靶向性抗肿瘤融合蛋白质lpo的制备和应用的制作方法

靶向性抗肿瘤融合蛋白质lpo的制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了靶向性抗肿瘤融合蛋白质LPO，它是将人工合成的目的基因片段LHRH-PEA转膜肽-ONC（简称为LPO），插入PET28a质粒中，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，表达的融合蛋白，经实验证明融合蛋白LPO对有LHRH受体的，包括结肠癌LOVO细胞、肺癌A549细胞、口腔癌KB细胞、前列腺癌PC-3M细胞等肿瘤细胞系均有明显的抑制作用，而对无LHRH受体的淋巴瘤Hut102和白血病HL60则无抑制作用，具有靶向特异性，安全可靠。
【专利说明】靶向性抗肿瘤融合蛋白质LPO的制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体地说是靶向性抗肿瘤融合蛋白质LPO及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]随着社会的发展与科技进步，人类逐渐摆脱了普通传染病的困扰，恶性肿瘤(癌症)业已成为人类生命的最大杀手。世界卫生组织最新研究数据显示，到2020年全球癌症发病率将增加50%，即每年将新增1500万癌症患者。不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅猛上升。2007年全球有760万人死于癌症，预计2030年这个数字将会增加到1320万，据国家卫计委发布的权威报告称我国新发癌症和因癌症死亡病例数分别占全球的20%和24%。所以，恶性肿瘤的治疗成了当今医学的重要任务。
[0003]核糖核酸酶(RNase)普遍存在于自然环境和人体内，它们可以通过降解细胞内的核糖核酸而杀死细胞。肝脏细胞内大约含20余种核酸内切酶和外切酶，它们参与RNA代谢、细胞成熟及凋亡、促进新生血管形成、主动防御RNA病毒等生物学作用。尽管核糖核酸酶大量存在，但由于核糖核酸酶抑制剂(RI)的抑制作用，并未对组织细胞造成伤害。
[0004]RNase A超家族主要成员有RNase A、人胰脏核糖核酸酶、嗜曙红细胞衍生神经毒素、嗜曙红阳离子蛋白 、血管生成因子、牛精液核糖核酸酶和两栖类核糖核酸酶(如豹蛙酶和牛蛙凝集素)等。RNase A超家族通过降解RNA发挥作用，其家族成员具有相似的氨基酸序列和三级结构，一般含有4对二硫键(血管生成因子含有3对二硫键)，并且都含有相同的催化三联体，包括2个组氨酸和I个赖氨酸。由于该家族的许多成员来源于人或哺乳动物，它们的免疫原性比来源于植物或微生物的要低。
[0005]豹蛙酶，起初叫做P-30蛋白，后注册名为Onconase(简称ONC)，在十九世纪70年代时，Shogen和Yoon最先在北极豹蛙的胚胎内分离提出一些带有抗癌活性的提取物。于1987年，Alfacell M分离纯化出其主要活性成分。那些活性物质是一种小的(大约12kDa)母性起源(目前大量存在于未受精的卵母细胞中)的碱性蛋白。它完整的结构在Shailendra K.Saxena等人的实验室中被确定。它由104个氨基酸残基组成，相对分子质量为1183?a，等电点为9.7，其序列与胰脏核糖核酸酶A (RNase A，EC 3.1.27.5)和核糖核酸酶超A家族的其他成员十分的相似，与RNase A有30%的碱基序列同源，并且三级结构相似，是已知的胰核糖核酸酶超家族成员中最小的单结构域蛋白。单就核糖核酸酶活性而言，RNase A要高于豹蛙酶和牛精液核糖核酸酶(BS-RNase)，但由于受到RI的抑制，RNase A对肿瘤细胞没有杀伤效果；两栖类动物体内的RNase A由于可以避开RI，故有杀伤肿瘤细胞作用。尤其是豹蛙酶，是首个进入III期临床研究的核糖核酸酶类药物，主要用于治疗恶性间皮瘤，目前治疗非小细胞肺癌的研究也已经进入了临床II期试验阶段。
