一种咪唑立宾的提纯方法
【专利摘要】本发明提供了一种咪唑立宾的提纯方法，该方法包括以下步骤：首先向咪唑立宾发酵液中加入酸，再加入絮凝剂，过滤得到粗滤液；然后采用大孔树脂柱对粗滤液依次进行脱色、富集、二次脱色处理，将二次脱色液减压浓缩后，冷却结晶，得到咪唑立宾粗粉；最后对所得咪唑立宾粗粉进行重结晶处理，得到咪唑立宾精粉。本发明所述提纯方法能够大幅度提高咪唑立宾的纯度，该方法收率高，所得咪唑立宾精粉稳定性好、颗粒均匀、易于分装。
【专利说明】一种咪唑立宾的提纯方法
【技术领域】
[0001]本发明属于制药工程【技术领域】，具体地说，涉及一种咪唑立宾的提纯方法。
【背景技术】
[0002]咪唑立宾(Mizoribine,简称MZB)是一种由土壤霉菌(Eupenicilliumbrefeldianum)产生的咪唑类抗生素。作为免疫抑制剂，临床上可用于抑制肾移植排斥反应，也可用于治疗狼疮性肾炎、类风湿性关节炎及肾病综合征等自身免疫性疾病。
[0003]咪唑立宾主要通过发酵法生产，其纯化处理过程中，需要对发酵液中的咪唑立宾进行富集和脱色处理。目前，通常采用纳滤膜浓缩的方法进行富集处理，但该方法浓缩效率较低，成本较高。而脱色处理主要采用超滤的方法，但该方法脱色后的料液中咪唑立宾浓度大幅下降，物料损失较为严重。此外，传统的纯化处理方法所得产品多为咪唑立宾的一水合物，该化合物性质不稳定，不便于储存和运输。为提高咪唑立宾的稳定性，美国专利US5442051公开了一种将咪唑立宾一水合物加入到乙醇中加热回馏制备无水咪唑立宾的方法，所得无水咪唑立宾性质 稳定，但该方法所得产物晶粒细小，制剂分装困难，不利于工业生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种咪唑立宾的提纯方法，该方法所得产品稳定性好、收率
高、纯度高。
[0005]为实现本发明目的，本发明提供了以下提纯方法，其步骤为:
(1)向咪唑立宾发酵液中加入酸，调节pH至2.5-5.5，再加入絮凝剂，过滤得到粗滤液；
(2)将粗滤液通过脱色柱，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，收集流出液，得到一次脱色液，所述脱色柱的填料为阳离子交换树脂；
(3)向一次脱色液中加入碱性溶液，调节pH至7.5-10.5，加载至吸附柱上，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以酸性洗脱液进行洗脱，收集流出液，得到一次富集液，所述吸附柱的填料为强碱性阴离子交换树脂；
(4)向一次富集液中加入碱性溶液，调节pH至8.0-10.0，加载至富集柱上，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以酸性洗脱液进行洗脱，收集流出液，得到二次富集液；所述富集柱的填料为强碱性阴离子交换树脂；
根据富集液单位高低，本操作可以重复进行，得到η次富集液；
(5)将二次(或η次)富集液通过脱色柱，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，收集流出液，得到二次脱色液，所述脱色柱的填料为强酸性阳离子脱色树脂；
(6)将二次(或η次)脱色液减压浓缩后，冷却结晶，过滤，滤饼水洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾粗粉；
(7)将咪唑立宾粗粉溶于85-90°C的纯化水中，向其中加入沸腾的无水乙醇，搅拌后，冷却结晶，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾精粉。[0006]为了进一步提高产品收率，本发明上述步骤中，步骤(6)过滤后，可将所得滤液回收，并入步骤(3)所述一次富集液；步骤(7)过滤后，可将所得滤液回收，减压蒸馏除去乙醇，并入步骤(3)所述一次富集液。
[0007]本发明所述酸可以是乙酸、盐酸、磷酸水溶液中任意一种，最好是乙酸；所述碱性溶液为氢氧化钾、氢氧化钠水溶液中的任意一种，最好是氢氧化钠水溶液。
[0008]本发明所述阳离子交换树脂最好是大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂。所述强碱性阴离子交换树脂为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂。
[0009]本发明所述酸性洗脱液最好为乙酸水溶液，其浓度最好为0.2-2M/L。
[0010]本发明所述富集柱，其柱床体积最好为所述吸附柱柱床体积的1/3-1/10。
[0011]本发明步骤(6)所述二次脱色液，减压浓缩后，其中咪唑立宾的浓度最好为
0.3-0.8g/mL。
[0012]本发明步骤(7)所述咪唑立宾粗粉溶于85-90°C的纯化水中，得到咪唑立宾水溶液，其中咪唑立宾的含量为0.6-0.9 g/mL ;所述沸腾的无水乙醇，其用量为所述咪唑立宾水溶液体积的8-12倍，上述条件下，咪唑立宾结晶速度快、结晶完全。
[0013]本发明步骤(I)中，最好将pH调节至3.5-4.5，所述絮凝剂优选的分子量为1000-1200万的阳离子聚丙烯酰胺。絮凝剂的浓度按质量百分比计优选0.1%。
