核苷5′-β,γ亚甲基及双卤代亚甲基三磷酸合成方法
【专利摘要】本发明属于化学合成领域，涉及核苷5′-β,γ亚甲基及双卤代亚甲基三磷酸合成方法。本发明以不保护的核苷磷酰哌啶为原料，在酸性活化试剂存在的条件下，与双膦酸或双卤代双膦酸发生偶联反应；粗产物经过乙醇沉淀和离子交换色谱纯化得高纯度最终产物。本方法反应速度快、产率高。
【专利说明】核苷5' -β, Y亚甲基及双南代亚甲基三磷酸合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过磷酰哌啶中间体在4，5- 二氰基咪唑活化试剂条件下合成核苷5, -β, Y-亚甲基三磷酸及双卤代亚甲基三磷酸的化学合成方法。
技术背景
[0002]核苷三磷酸是维持生命体系运转的一类重要生物分子。例如，ATP是细胞内能量转换的载体。RNA及DNA都是以核苷、脱氧核苷三磷酸为底物及能量来源进行合成的。同时，细胞的各种信号传导也与核苷三磷酸密切相关。但是，由于核苷三磷酸分子中存在高能磷酸酐键，核苷三磷酸极易容易水解和受到磷酸酯酶的降解，因此核苷三磷酸在很多方面的应用受到了极大地限制。当β，Y位的P-O-P键被稳定的P-C-P键取代时，这一类修饰的核苷三磷酸衍生物的化学稳定性和代谢稳定性可以得到大幅度的提高。因此，这类三磷酸衍生物已被广泛应用于生物化学及医药研究领域。例如，核苷5' -β, Y-亚甲基及卤代亚甲基三磷酸是研究在磷酰转移酶作用机制的探针。同时，这类化合物对病毒逆转录酶抑制作用以及对嘌呤能受体的激动或拮抗作用在药物开发中也是研究热点。
[0003]鉴于该类化合物重要的生物学功能以及潜在的药物开发价值，近年来文献报道的核苷5' -β, Y-亚甲基及卤代亚甲基三磷酸的合成方法主要包括以下4种方法:1)Muller等报道的以三氯氧磷为磷酰化试剂的“一锅、三步法”；2) Cook等报道的“水杨酸亚磷酰氯法”，；3) Kolkmann等课题组报道的通过磷酰吗啉中间体的磷酰胺偶联法；4)JakemaruTaylor等课题组利用不同的缩合试剂将单磷酸及(卤代)双膦酸偶联的方法。以上的各种方法有其各自适合的核苷底物类型，但是存在反应产率一般、反应时间长、前体制备繁琐等缺点。因此，为5' -β，Y-亚甲基及卤代亚甲基三磷酸建立通用、简便和高效的化学合成方法具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为核苷5' _β，Y-亚甲基三磷酸及核苷5' _β，Y-双卤代亚甲基三磷酸的化学合成提供一种实用和高效的方法。
[0005]如图1所示，本发明涉及的合成方法是以不保护的核苷磷酰哌啶为原料，在酸性活化试剂存在的条件下，与双膦酸或双卤代双膦酸发生偶联反应。粗产物经过乙醇沉淀和离子交换凝胶色谱纯化得到20种高纯度核苷5' -β, Y-亚甲基三磷酸及β，Y-双卤代亚甲基三磷酸(6-25)，产率为71-84%。
[0006]在该方法中，使用的核苷磷酰哌啶为核苷磷酰哌啶三乙铵盐、核苷磷酰哌啶三正丁铵盐、核苷磷酰哌啶三正辛铵盐、核苷磷酰哌啶四丁基铵盐；双膦磷酸及双卤代盐可以是三(四正丁铵)盐，三(三乙铵)盐，三(三正丁铵)盐，三(三正辛铵)盐；磷酰哌啶与双膦酸的摩尔比为1:2-3 ;活化试剂为4，5-二氰基咪唑、I"-四氮唑、吡啶盐酸盐、或2，6-二甲基吡啶盐酸盐，与核苷磷酰哌啶的摩尔比例为6-10:1之间；反应溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)，、无水二甲基亚砜(DMS0)、或甲基吡咯烷酮(NMP);反应温度为20 °〇至501:，反应时间为0.5小时至4小时。所述离子交换色谱纯化为先DEAE-A25离子交换树脂纯化，再经钠离子型阳离子交换树脂转化为钠盐。
[0007]与以往文献报道的方法相比，本发明专利首次使用核苷磷酰哌啶原料，利用弱酸性催化剂，通过五价磷-氮键活化的方法，大幅度地提高双膦酸和卤代双膦酸试剂与核苷磷酰胺中间体的反应速度和产率(71-84%，0.5至4小时)，为核苷Y -β, Y-亚甲基三磷酸和核苷5' -β, Y-双卤代亚甲基三磷酸的化学合成建立了一种高效和通用的新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1.核苷5' _β，Y-(双卤代)亚甲基三磷酸的合成方法
【具体实施方式】
[0009]实施例1:
尿苷Y _β，Y-亚甲基三磷酸四钠盐6的合成:将尿苷Y -磷酰哌啶三乙铵盐(49mg,0.1 mmol)、双膦酸三(四正丁铵)盐(181 mg,0.2 mmol)、4, 5-二氰基咪唑(71 mg,0.6mmol)溶于干燥DMF中，反应体系在20 °C搅拌4 h。反应结束后，浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M,0. 5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得尿苷5' -β, gamma-亚甲基三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-A25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色尿苷5' -β，Y-亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL),经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得尿苷Y -β, Y-亚甲基三磷酸四钠盐白色固体46 mg，产率:81%。
