一种atp释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂的制作方法
【专利摘要】本发明首先所要解决的技术问题是提供一种ATP释放剂及该释放剂的制备方法，该释放剂为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠。本发明还提供了一种细菌快速检测试剂，该试剂包含有浸有上述ATP释放剂的细菌采集拭子、荧光素酶、荧光素底物、反应缓冲液。本发明涉及ATP释放及测定，ATP的释放和测定一步完成，减少了ATP释放步骤，检测方法更简单，过程更为快速，数分钟就可以达到结果。本发明具有制备过程简单、成本低廉、效果显著等优点，能更好的适用于微生物的检测。
【专利说明】一种ATP释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及ATP释放剂，更具体地说涉及包含该ATP释放剂及荧光素酶的细菌快速检测试剂。
【背景技术】
[0002]荧光素酶(Iuciferase)是一种能将化学能转变为光能的高效生物催化剂，萤火虫突光素酶(简称虫突光素酶，firefly Iuciferase7FL)以突光素(Luciferin),三磷酸腺苷(ATP)和O2为底物，在镁离子(Mg2+)存在时，将化学能转化为光能，并发出光量子，反应式如下:
Luciferin+02+ATP+Mg2++ 突光素酶--Oxidized luciferin+C02+AMP +Pyrophosphate+hu
ATP既是荧光素酶催化发光的必须底物，又是所有生物生命活动的能量来源。ATP生物荧光法是目前认为最为快速的微生物检测方法。在其它反应底物均过量存在的情况下，荧光素酶催化发射荧光的数值与ATP的量呈线性关系。利用这一特性，早在1947年McElory等就应用FL来测定ATP，此后，荧光素酶在生物化学及生物技术的分析应用方面得到了不断发展。特别是在细菌检测方面，由于各生长时期的细菌有较恒定水平的ATP含量，提取细菌的ATP，利用生物发光法测定出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅需十几分钟。由于生物发光法无需培养过程、操作简便、灵敏度高，是目前监测微生物最快的方法之一。荧光素酶由于具有敏感性高、特异性好、反应迅速、操作简单和应用范围广等优点，现已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段。因此，对荧光素酶的需求量也日益增加。
[0003]作为FL生产原料的萤火虫，其人工扑捉或养殖地域和季节限制，且生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂。随着分子生物学技术的发展，人们转向用基因工程方法制备荧光素酶。1985年，De Wet等首次克隆了北美萤火虫(A的FL基因，并在大肠杆菌co7i)中表达，从中得到具有生物活性的FL。随后，各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中表达。但是，目前能够提供FL的厂家主要有Promega、Sigma和Roche三家国外公司，随着FL在国内需求量的增加，FL生产的国产化将是大势所趋。
[0004]传统荧光素酶的活性中心中含有大量的还原性的氨基酸，他们很容易被氧化从而减低酶的稳定性，故稳定性不强。如要长期保存，需置于-20 °C的环境下保存，短期保存需置于4 °C的冰箱内保存，以保存酶的稳定性。商品化ATP检测反应试剂要求在28 °C的条件下反应，并且一旦配制后必须尽快使用，这一要求难以使ATP检测反应试剂在野外高温的环境中使用。本发明成功研制了耐热荧光素酶，在40 °C环境中放置25 min后活性保留90%以上，在37 °C的条件下放置I h后其灵敏度基本不变，稳定性得到了提高。可用于现场快速检测细菌，从而拓广了 ATP检测反应技术的应用领域。
[0005]ATP释放剂的作用是破坏细胞结构使其释放出ATP，而细胞中有一些分解ATP的酶类，可能在短时间内分解ATP，同时不同的释放剂可能对酶的活性有影响，因此还选择一个合适的释放剂，即能破坏细胞释放ΑΤΡ，也能破坏细胞内的分解ATP酶类的活性，同时又不会在短时间内对荧光素的活性有太大影响。目前使用的ATP释放剂有煮沸法、稀酸法、稀碱法、表面活性剂法等。稀酸对酶类的破坏性一样，无特异性；一定浓度二甲基亚砜能改变细胞膜的通透性，使ATP释放出来，但对细胞内的ATP酶类无特异性破坏；常用的表面活性剂SDS破坏荧光素酶的活性，使酶变性失活；TritonX-100、苯扎溴铵等释放ATP效果不显著。本发明研制出的5- (4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸钠属于磺酸类离子表面活性剂，可解决以上问题，提高ATP的释放效果。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明首先所要解决的技术问题是提供一种ATP释放剂，该释放剂为5- (4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸钠，其化学式为
【权利要求】
1.一种ATP释放剂，其特征在于它为5- (4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸钠，其化学式为:
2.权利要求1所述ATP释放剂的制备方法，其特征在于包括以下两步反应:
3.—种细菌快速检测试剂，其特征在于它包括浸有如权利要求1所述的ATP释放剂的细菌采集拭子、荧光素酶、荧光素底物、反应缓冲液。
4.如权利要求3所述的细菌快速检测试剂，其特征在于所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所述。
5.如权利要求4所述的细菌快速检测试剂，其特征在于所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所述。
【文档编号】C07C303/32GK103483229SQ201310414806
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】郑曙剑, 殷秀飞, 应旭霞 申请人:杭州隆基生物技术有限公司