本发明首先对采用生物发酵法得到的咪唑立宾发酵液，进行酸化、絮凝和过滤处理，得到杂质含量较少的粗滤液，便于进行后续提纯。然后采用强酸性阳离子交换树脂对粗滤液进行脱色处理，脱色效果极为明显`，料液由红褐色变为棕黄色，且脱色处理前后，料液中咪唑立宾浓度相差不大。随后对料液进行纯化和浓缩处理，富集倍数高，效率高；经测定，二次富集液中咪唑立宾的HPLC纯度高达95%以上。对二次富集液再次进行脱色除杂后，结晶得到咪唑立宾粗粉；该结晶过程简便迅速，经测定，析出的咪唑立宾一水合物的HPLC纯度高达98.5%以上。由于咪唑立宾一水合物不稳定，本发明将上述咪唑立宾粗粉加热水溶解后，再加入沸腾的乙醇进行重结晶处理，得到咪唑立宾精粉。该精粉主要由无水咪唑立宾晶体组成，其性质稳定、颗粒粗大、易分装。经测定，其中无水咪唑立宾纯度高达99%以上。上述生产工艺稳定可靠，在15吨发酵罐规模上进行多批生产，每批产品纯度均可达99%以上。
【具体实施方式】
[0014]下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所采用的咪唑立宾菌株为霉菌Eupenicillium brefeldianum,优选购自中国普通微生物菌种保藏中心保藏的CGMCC 3.5698。
[0015]咪唑立宾发酵液的制备:从斜面培养基上取一环咪唑立宾产生菌接种于含种子培养基(葡萄糖1.0%，酪蛋白水解物0.2%，大豆蛋白胨0.5%，121°C灭菌20min，上述百分比均为重量百分比)的500ml摇瓶中，装量100ml，26°C振荡培养24小时后接种于含发酵培养基(蔗糖 6.0%、大豆蛋白胨 2.0%、(NH4)2SO4 0.5%, NaNO3L 0%, KH2PO40.2%,MgSO4.7H20 0.02%，上述百分比均为重量百分比)的发酵罐中，通风条件下，26-28°C培养96小时，收集发酵液。
[0016]以下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0017]实施例1按照以下步骤制备咪唑立宾精粉
(1)向咪唑立宾发酵液中加入盐酸，调节pH至2.5-3.5，再加入质量浓度为0.1%的絮凝剂(该絮凝剂为分子量1200万的阳离子聚丙烯酰胺，商品编号为Floc 2559)，使发酵液中絮凝剂的浓度达到50ppm，搅拌，过滤得到粗滤液；
(2)将上述粗滤液通过脱色柱，流速为每小时0.5倍柱床体积，收集流出液，得到一次脱色液，该脱色柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂D81 ；
(3)向上述一次脱色液中加入质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液，调节pH至7.5，加载至吸附柱上，流速为每小时0.5倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以0.2M/L乙酸水溶液进行洗脱，收集流出液，得到一次富集液，该吸附柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂D202 ；
(4)向上述一次富集液中加入质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0，加载至富集柱上，流速为每小时0.5倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以
0.2M/L乙酸水溶液进行洗 脱，收集流出液，得到二次富集液，该富集柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂HZ202 ;该富集柱的柱床体积是步骤(3)中吸附柱柱床体积的1/3 ；
(5)将上述二次富集液通过脱色柱，流速为每小时0.5倍柱床体积，收集流出液，得到二次脱色液，该脱色柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂D81 ；
(6)将上述二次脱色液于50°C抽真空减压浓缩至其中咪唑立宾的浓度达到0.3g/mL,加热至70°C，冷却结晶，过滤，滤饼水洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾粗粉；
(7)将咪唑立宾粗粉溶于85°C的纯化水中，使所得咪唑立宾水溶液浓度为0.6 g/mL，然后向其中加入沸腾的无水乙醇，加入量为咪唑立宾水溶液体积的8倍，冷却结晶，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾精粉。
[0018]本实施例所得咪唑立宾精粉颗粒均匀，流动性好，易于分装。经HPLC测定，咪唑立宾总收率(即从发酵液到精粉的整体收率)为58.2%，纯度为99.2%。
[0019]实施例2
按照以下步骤制备咪唑立宾精粉
(1)向咪唑立宾发酵液中加入磷酸水溶液，调节pH至4.5-5.5，再加入质量浓度为0.1%的絮凝剂(该絮凝剂为分子量1000万的阳离子聚丙烯酰胺)，使发酵液中絮凝剂的浓度达到50ppm,搅拌,过滤得到粗滤液；
