蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了蚕虫草中活性物质虫草素的提取工艺。虫草素系从冬虫夏草中提取出来的一种天然核甙类新药，具有抑制肿瘤、抗疟原虫、抗真菌、抗HⅣ-I型病毒和选择性抑制梭菌的活性，引起医药学界的高度重视。但其虽能够人工合成，也能从冬虫夏草中提取，但产量很低，价格昂贵，目前其提取、纯化方法不仅操作麻烦，而且有毒有机溶剂会带来污染，不易进行大批量生产。本发明是采用双水相萃取法提取蚕虫草虫草素，不仅提取物含量高，提取率高，且省时，省力，适合工业化大规模提取。
【专利说明】蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药领域，涉及一种中药活性物质的提取工艺。
【背景技术】
[0002]北冬虫夏草(Cordyc epsmilitaris)亦称北虫草或蛹虫草,是一种国内外公认的既可食用又可药用的真菌，是寄生于夜蛾科等蛹体上的不同于冬虫夏草的另一种虫草。目前北虫草一般采用蚕蛹作寄主或大米等作培养基进行培养。国家卫生部已于2009年3月批准蛹虫草为新资源食品。蚕虫草也称桑蚕虫草或家蚕虫草，是用野生天然蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株孢子接种到5龄桑蚕上人工培育而成的虫菌结合体。
[0003]研究已证实，蚕虫草与蚕蛹草相比，虫草酸相近，虫草多糖是蚕蛹草的2.5倍，虫草素则为其4倍，只有腺苷是其I / 2;蚕虫草与冬虫夏草相比，虫草素是冬虫夏草的数百倍，腺苷也为其4倍，而虫草多糖和腺苷则是它的I / 2左右。以上比较结果说明，蚕虫草的活性成分含量优于蚕蛹草，同时也优于冬虫夏草，尤其是虫草素的含量远高于蚕蛹草和冬虫夏草。可见蚕虫草是虫草素提取的最佳原料。
[0004]虫草素学名为3'-脱氧腺苷,外文名称为3' -deoxyadenosine,系从冬虫夏草中提取出来的一种天然核甙类新药，20世纪70年代被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用；20世纪90年代研究发现，添加腺苷脱氨酶抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用。虫草素能干扰基因细胞RNA和DNA的合成，抑制癌细胞等不正常细胞的分裂，并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具；同时，虫草素还表现出极强的抗真菌、抗HIV-1型病毒和选择性抑制梭菌的活性，引起医药学界的高度重视，虫草素在美国作为抗癌、抗病毒新药已经进入三期临床。
[0005]国内外仅报道虫草素能够人工合成，也能从冬虫夏草中提取，但产量很低，价格昂贵。当前的虫草素提取、纯 化方法主要有:溶剂萃取-柱层析纯化、超声波强化提取-柱层析纯化、超临界流体萃取-超声波纯化等方法。但是溶剂萃取-柱层析纯化、超声波强化提取-柱层析纯化方法需要上柱，还需要脱色，不仅操作麻烦，而且有毒有机溶剂会带来污染；超临界流体萃取-超声波纯化虽然不进行化学反应，不生成有害物质，但所需设备特殊，不易进行大批量生产。
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺，此工艺路线操作简单、效率高，既减少了旧工艺中上柱、脱色带来的操作麻烦、又避免了上柱过程中带来的有毒有机溶剂污染，而且能够进行大批量生产、提高得率，从而降低了成本，属于绿色技术和清洁生产新工艺，解决【背景技术】中所述存在的问题。
[0007]本发明目的是通过下面的技术方案实现的:蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺，其工艺为:
[0008]I)蚕虫草经65°C烘干后，置于全封闭粉体设备中，在一定温度下采用机械挤压、撞击使固体成分乳化的方式进行粉碎；
[0009]2)将粉碎后的蚕虫草粉与取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3: I加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其沉淀物得上层清液；
[0010]3)将步骤2)得到的上层清液依次用乙酸乙酯和石油醚洗涤后，真空干燥，得虫草素。
[0011]本发明技术方案采用双水相萃取法提取蚕虫草虫草素，有别于虫草素常规的提取方法，中国专利2012510084508.5公开了一种从蛹虫草子实体中提取精制虫草素的方法，采用的技术方案是:将蛹虫草子实体粉碎后加乙醇回流提取，滤液经正丁醇萃取后上硅胶柱洗脱，浓缩后的洗脱液室温结晶即可得虫草素，此方法与中国专利00130376.7公开的虫草素提取方法类似。现有文献《Production of cordycepin by surface culture usingthe medicinal mushroom Cordyceps militaris》(Mina Masuda, Eriko Urabe,《Enzymeand Microbial Techno logy ))2006年第01期)米用Dowex-1-OH-l树脂柱从北冬虫夏草的培养滤液中分离得到虫草素。美国专利US8008060公开了一种从蛹虫草固体培养基残基中提取和纯化虫草素的方法以及制备虫草素干粉的方法，采用微波法进行提取，极大地提高了虫草素的粗提得率，达75%以上。上述文献中对虫草素的提取纯化工艺均为常规方法，工艺繁杂，且提取率不高。