[0006]ONC与已知的RNase A结构相似，由2个反向平行的β片层和3个α螺旋结构组成了的肾形核结构，其酶活性中心是一个保守的催化三联体。RobertF.Gahl等人在试验中发现ONC氧化折叠过程中会形成稳定的中间体，这样可以保持它的有效活性形式。Daniel E.Holloway等人第一个报告了在IOOK和复杂硫酸根离子中，ONC在原子分辨率下的晶体结构，在一个质量足够大的电子密度图中明显的显示出了几个非平面的肽键，可以非常容易确定其活性中心的大多数氨基酸残基。
[0007]为了确定ONC蛋白质中负责毒性的氨基酸残基，You-Di Liao等人从染色体组克隆豹娃的rpr基因，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了多种形式的表达。表达方法一:将甲硫氨酸排列在ONC重组体的N-末端，结果发现该重组蛋白热稳定性减小且催化活性和抗原性降低。他们利用依赖内源性大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶和apelB信号肽切割两种方式生产了没有甲硫氨酸的0NC，发现重组蛋白与天然来源的ONC的物理、化学、生物特性基本相符。同时证明在ONC的N-末端具有尿苷-鸟嘌呤底物偏爱性的焦谷氨酸，完整且外露的N-末端焦谷氨酸对豹蛙酶的细胞毒性有较大的帮助作用。
[0008]与RNase A相比，ONC特有的结构特征是它N端的内酰胺和C端的二硫键。豹蛙酶N端Gln反向折叠紧靠N端螺旋，与侧链Lys9的氮基和C端β片层上Val96的羰基基团形成氢键网络。Didnato等证明将Met加到豹蛙酶N端后，突变体对所有RNA的催化作用和对肿瘤细胞的毒性都显著降低，说明该环化结构对豹蛙酶的核糖核酸酶活性和细胞毒性至关重要。整个蛋白分子含有4个二硫键，其中Cys87-Cysl04形成的C端二硫键只存在于两栖类的RNase A中，是稳定其酶活性的一个重要结构域。ONC是一种结构稳定性很强的蛋白，在PH6.0时变性温度可以达到90°C，药物体内半衰期也可长达3h。除了 N端内酰胺和C端二硫键外，酶分子内部的疏水环境也起到了稳定构象的作用，这很有可能是导致它的RNA酶活性和肾毒性的重要原因。突变体(M23L)-ONC完全保留了抗肿瘤活性，有可能降低肾毒性但稳定性有所降低。
[0009]YouNeng Wu等人用I125标记0NC，并使ONC结合在人工培养的9L神经胶质瘤细胞的特殊结合位置。经Scatchard方法分析标记结果,证明ONC与9L神经胶质瘤细胞的结合位点有两个，其解离常数分别为Kd = 6.2 ΧΙΟ—8和Kd = 2.5 ΧΙΟ—7。每细胞可以结合3 X IO5个ONC分子，低位结合位点的解离常数与IC50相似，ONC结合在细胞上扩大培养，温度从4 °C升高到37°C，可以增加细胞对ONC毒性的敏感性。代谢抑制剂、叠氮钠和脱氧葡萄糖可以抑制ONC的细胞毒性，而莫能菌素可以使细胞毒性增大十倍。因为对于ONC毒性来说，ONC分子烷基化是核糖核酸酶活性的必要条件，可以增强抑制细胞内蛋白合成能力。在9L细胞中ONC抑制蛋白质合成恰巧与细胞内的降解相符合，作用靶标均为28s和18sRNA亚基。与核糖核酸酶A相比，ONC能抵抗两种RNA酶的降解，一种是胎盘核糖核酸酶，另一种是ACETM抑制剂。
[0010]Robert F.Gahl等人证明了 ONC是一种特殊的RNA酶，它具有选择性细胞毒性。ONC的细胞毒性依赖于AP-2/网格蛋白介导的内吞作用，通过内吞小泡的内化作用进入细胞，降解细胞的RNA从而杀死细胞。Intae Lee等在A549人肺癌移植的裸鼠身上研究核糖核酸酶ONC的抗癌作用时发现ONC是通过分解t-RNA来阻止蛋白质合成作用方式来杀死肿瘤细胞的，这也许可以作为一种替代顺钼治疗肺癌的新型方式。
[0011]ONC能够明显地抑制A549肿瘤细胞的生长，且具有显著的剂量依赖性。在动物实验中，多次给予小剂量的ONC比一次性大剂量有效，而且副作用少。ONC与顺钼联合用药的方式能更加显著的减少肿瘤细胞生长,但对 于相对较大的肿瘤体来讲,ONC可以抑制肿瘤细胞的生长，然而顺钼则不能。[0012]Shailendra K.Saxena等研究表明ONC的细胞毒性主要是针对tRNA的降解。他们将ONC加入到正在生长的哺乳动物细胞培养基中能产生诸如细胞抑制性、细胞毒性和抗病毒活性作用，ONC进入活的哺乳动物细胞中可以有选择性的并且不被察觉的分解tRNA。此外，ONC可以在体外专一性的利用网织红细胞裂解液和纯净RNA底物，而在体内显示出对tRNA降解的惊人专一丨生,而rRNA和mRNA却完好无损。