(2)将上述粗滤液通过脱色柱，流速为每小时2.0倍柱床体积，收集流出液,得到一次脱色液，该脱色柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂D81 ；
(3)向上述一次脱色液中加入质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液，调节pH至10.5，加载至吸附柱上，流速为每小时2.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以2M/L乙酸水溶液进行洗脱，收集流出液，得到一次富集液，该吸附柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂D202 ；
(4)向上述一次富集液中加入质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液调节pH至10.0，加载至富集柱上，流速为每小时2.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以2M/L乙酸水溶液进行洗脱，收集流出液，得到二次富集液，该富集柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂HZ202;该富集柱的柱床体积是步骤(3)中吸附柱柱床体积的 1/10 ；
(5)将上述二次富集液通过脱色柱，流速为每小时2.0倍柱床体积，收集流出液，得到二次脱色液，该脱色柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂D81 ；
(6)将上述二次脱色液于50°C抽真空减压浓缩至其中咪唑立宾的浓度达到0.8g/mL(此过程中，可按照常规方法加入适量正丁醇共沸)，然后加热至80°C，冷却结晶，过滤，滤饼水洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾粗粉；
(7)将咪唑立宾粗粉溶于90°C的纯化水中，使所得咪唑立宾水溶液浓度为0.9 g/mL，然后向其中加入沸腾的无水乙醇，加入量为咪唑立宾水溶液体积的12倍，冷却结晶，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾精粉。
[0020]本实施例所得咪唑立宾精粉颗粒均匀，流动性好，易于分装。经HPLC测定，咪唑立宾收率为60.7%，纯度为99.3%。
[0021]实施例3
按照以下步骤制备咪唑立宾精粉
(1)向咪唑立宾发酵液中加入乙酸，调节pH至3.5-4.5，再加入质量浓度为0.1%的絮凝剂Floc 2559，使发酵液中絮凝剂的浓度达到50ppm，搅拌，过滤得到粗滤液；
(2)将上述粗滤液通过脱色柱，流速为每小时1.0倍柱床体积，收集流出液，得到一次脱色液，该脱色柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂D81 ；
(3)向上述一次脱色液中加入质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液，调节pH至9.0，加载至吸附柱上，流速为每小时1.0倍柱床`体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以1M/L乙酸水溶液进行洗脱，收集流出液，得到一次富集液，该吸附柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂D202 ；
(4)向上述一次富集液中加入质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液调节pH至9.0，加载至富集柱上，流速为每小时1.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以1M/L乙酸水溶液进行洗脱，收集流出液，得到二次富集液，该富集柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂HZ202;该富集柱的柱床体积是步骤(3)中吸附柱柱床体积的 1/5 ；
(5)将上述二次富集液加载至脱色柱上，流速为每小时1.0倍柱床体积，收集流出液，得到二次脱色液，该脱色柱的填料为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂D81 ；
(6)将上述二次脱色液50°C抽真空减压浓缩至其中咪唑立宾的浓度达到0.5g/mL，加热至75°C，冷却结晶，过滤，滤饼水洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾粗粉；
(7)将咪唑立宾粗粉溶于88°C的纯化水中，使所得咪唑立宾水溶液浓度为0.75 g/mL,然后向其中加入沸腾的无水乙醇，加入量为咪唑立宾水溶液体积的10倍，冷却结晶，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾精粉。
