一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法
【专利摘要】一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，涉及纳他霉素。提供工艺简便、收率高、纯度高、不使用有机溶媒、成本低、环保、对发酵液及设备的特性要求低，并适用于产业化生产的一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法。a.调节纳他霉素发酵液的pH值至5.0～6.5，过滤，去除水份，收集固体；b.将步骤a收集的固体清洗，静置后，离心收集固体；c.在步骤b收集到的固体中，加入碳酸钠溶液，得萃取液，再超声振荡处理，然后对萃取液进行固液分离，收集上清液；d.将步骤c得到的上清液用盐酸调节pH值至5.0～6.0，静置，结晶后过滤，收集固体，清洗，冷冻，干燥后即得纳他霉素纯品。
【专利说明】一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法
【技术领域】[0001]本发明涉及纳他霉素，尤其是涉及一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法。
【背景技术】
[0002]纳他霉素(Natamycin)又称匹马霉素(Pimaricin)或田纳西菌素(Tenecetin),分子式为C33H47NO13,分子量为665.75道尔顿，其外观白色或奶油色，为无色结晶粉末，含有三分子以上的结晶水。纳他霉素是一种两性物质，分子中具有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为PH6.5，熔点为280°C。纳他霉素微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯酰胺，难溶于大部分有机溶剂，其结构上存在两种典型构型:烯醇式结构和酮式结构。在室温条件下,纳他霉素在水中的溶解度为30~100mg/L，在水和较低级醇类中，在中性pH下溶解度最低，随着PH值的升高与降低，纳他霉素的溶解性增加，而在pH低于3或高于9时，溶解度显著增大。
[0003]纳他霉素是一种高效、广谱的多烯大环内酯类抗生素，能够专一性地抑制几乎所有的霉菌和酵母菌，以及某些原生动物和某些藻类。早在1982年6月，美国FDA就正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂。自1996年中国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂起，我国食品添加剂委员会就对纳他霉素进行了应用方面的跟踪与评价，2011年正式出台了《食品添加剂使用卫生标准》，将其作为食品防霉剂，用于奶酪、糕点、肉汤等食品的加工过程中，其商品名称为霉克(Natamax i nTM )。
[0004]纳他霉素作为抗真菌感染药物在医学方面也有良好的应用。最近纳他霉素在医学上特别是在眼角膜真菌感染方面的研究和报道层出不穷，它对口腔念球菌的感染有非常显著的治疗效果。另外，也应用于肺部和阴道真菌感染的治疗。
[0005]纳他霉素是通过链霉菌发酵法制备的，常用的链霉菌包括纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、揭黄链霉菌(Streptomyces chattanoganis)。纳他霉素在通常条件下不溶于水，常用一些有机溶剂进行提取，如专利US3，892，850、W092/07998、W092/1058、CN10130729A、CN1891709A均采取有机溶剂提取的方法。这些方法需要使用甲醇、异丙醇等易燃、易挥发的有机溶剂，势必导致较高的溶剂损耗、回收费用以及较高的安全设施要求、高昂的环保费用。同时，甲醇的使用，容易导致纳他霉素甲酯这种副产物的产生，从而影响产品的纯度。
[0006]专利W097/29207公布一种不需有机溶媒提取纳他霉素的方法。该方法先使用物理或化学的方法使发酵液中菌丝体细胞破碎、降解，发酵液中的纳他霉素固体颗粒悬浮在水相中，然后通过应用中立梯度离心技术使纳他霉素固体与细胞碎片分离得到产品。该方法具有工艺线路短的优点，但此工艺对发酵液中纳他霉素的含量要求较高(大于7g/L)，同时对发酵液中的纳他霉素晶体大小及均一度都有严格的要求。另外，从抗生素提取纯化专业角度来讲，利用重力梯度离心技术来彻底不同粒度大小的颗粒会对分离设备提出极高要求，同时也需要高额的设备维护费用。从以上两点可看出该提取方法的应用有一定的局限性。[0007]专利CN101062934A公开一种不使用有机溶剂从发酵液中提取纳他霉素的方法，该方法是利用纳他霉素在不同PH条件下的水溶液中溶解度不同的性质，来实现纳他霉素的提取。在其碱化过程中，发酵液的PH值均要求在11以上，这样势必使用大量的碱液来调节原本显酸性的发酵液。该方法虽然避免了有机溶剂使用，但大量酸碱的使用同样会带来不可预知的环保问题和酸碱的消耗、回收问题。另外，由于发酵液中纳他霉素的含量较低，这些方法在进行提取前都需要进行发酵液的浓缩处理，以提高提取得率及纯度，这样势必增加生产中的能耗。[0008]专利CN102863492A公布一种不使用有机溶剂从发酵液中提取纳他霉素的方法，该方法是利用草酸调节发酵液PH为2.8-3.0，加入黄血盐和硫酸锌，再加入聚丙烯酸钠，经厢式隔膜压滤机过滤、超滤提纯后纳滤纯化、结晶、真空干燥后制得纳他霉素。该方法虽然避免了有机溶剂的使用，但其分离工艺对设备以及膜材料要求较高，工艺步骤多，在最后纳滤脱盐中还要进行浓缩以提高得率以及纯度，这样势必增加生产中的成本。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供工艺简便、收率高、纯度高、不使用有机溶媒、成本低、环保、对发酵液及设备的特性要求低，并适用于产业化生产的一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法。