[0010]实施例2:
腺苷5' -β，Y-亚甲基三磷酸四钠盐8的合成:将腺苷5'-磷酰哌啶三乙铵盐(52 mg,0.1 mmol)、双膦酸三(三乙铵)盐(95 mg,0.2 mmol)、4, 5-二氰基咪唑(71 mg,0.6mmol)溶于干燥DMSO中，在40 °C搅拌I h。反应结束后，浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M,0.5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得腺苷5' -β, gamma-亚甲基三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-A25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色腺苷5' -β, Y-亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL),经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得腺苷5' -β, Y-亚甲基三磷酸四钠盐白色固体43 mg，产率:72%。
[0011]实施例3:
5-溴-尿苷5' -β，Y-亚甲基三磷酸四钠盐10的合成:将5-溴-尿苷5'-磷酰哌啶三正辛铵盐(82 mg，0.1 mmol)、双膦酸三(三正丁铵)盐(145 mg，0.2 πιπιο1)、1"-四氮唑(42 mg,0.6 mmol)溶于干燥DMSO中，在20 °C搅拌24 h。反应结束后，浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M，0.5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得5-溴-尿苷5' -β, Y-亚甲基三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-A25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色5-溴-尿苷5' -β, Y-亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL)，经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得5-溴-尿苷5' -β, Y-亚甲基三磷酸四钠盐白色固体51 mg，产率:78%。[0012]实施例4:
尿苷5' -β，Y-双氟亚甲基三磷酸四钠盐16的合成:将尿苷-5'-磷酰哌啶三正丁铵盐(58 mg,0.10 mmol)、双氟代双膦酸三(三正辛铵)盐(254 mg,0.2 mmol)、吡啶盐酸盐(69 mg,0.6 mmol)溶于干燥NMP中，在40 °C搅拌I h。反应结束后，向反应液中加入异丙醚(50 mL)沉淀产物，离心得尿苷5' -β, Y-双氟亚甲基三磷酸粗品。使用DEAE-A25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色尿苷5' -β, Y-双氟亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL)，经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得尿苷5' -β, Y-双氟亚甲基三磷酸四钠盐白色固体43 mg，产率:71%。
[0013]实施例5:
鸟苷5' -β，Y-双氟亚甲基三磷酸四钠盐19的合成:将鸟苷-5'-磷酰哌啶三乙铵盐(53 mg，0.1 mmol)、双氟代双膦酸三(四正丁铵)盐(187 mg，0.2 mmol)、2，6-二甲基吡啶盐酸盐(86 mg,0.6 mmol)溶于干燥DMF中，在40 °C搅拌I h。反应结束后,浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M，0.5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得鸟苷-β, Y-双氟亚甲基三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-A25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色鸟苷5' -β, Y-双氟亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL)，经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，鸟苷5' -β, Y-双氟亚甲基三磷酸四钠盐白色固体47 mg，产率:72%。