[0013]Mihail S.1ordanov等在研究ONC诱导细胞凋亡的分子决定簇时，表明其对细胞的毒性机制不同于蛋白质合成抑制作用。ONC作用的细胞出现凋亡，同时伴随细胞皱缩，细胞核固缩乃至破裂(核裂解)，核内DNA发生裂解，同时激活半胱-天冬氨酸酶，现有证据证明ONC存在一种诱导细胞凋亡的机制，该凋亡机制可以独立抑制蛋白合成。使用半胱-天冬氨酸酶抑制剂节氧羰基-Val-Ala-Asp (OMe,奥美拉唑)氟酮(zVADfmk),在一定的浓度时可以完全阻止ONC引起的细胞凋亡。由此可见，ONC对细胞的毒性作用只要表现在两方面:首要作用是降解细胞的tRNA抑制细胞蛋白质合成，引起细胞死亡，次要作用启动细胞的凋亡机制，引起细胞凋亡。因此，ONC可以作为强有力的抗癌药物候选蛋白。由于ONC通过内吞作用进入细胞，对细胞的选择性较差，在成药性研究方面不得不考虑其对人体正常细胞的杀伤而引起较大的副作用。
[0014]基于上述原因，我们在药物设计方面进行了较大改进，为使ONC在体内发挥最大的肿瘤细胞杀伤作用，减小副作用，必须使ONC分子有效地选择肿瘤细胞，同时增加ONC进入细胞的效率。
[0015]基于受体-配基的特异性结合理念，使用LHRH受体的配基LHRH(亦称为GnRH)的类似物进行靶向抗肿瘤药物的导向组分加以利用成为当前抗肿瘤药物设计的一个重要方向。
[0016]使用LHRH的激动剂和抑制剂进行性腺依赖性前列腺癌治疗已经有30余年的历史，如1982年Schally等撰文说明应用合成的LHRH激动剂类似物治疗前列腺癌获得了重大成就，一方面减轻了患者物理去势的精神负担，而且获得了满意的肿瘤抑制和治疗作用。
[0017]在癌组织表面高亲和力的`LHRH受体是通过一些未知的原因演变而来的。这种假设已经在鼠身上初步得到证实，在正常的仓鼠胰腺细胞膜上用RLA法测不到LHRH受体，经诱导产生胰腺肿瘤后，在相应的细胞膜上测到了高亲和力的LHRH受体，而且在成瘤初期即可检测到。通过RT-PCR法、免疫组化定位法和放射性配体分析法(RLA)等多种方法检测证明了 LHRH受体是癌组织、细胞的新靶标。Kakar (1995)在乳腺癌和前列腺癌组织及子宫内膜癌和卵巢癌组织和细胞株中发现了与垂体相似的高亲和力LHRH受体，并提出86%的前列腺癌、50%的乳腺癌及80%的卵巢癌和子宫内膜癌有高亲和力LHRH受体分布。
[0018]我们通过长期新药研究工作和国外众多文献证明促黄体激素释放激素受体(LHRHR，亦称为促性腺激素释放激素受体，GnRHR)在肿瘤组织细胞表面呈特异性分布，已确认为肿瘤的新靶标。
[0019]以LHRH为靶向的抗肿瘤药物的设计是基于配基-受体特异性结合及受体在肿瘤细胞表面超表达的事实而确立的。
[0020]人LHRHR是由328个氨基酸组成的单链蛋白质，它形成胞外和胞内环形结构相连的7个跨膜区，具有G蛋白偶联受体的结构特点。LHRH受体最早发现于垂体，承接下丘脑产生的促黄体激素释放激素(LHRH)，促使垂体分泌促性腺激素LH和FSH，后两者作用于性腺，从而发挥对性腺功能的调节作用。近年来随着对LHRH及其受体研究的深入，越来越多的临床和实验证据表明LHRH受体在癌组织中呈现特异性广泛分布。
[0021]Bono等(2002)研究了前列腺癌变及良性标本上LHRHR的分布及特征，同时测定并比较了多种组织中LHRH受体mRNA的表达，结果显示86%的癌变标本膜蛋白对[DTrp6]LHRH表现特异性高亲和力，同时有86%的前列腺癌细胞表面表达LHRH受体，在良性前列腺组织中亦可见LHRH受体基因表达，但其含量和亲和力显著低于癌变组。
[0022]S.Dharap等(2005)用定量RT-PCR检测并分析了编码LHRH受体的cDNA在多种细胞、组织匀浆中的基因含量及受体蛋白表达量。测定了人卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌以及多种正常器官组织包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺和骨骼肌中(包括同一患者的卵巢癌组织和正常组织)LHRH受体的含量。结果表明在肿瘤细胞内LHRH受体的基因是丰富的且受体蛋白是超表达的，然而在心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺和骨骼肌等正常组织细胞中却没有检测到LHRH受体基因，同时亦未检测到受体蛋白表达。