[0022]本实施例所得咪唑立宾精粉颗粒均匀，流动性好，易于分装。经HPLC测定，咪唑立宾收率为60.2%，纯度为99.5%。
[0023]实施例4
为了进一步提高产品收率，本发明将实施例3中步骤(7)过滤所得滤液减压蒸馏除去乙醇后，与步骤(6 )所得滤液合并，回收备用。
[0024]按照与实施例3相同的步骤制备咪唑立宾精粉，并将上述合并后的回收滤液并入一次富集液进后续处理。
[0025]经HPLC测定 ，本实施例所得咪唑立宾精粉中，咪唑立宾收率为65%，纯度为99.4%。
【权利要求】
1.一种咪唑立宾的提纯方法，其特征在于包括以下步骤: (1)向咪唑立宾发酵液中加入酸，调节pH至2.5-5.5，再加入絮凝剂，过滤得到粗滤液； (2)将粗滤液通过脱色柱，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，收集流出液，得到一次脱色液；所述脱色柱的填料为阳离子交换树脂； (3)向一次脱色液中加入碱性溶液，调节pH至7.5-10.5，加载至吸附柱上，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以酸性洗脱液进行洗脱，收集流出液，得到一次富集液；所述吸附柱的填料为强碱性阴离子交换树脂； (4)向一次富集液中加入碱性溶液，调节pH至8.0-10.0，加载至富集柱上，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，加载完毕后以纯化水洗脱至流出液为中性，再以酸性洗脱液进行洗脱，收集流出液，得到二次富集液；所述富集柱的填料为强碱性阴离子交换树脂； (5)将η次富集液通过脱色柱，流速为每小时0.5-2.0倍柱床体积，收集流出液，得到二次脱色液，所述脱色柱的填料为强酸性阳离子脱色树脂； (6)将二次脱色液减压浓缩后，冷却结晶，过滤，滤饼水洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾粗粉； (7)将咪唑立宾粗粉溶于85-90°C的纯化水中，向其中加入沸腾的无水乙醇，搅拌后，冷却结晶，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗后压实，40°C真空干燥，得到咪唑立宾精粉。
2.根据权利要求1所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:步骤(6)所述过滤，将所得滤液回收，并入步骤(3)所述一次富集液；步骤(7)所述过滤，将所得滤液回收，减压蒸馏除去乙醇后，并入步骤(3 )所述一次富集液。
3.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:所述酸为乙酸、盐酸、磷酸水溶液中任意一种，所述碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾水溶液中任意一种。
4.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:所述阳离子交换树脂为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强酸性树脂。
5.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:所述强碱性阴离子交换树脂为大孔型苯乙烯-二乙烯苯系列强碱性树脂。
6.根据权利要求3所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:所述酸性洗脱液为乙酸水溶液，其浓度为0.2-2M/L。
7.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:所述富集柱，其柱床体积为所述吸附柱柱床体积的1/3-1/10。
8.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:步骤(6)所述二次脱色液，减压浓缩后，其中咪唑立宾的浓度为0.3-0.8g/mL。
9.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:步骤(7)所述咪唑立宾粗粉溶于85-90°C的纯化水中，得到咪唑立宾水溶液，其中咪唑立宾的含量为0.6-0.9g/mL;所述沸腾的无水乙醇，其用量为所述咪唑立宾水溶液体积的8-12倍。
10.根据权利要求1或2所述咪唑立宾的提纯方法，其特征在于:步骤(I)中，将pH调节至3.5-4.5，所述絮凝剂为分子量1000-1200万的阳离子聚丙烯酰胺。
【文档编号】C07H1/08GK103450300SQ201310414343
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】张炜, 谢新宇, 冷凤, 孔鹏, 李梅, 李淑兰, 李福棣, 谷岩翡, 王琪, 段宝玲, 朱秀良, 董爱华, 宋霏 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司