[0014]实施例6:
胞苷5' -β，Y-双氯亚甲基三磷酸四钠盐22的合成:将胞苷-5'-磷酰哌啶四丁基铵盐(64 mg,0.1 mmol)、双氯双膦酸三(三正丁铵)盐(145 mg,0.2 mmol)、4，5-二氰基咪唑(71 mg,0.6 mmol)溶于干燥DMF中，在40 °C搅拌I h。反应结束后，浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M，0.5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得胞苷-β, Y-双氯亚甲基三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色胞苷5' -β, Y-双氯亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL)，经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得胞苷5' -β, Y-双氯亚甲基三磷酸四钠盐白色固体43 mg，产率:68%。
[0015]实施例7: 腺苷5' -β，Y-双氯亚甲基三磷酸四钠盐23的合成:将腺苷-5'-磷酰哌啶三正辛铵盐(77 mg,0.1 mmol)、双氯双膦酸三(四丁基铵)盐(193 mg,0.2 mmol)、4，5-二氰基咪唑(71 mg,0.6 mmol)溶于干燥DMF中，在40 °C搅拌I h。反应结束后，浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M，0.5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得腺苷-β, Y-双氯亚甲基三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-25离子交换树脂，以0.3^0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色腺苷5' -β, Y-双氯亚甲基三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(I mL)，经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得腺苷5' -β, Y-双氯亚甲基三磷酸四钠盐白色固体42 mg，产率:74%。
[0016]实施例8:5-溴-尿苷5' -β，Y-双溴亚甲基三磷酸四钠盐25的合成:将5-溴-尿苷-5'-磷酰哌唳三乙胺盐(57 mg,0.1 mmol)、双溴双膦酸三(四正丁铵)盐(180 mg,0.2 mmol)、4，5-二氰基咪唑(71 mg,0.6 mmol)溶于干燥DMF中，在40 °C搅拌0.5 h。反应结束后，浓缩溶剂。残留物中加入醋酸钠水溶液(10 M，0.5 mL)溶解后加入乙醇(50 mL)沉淀产物，离心得尿苷5'-三磷酸钠盐粗品。使用DEAE-A25离子交换树脂，以0.3-0.6 M碳酸氢铵溶液线性洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得白色5-溴-尿苷5'-三磷酸胺盐固体。胺盐型产物溶于去离子水(1mL),经钠离子型阳离子交换树脂交换洗脱，合并含产物液洗脱液，冻干得5-溴-尿苷5'-双溴亚甲基三磷酸四钠盐白色固体66 mg，产率:82%。
【权利要求】
1.核苷5'-β, y亚甲基及双卤代亚甲基三磷酸合成方法，其特征在于包含如下步骤:以不保护的核苷磷酰哌啶为原料，在酸性活化试剂存在的条件下，与双膦酸或双卤代双膦酸发生偶联反应；粗产物经过乙醇沉淀和离子交换色谱纯化得高纯度核苷.5' -β, Y-亚甲基三磷酸或β，Y-双卤代亚甲基三磷酸。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述核苷磷酰哌啶为核苷磷酰哌啶三乙铵盐、核苷磷酰哌啶三正丁铵盐、核苷磷酰哌啶三正辛铵盐、或核苷磷酰哌啶四丁基铵盐；双膦磷酸及双卤代盐为三(四正丁铵)盐，三(三乙铵)盐，三(三正丁铵)盐，三(三正辛铵)盐；磷酰哌啶与双膦酸的摩尔比为1:2-3 ;活化试剂为4，5- 二氰基咪唑、I"-四氮唑、吡啶盐酸盐、或2，6-二甲基吡啶盐酸盐，与核苷磷酰哌啶的摩尔比例为6-10:1 ;反应溶剂为 二甲基甲酰胺DMF、无水二甲基亚砜DMSO、或於甲基吡咯烷酮NMP ;反应温度为20 V至50°C，反应时间为0.5小时至4小时。
3.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述离子交换色谱纯化为先DEAE-A25离子交换树脂再钠离 子型阳离子交换树脂纯化。
【文档编号】C07H1/04GK103788140SQ201410035304
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】孙麒, 龚珊珊, 孙剑, 刘思, 蒲守智, 刘国栋 申请人:江西科技师范大学