[0023]Grundker (2002)、Schally (2005)利用合成的 LHRH 类似物[DLys6]作为导向物，以阿霉素或其衍生物为药物组分，偶联成3种LHRH-阿霉素(DOX)或其衍生物:AN152、AN201、AN207，这些药物可以通过LHRH特异性结合肿瘤细胞，并通过阿霉素或阿霉素衍生物发挥细胞毒性作用，特异性杀灭肿瘤细胞，其抑瘤效果远远优于单纯LHRH类似物和阿霉素或其衍生物，并大大延长了荷瘤裸鼠的生存时间和存活数量。而且与单纯阿霉素使用相t匕，用药剂量可以提高到阿霉素的5倍以上(摩尔剂量比)。该项目作为德国、美国政府资助项目已经完成了一期临床试验，单日用药剂量达到267mg/m2，在乳腺癌、前列腺癌治疗方面获得了一致认可(参见美国专利5843903)。同时他们还进行了特异性RT-PCR和RLA检测LHRHR的分布表明:LHRH受体主要分布在多种肿瘤组织、细胞表面，正常的卵巢、子宫内膜、输卵管等生殖系统器官中仅含极痕量的受体，其它正常组织如心脏、肝脏、肺脏、肌肉和骨骼等均无LHRH受体的分布。
`[0024]我们在抗癌新药LHRH-PE40的研发过程中进行的靶标确认实验，确定了口腔癌、鼻咽癌、食管癌、肺癌、肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、人黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、上皮癌等多种肿瘤细胞表面含有高亲和力LHRH受体(参见中国专利ZL99122205.9)。
[0025]我们进行的LHRH-PE40药效学研究，发现荷瘤裸鼠利用LHRH-PE40尾静脉给药治疗，抑瘤率达到60%以上，合成的LHRH类似物+LHRH-PE40混合物赋予荷瘤裸鼠，抑瘤率降为40%，单纯给予LHRH类似物，荷瘤裸鼠的抑瘤率为23%，这个实验说明LHRH-PE40通过LHRH结合肿瘤细胞表面的LHRHR，将药物特异性作用于肿瘤组织，达到肿瘤治疗作用，LHRH类似物+LHRH-PE40混合物治疗荷瘤裸鼠，抑瘤率降低说明LHRH类似物可以竞争性的结合LHRH受体，阻止LHRH-PE40的抑瘤作用。单纯LHRH类似物也具有一定的抑瘤作用，只不过抑瘤效率相对较低。这些实验充分说明了 LHRH作为肿瘤靶向治疗的实用性意义。

【发明内容】

[0026]本发明的目的是提供靶向性抗肿瘤融合蛋白质LP0。
[0027]基因片段，它的喊基序列如序列表SEQ ID NO:1所不；
融合蛋白质LP0，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示；融合蛋白质LPO的制备方法，它包括:
1)人工合成如序列表SEQID NO:1所示的基因；
2)利用Nco1、EcoRI双酶切PET28a质粒和序列表SEQID NO:1所示的基因，连接，构建质粒PET28a-Z/^转JM109工程菌扩增；
3)阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达；
4)纯化。
[0028]本发明的另一个目的是融合蛋白质LPO在制备抗肿瘤中的应用；
所述的肿瘤为有LHRH受体的肿瘤；
所述的肿瘤为结肠癌L0V0、肺癌A549、口腔癌KB或前列腺癌PC-3M。
[0029]发明详述，综合我们多年基础研究和LHRH-PE40新药研究以及国外同行研究经验，我们认为LHRH可以作为抗肿瘤药物的靶向分子加以利用，在知识产权不冲突的情况下，我们利用设计更为合理的LHRH类似物-抗肿瘤药物组合物，开发抗肿瘤新药。
