-PAGE电泳图判断组分中的蛋白纯度，确定活性组分为纯的单一蛋白； 8)通过15%SDS-PAGE电泳在IOkDa附近得到单一条带,将凝胶上的单一条带切下,经过无菌去离子水洗涤后，通过MALD1-TOF-TOF进行鉴定，所得质谱信息在NCBI数据库中未匹配到结果；进而将单一的蛋白条带通过转膜处理转移到PVDF聚偏二氟乙烯膜上，通过N端测序鉴定蛋白N端的15个氨基酸，所得氨基酸序列在NCBI数据库中的比对结果同源性很低，判断为一种新的抗真菌蛋白。
5.如权利要求4所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述YPTG液体培养基的组成成分及各组分质量百分比含量为:每IOOmL YPTG液体培养基中含酵母提取物0.5g,蛋白胨0.3g,甘露醇2.5g,葡萄糖Ig,以及氯化钠0.25g ;所述发酵培养的条件为28°C、180r/min，发酵培养时间为7天；所述收集发酵液上清可通过抽滤的方法将所得发酵液中的菌体去除后获得。
6.如权利要求4所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述静置的条件是于4°C条件下静置过夜；在步骤3)中，所述离心的条件可将混合液于13000g、4°C条件下离心 30min。
7.如权利要求4所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法，其特征在于在步骤.4)中，所述透析的条件是在4°C条件下进行；所述离心的条件可在10000g、4°C条件下离心20mino
8.如权利要求4所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述冻干，是在冻干机中进行，冻干时间是2天。
9.如权利要求4所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述超滤浓缩的条件为4800g、4°C ;所述敏感指示菌包括但不限于绿色木霉、棉花枯萎病菌、宛氏拟青霉和长柄链格孢。
10.如权利要求4所述海洋桔青霉抗真菌蛋白PcPAF的制备方法,其特征在于在步骤6)中，所述抗真菌活性检测方法采用滤纸法，采用滤纸法的具体步骤如下:挑取直径为.0.6cm的敏感指示菌菌块于PDA平板中央，28°C倒置培养，在距敏感指示菌菌丝边缘0.8~Icm处放置直径为0.65cm无菌纸片，在各纸片上滴加40~50 μ L浓缩后的各分离组分以及空白对照，将平板置于28°C条件下培养，直到能观察到受试菌菌丝的生长受到明显的抑制。
【文档编号】C07K1/34GK103451109SQ201310370028
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】陈新华, 郭文斌, 文超 申请人:国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会