[0010]本发明包括以下步骤:
[0011]a.调节纳他霉素发酵液的pH值至5.0~6.5，过滤，去除水份，收集固体；
[0012]b.将步骤a收集的固体清洗，静置后，离心收集固体；
[0013]c.在步骤b收集到的固体中，加入碳酸钠溶液，得萃取液，再超声振荡处理，然后对萃取液进行固液分离，收集上清液；
[0014]d.将步骤c得到的上清液用盐酸调节pH值至5.0~6.0，静置，结晶后过滤，收集固体，清洗，冷冻，干燥后即得纳他霉素纯品。
[0015]在步骤a中，所述过滤可采用离心或板框过滤。
[0016]在步骤b中，所述清洗可采用按收集的固体2倍体积的洁净水清洗；所述静置的时间可为3~6h。
[0017]在步骤c中，所述加入碳酸钠溶液的量按体积比可为收集到的固体的5~50倍，所述碳酸钠溶液的摩尔浓度可为0.1~0.15mol/L ;所述超声振荡处理的条件可为在10~30°C的温度条件下，超声振荡处理0.5~Ih。
[0018]在步骤d中，所述静置的条件可在5~25°C的温度条件下静置，所述结晶的时间可为10~15h ;所述过滤可采用离心或板框过滤；所述清洗可用固体I倍体积的洁净水清洗2次。
[0019]本发明以碳酸钠缓冲盐溶液为非有机溶媒从发酵液中提取纳他霉素并在萃取环节无需调节PH为特征，解决了有机溶媒法提取纳他霉素造成的纳他霉素提取纯化工程中有机溶剂溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高的问题，同时也避免了调节萃取混合液PH的环节，简化了萃取工艺，节省了酸碱的用量，保护了纳他霉素的稳定性，经济、绿色环保、工艺简单，并适用于产业化生产。本发明具有工艺简便、收率高、纯度高O 95%)、不使用有机溶媒，成本低、环保、对发酵液及设备的特性要求低等优点。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为纳他霉素标准品HPLC图。
[0021 ] 图2为纳他霉素纯品HPLC图。
【具体实施方式】[0022]实施例1
[0023]取20L纳他霉素发酵液，所述纳他霉素发酵液为褐黄孢链霉菌经过培养、发酵代谢后得来的纳他霉素发酵液，纳他霉素含量为10.31g/L，使用盐酸调节发酵液pH为6.0，使用板框过滤，得2.72kg滤饼，将滤饼使用3L洁净水清洗一遍，静置5h，再离心分离，获得沉淀。向沉淀加入体积为30L的0.15mol/L的碳酸钠溶液。在20°C的温度条件下，超声振荡0.5h，达到振荡时间后，离心分离，收集上清液，调节pH为5.5，25°C的温度下，静置IOh,离心得沉淀，使用洁净水清洗沉淀2次，再离心分离得沉淀，冷冻干燥得纳他霉素纯品142.72g，得率为69%，纯度大于95%。
[0024]实施例2
[0025]取1.5L纳他霉素发酵液，所述纳他霉素发酵液为褐黄孢链霉菌经过培养、发酵代谢后得来的纳他霉素发酵液，纳他霉素含量为6.34g/L,使用盐酸调节发酵液pH为5.5，使用离心分离，得到192g沉淀，将沉淀使用0.2L洁净水清洗一遍，静置6h，再离心分离，获得沉淀。向沉淀加入体积为2L的0.lmol/L的碳酸钠溶液。在15°C的温度条件下，超声振荡lh。达到振荡时间后，离心分离，收集上清液，调节pH为6.0，在15°C的温度下，静置15h，达到静置时间后，离心分离得沉淀，使用洁净水清洗沉淀2次，在离心分离得沉淀，冷冻干燥得纳他霉素纯品6.18g，得率为65%，纯度大于95%。
【权利要求】
1.一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤: a.调节纳他霉素发酵液的pH值至5.0~6.5，过滤，去除水份，收集固体； b.将步骤a收集的固体清洗，静置后，离心收集固体； c.在步骤b收集到的固体中，加入碳酸钠溶液，得萃取液，再超声振荡处理，然后对萃取液进行固液分离，收集上清液； d.将步骤C得到的上清液用盐酸调节pH值至5.0~6.0，静置，结晶后过滤，收集固体，清洗，冷冻，干燥后即得纳他霉素纯品。
2.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤a中，所述过滤采用离心或板框过滤。
3.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤b中，所述清洗采用按收集的固体2倍体积的洁净水清洗。
4.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤b中，所述静置的时间为3~6h。
5.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤c中，所述加入碳酸钠溶液的量按体积比为收集到的固体的5~50倍，所述碳酸钠溶液的摩尔浓度可为 0.1 ~0.15mol/L。
6.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤c中，所述超声振荡处理的条件为在10~30°C的温度条件下，超声振荡处理0.5~lh。
7.如权利要求 1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤d中，所述静置的条件是在5~25°C的温度条件下静置。
8.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤d中，所述结晶的时间为10~15h。
9.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤d中，所述过滤采用离心或板框过滤。
10.如权利要求1所述一种发酵液中纳他霉素的提取纯化方法，其特征在于在步骤d中，所述清洗是用固体I倍体积的洁净水清洗2次。
【文档编号】C07H17/08GK103665074SQ201410006599
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】敬科举, 郭立, 卢英华 申请人:厦门大学