[0030]首先在LHRH类似物的选择上我们进行了大量的筛选工作，基于天然LHRH为十肽的活性多肽链，PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,由于首位氨基酸为焦谷氨酸，基因工程表达合成有一定难度，世存类似物大多缺省或将之突变为谷氨酸，但经过我们多年基因表达LHRH-毒素融合蛋白的经验和后续的药理药效活性试验，证明首位氨基酸突变为谷氨酰胺更能发挥其受体识别、结合能力，故此，我们设计合成了首位氨基酸突变为谷氨酰胺的密码子。再由于天然LHRH第六位氨基酸为甘氨酸，其受体亲合力较低，体内半衰期仅为5min，所以我们将其第六位甘氨酸也进行了人为突变，利用色氨酸(Trp)替代甘氨酸，其受体结合能力提高7-10倍，半衰期达到2小时，有利于药物在体内的完整性和长效性，参考绿脓杆菌外毒素A和白喉毒素结构特点和入胞机制，在LHRH的C末端加入一个公认的转膜肽，使之尾部形成Furin酶切识别位点，一旦药物组合物结合到肿瘤细胞表面，在受体作用下形成内吞小泡时，内吞小泡中的Furin酶在pH5.2时发挥酶切作用，将抗肿瘤药物主动转运至肿瘤细胞内。
[0031]本文中所使用术语“LP0”，是指经过详细的设计，利用基因合成技术获得基因序列和片段，经过基因工程操作使之能够在大肠杆菌中获得高效表达，纯化的蛋白质能够在体内外具有靶向抗肿瘤作用的蛋白质。
[0032]文中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号，其中为了基因连接方便在基因合成时于融合基因5'端添加了 NcoI限制性内切酶识别位点，并利用NcoI限制性内切酶识别位点中的ATG作为首位启动密码子，翻译表达融合蛋白首位氨基酸Met。同时在融合的蛋白基因的3'端加入限制性内切酶EcoRI的识别序列GAATTC，以便使基因片段和载体连接时均形成粘性末端，利于基因连接。为使表达产物达到高效表达，将大肠杆菌偏性密码子引入到其中，以使表达产物适合在大肠杆菌中表达。
[0033]本文中所使用术语“IC50”是指利用中国生物制品规程所描述的生物制品对肿瘤细胞活性检定标准方法测定的半数细胞致死浓度，即利用体外培养的人肿瘤细胞达到半数抑制时药品的浓度(参考中国药典附录，抗肿瘤药物生物活性测定法，其浓度以μ g/ml表示)。
[0034]本发明进一 步涉及以重组DNA技术生产多种类蛋白质或多肽串联融合表达目的蛋白质的方法，该方法包括:⑴提供携带T7强启动子且含有多克隆位点的表达载体；⑵人工合成基因串联连接的编码基因序列，以正确的阅读框架将其克隆到线性化的步骤(1)的表达载体中用步骤(2)的表达载体转化适当的宿主细胞；⑷在适于表达融合蛋白质的条件下培养所说的被转化的宿主细胞；(5)从细胞培养物中利用适当的纯化工艺回收并纯化所说的融合蛋白质。
[0035]用于构建本发明的融合蛋白质的LPO分子是以N端Met为起始的蛋白质分子，增加酶切位点后，为了调整0RF，在ATG密码子后增加了 Gly的密码子GGC，其后是LHRH的序列，为了增加LHRH与其受体的结合能力和延长其半衰期，将LHRH序列中第六位氨基酸由Gly替换为Trp。完整的LHRH十肽序列之后紧接着连接PEA的转膜和furin酶识别的十肽序列，最后连接ONC的104个氨基酸，并以终止密码子TAA结束。
[0036]由于暂时缺乏作为本发明融合LPO分子的现成序列，所以在本发明中使用通用的DNA合成仪在1000A固相载体上合成编码这些融合蛋白的核苷酸序列。为了便于与特定重组载体进行连接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入适当的核酸内切酶(如NcoI和EcoRI)酶切位点，并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术，克隆编码这些合成的阅读框架通畅的基因(或以其cDNA或基因组DNA形式)，DNA重组操作中，一般使用标准的基因克隆和亚克隆技术进行基因片段的转移和连接。使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变，最后以DNA测序进行序列确认。
[0037]这里应特别指出的是，由于相对于LHRH分子来讲，融合表达的转膜肽和ONC部分分子量偏大，所以由三者产生的融合蛋白质中很可能形成新的高级空间构象，导致前导部分的卷曲被包裹，影响ONC的活性和空间构像。然而通过技术人员计算机分析和园二色谱检测证明LPO蛋白质分子是以正确的二硫键形式进行折叠的。