[0012]本发明使用双水相萃取法，利用两种化学结构不同的亲水性高聚物或者一种亲水性高聚物与无机盐在水中以适当的浓度形成的互不相溶的两个水相体系，利用体系中多糖、蛋白质和其它生物分子在两个水相间分配系数的差异，而使得各自溶解度不同，从而进行分离。本发明工艺条件温和、处理时间短、后处理简便，不会引起生物活性物的失活和变性，又去除了组织物质和部分无效成分，延长了储存期，提高了纯度和提取率，提供了一种活性成分的新的工业化提取途径`，该法省时，省力，提取物含量高，提取率高。
【具体实施方式】
[0013]以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
[0014]实施例1
[0015]称取一定量的聚乙二醇6000溶于去离子水中，按照表1配制溶液，备用。蚕虫草经65°C烘干后，置于全封闭粉体设备中，在25°C下采用机械挤压、撞击使固体成分乳化的方式进行粉碎，将粉碎后的蚕虫草按照表1中比例量称取，用聚乙二醇6000水溶液充分溶解后，按表1中的比例加入柠檬酸铵充分振荡，静止分相，离心分离，去其沉淀物得上层清液；所得上层清液用乙酸乙酯和石油醚分别洗涤后，真空干燥，得虫草素。
ScfaS I 聚乙二醇600浓 I 聚乙二醇 6000
蚕虫草度二醇6000质量虫草素含量
比
[0016]提取物I 50 份__10%__300 份__0￡|1__69.77%
提取物 2 125 份__30% — 1000 份— 2:185.81%
提取物 3 200 份50%2000 份3:172.34%[0017]实施例2提取工艺比较
[0018]蚕虫草经65°C烘干后，置于全封闭粉体设备中，在25°C下采用机械挤压、撞击使固体成分乳化的方式进行粉碎，将粉碎后的蚕虫草按照以下不同方法提取纯化制备虫草素。
[0019]样品I (回流提取-柱层析纯化)(方法参考中国专利00130376.7):取蚕虫草400份，加5倍量30%乙醇(温度70°C )，浸泡48小时，将浸泡后的混悬液上回流装置，加热回流2小时，回收乙醇，加水沉淀，调pH3.5，24小时后过滤，将回收后的药液加水溶解进行冷藏沉淀，温度4°C，时间24小时。将冷置后的药液用微孔滤膜进行过滤(0.85i!m)滤液用
0.1mol / L调4.0备用，上离子换柱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩至粘稠状，将粘稠的液体于4°C,冷置24小时使之结晶析出，过滤,上述滤液加适量正丁醇，置4°C,冷置24小时使之结晶析出，过滤，滤液如此反复处理2-3次，将过滤所得结晶置冷冻干燥机中进行干燥，干燥后经测定后确定虫草素提取率为5.387%，得到的虫草素纯度为94%。
[0020]样品2 (超声波提取-柱层析纯化):取蚕虫草400份，加5倍量30%乙醇(温度70°C 2)混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经管道缓慢流入容器，在该管道的管壁上设有超声波发生器，他对管道内缓慢流动的混合物进行超声振荡破碎处理，处理时间为30分钟，管式分离机离心(16000r / min)，取上清液，减压浓缩至提取液Iml含Ig生药，上离子换柱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩至粘稠状，将粘稠的液体于4°C，冷置24小时使之结晶析出，析出的结晶置冷冻干燥机中进行干燥，干燥后经测定后确定虫草素提取率为62.18%，得到的虫草素纯度为36%。
[0021]样品3(超临界流体萃取-有机溶剂纯化)(方法参考中国专利01126910.3):取蚕虫草0.75kg，装入萃取釜中，采用超临界二氧化碳萃取技术，条件:50°C 2，35Mpa，20L / h，平衡15分钟后流动萃取。萃取之后进行分离，进入分离釜，分离釜压力6Mpa，30°C，在2小时后采样得水状物约40ml (下层):上层为油`状物。分三次加入10%乙醇各200ml作夹带剂，每次萃取1-2小时，萃取液540ml左右，合并加活性炭除杂，真空浓缩，得淡黄色颗粒状物235mg，虫草素含量75.05%，得率约16.79%。用有机溶剂纯化后能将虫草素含量提高到98%，得率降为8.09%。
[0022]样品4 (聚维酮-柠檬酸铵双相水系统):称取聚维酮6000溶于去离子水中，配制为浓度为20%的溶液，备用。取蚕虫草400份，加入6倍体积聚维酮水液充分溶解后，按柠檬酸铵/聚维酮6000质量比为2:1加入柠檬酸铵充分振荡,静止分相，尚心分尚，去其沉淀物得上层清液；所得上层清液用乙酸乙酯和石油醚分别洗涤后，真空干燥，得沉淀，经测定后确定虫草素提取率为57.29%，得到的虫草素纯度为78.31%。
[0023]样品5 (聚乙二醇-硫酸铵双相水系统):称取聚乙二醇6000溶于去离子水中，配制为浓度为20%的溶液，备用。取蚕虫草400份，加入6倍体积聚乙二醇水液充分溶解后，按硫酸铵/聚乙二醇6000质量比为2: I加入硫酸铵充分振荡，静止分相，离心分离，去其沉淀物得上层清液；所得上层清液用乙酸乙酯和石油醚分别洗涤后，真空干燥，得沉淀，经测定后确定虫草素提取率为53.29%，得到的虫草素纯度为88.31%。
[0024]结果明显可见用本发明方法提取最省时，省力，提取率和纯度的效价比最高，该方法为工业化提取虫草素提供了新途径。
[0025]实施例3建立测定虫草素含量的方法[0026]色谱条件色谱柱:KnauerEuropher_100C18 (5 u m, 4.6 X 250mm);流动相:乙腈-0.05mol / LKH2PO4 缓冲液(7.5: 92.5);流速:1!^ / min 检测波长:260nm ;柱温:25°C ;进样量=IOuL0
[0027]检测波长的选择取虫草素对照品适量，加甲醇制成每ImL含虫草素0.2mg的溶液，按上述色谱条件进行测定。提取对照品紫外光谱图可见，虫草素在259.3nm处有最大吸收，所以最终选择波长260nm测定虫草素。
[0028]对照品溶液的制备取在105°C下干燥至恒重的虫草素对照品适量，精密称定，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取lmL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每ImL含虫草素30 y g的溶液，作为对照品溶液。
[0029]线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1，5，10，15，20 U L注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定，以对照品溶液的进样量(ng)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。
[0030]供试液的制备取制备得到的提取物，每份约0.3g，精密称定，置已干燥至恒重的具塞锥形瓶中，加入20 %甲醇30倍，超声提取lOmin。超声提取，取出，冷却至室温，摇匀，离心，取上清液0.45 y m微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 y L进行测定，以外标法(峰面积)计算提取物中虫草素的含量。
[0031 ]实施例4提取物的鉴别及确认
[0032]取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加20 %乙醇IOmL,密塞，超声提取30min，摇匀，静置，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。另取腺苷、腺嘌呤和虫草素对照品，加20%乙醇制成每ImL含腺苷0.284mg、腺嘌呤0.lmg、虫草素0.39mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各10 ii L,分别点于同一含4%磷酸氢二钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-浓氨水(4: 4: I)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【权利要求】
1.蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺，其工艺为: 1)蚕虫草经65°C烘干后，置于全封闭粉体设备中，在一定温度下采用机械挤压、撞击使固体成分乳化的方式进行粉碎； 2)将粉碎后的蚕虫草粉与取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3: I加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其沉淀物得上层清液； 3)将步骤2)得到的上层清液依次用乙酸乙酯和石油醚洗涤后，真空干燥，得虫草素。
2.如权利要求1所述的蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺，其特征在于所述工艺步骤I)中一定温度为_50°C~30°C。
3.如权利要求1所述的蚕虫草(活性物质)虫草素的提取工艺，其特征在于所述工艺步骤2)所述聚合物为聚乙二醇、聚维酮、葡聚糖、壬苯环氧乙烯或右旋糖酐硫酸钠一种或几种的混合物，所述的盐为KH2P04、K2HP04、(NH4)2SO4、柠檬酸铵、氯化钾或硝酸钠。
4.如权利要求3所述的提 取工艺，其特征在于所述聚合物为聚乙二醇6000。
【文档编号】C07H19/16GK103772460SQ201410051001
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】韦敏, 吕晔, 郑生智, 马红 申请人:江苏省中国科学院植物研究所