[0038]重组蛋白质基 因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上，如连接到适于在大肠杆菌中使用的T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法，如适于原核细胞的氯化钙处理法或适于哺乳动物细胞的电穿孔法将本发明的重组质粒转化到选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质，即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如，可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶和超声波裂解之，然后超速离心并在低浓度磷酸盐(20mM)、尿素溶液中进行包涵体洗涤，然后利用8M尿素裂解包涵体，获得的蛋白质通过复性剂存在下恢复天然结构。然后依次经离子交换层析(IEC)和疏水层析、凝胶过滤层析纯化所需的LPO重组蛋白质。
[0039]一般说来，使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法分析各柱层析洗脱部分，并以免疫印迹法监测之。对重组融合蛋白质纯化产物进行肿瘤细胞抑制试验以检测重组蛋白质的生物学活性(具体操作见中国生物制品规程2010版)。
[0040]可将本发明的LPO蛋白质作为基本活性成分，并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床应用的药物组合物。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲液、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据所治疗的疾病的不同，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的蛋白质有辅助或协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物。另外，可在本发明的药物组合物中加入低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白质保护剂，以及聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。[0041]可以通过常规给药途径，特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物，例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几毫微克至几十毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量将根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、对药物的反应能力及给药方式等因素而定。
[0042]我们的实验室已证明本发明的LPO蛋白质对包括结肠癌LOVO细胞、肺癌A549细胞、口腔癌KB细胞、前列腺癌PC-3M细胞等肿瘤细胞系均有明显的抑制作用，而对无LHRH受体的淋巴瘤Hutl02和白血病HL60则无抑制作用。
【专利附图】

【附图说明】
[0043]图1显示用于表达融合蛋白的重组质粒构建图。
【具体实施方式】
[0044]以下借助实施例进一步阐明本发明，但本领域技术人员可以意识到，这些实施例并不构成对本发明待批权利 要求范围的限制。
[0045]实施例1:LP0表达载体和工程菌的制备 重组表达质粒的构建与鉴定
a.基因合成:本发明中按照前文所述的设计理念进行酶切位点和LPO全基因序列的设计并人工体外合成如下序列:
NcoI内切酶识别序列(CCATGG)+GC+LHRH多肽基因+PEA转膜肽+ONC序列+终止密码子(TAA)+EcoRI内切酶识别序列(GAATTC)，基因序列见SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大连Takara公司提供的T载体中，并转化大肠杆菌JM109细菌，经PCR鉴定确定阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，常规分子克隆技术提取质粒DNA，利用NC01、EC0RI双酶切本质粒和PET28a质粒，回收目的片段和PET28a质粒载体粘性末端片段，以正确的阅读框架在T4连接酶(Promega)存在下将目的片段插入到同样酶切的PET28a质粒载体中，构建融合蛋白双链表达基因并转化JM109工程菌。
[0046]b.经PCR鉴定确定阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，常规分子克隆技术提取质粒DNA，利用Nco1、EcoRI双酶切PET28a_LP0质粒进行鉴定，正确者进行DNA测序，然后阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，并将被转化的细菌培养于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培养基中，以扩增质粒DNA。培养完成后，破碎细胞，离心收集质粒并纯化质粒DNA测序，测序正确的质粒将被转化大肠杆菌菌株，用酶切鉴定法和琼脂糖凝胶(2%)电泳法进行鉴定，然后阳性重组质粒进行DNA序列分析。
[0047]图1:显示了重组质粒pET28a_LP0的构建。
[0048]实施例2 =LPO融合蛋白质的表达及产物的纯化:
将携带重组基因质粒转化的大肠杆菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培养在含有卡那霉素(50μ g/ml)的LB琼脂平皿上。培养后挑选卡那霉素抗性菌落，于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培养基中37°C培养，当A_达到约0.4^0.6时加入ImM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度lmM)，37°C继续培养3-4小时，以诱导目的产物的表达。然后离心分离细胞和培养基，并将含有目的蛋白质的菌体中加入缓冲液成分，终浓度达 50mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA,超声破碎，4°C离心(20，000g, 30 分钟)，取沉淀(不可溶性部分)即为融合蛋白粗提物。
[0049]粗提物经过洗涤、变性-复性处理，获得的复性蛋白质进行离子交换层析纯化:缓冲液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱(Pharmacia),用含有 O~0.5M NaCl 的 TE 缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0, ImM EDTA)连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分。目的组分峰部分经小型中空纤维超滤器(Milipore)作用30分钟超滤浓缩换液加盐后，使浓缩物含终浓度 1.15M NaCl，用 20mM Tris-HCl, ρΗ8.0, 1.15Μ NaCl 缓冲液平衡 XK 1.6X20cmPhenyl-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),然后上样、缓冲液洗漆流川峰,最后利用含有 1.15M -0.05M NaCl 的缓冲液(20mM Tris *HC1, pH8.0)进行 100%_0% 梯度洗脱。收集目的蛋白峰部分，利用小型中空纤维超滤器(Milipore)浓缩目的蛋白至2mg/ml。利用20mMPB, pH7.0,0.15M NaCl 缓冲液平衡 XK 1.6X 100cm Superdex75 凝胶过滤柱(Pharmacia),利用上样环注入样品5ml,流速lml/min进行凝胶过滤分离纯化,收集蛋白质峰值(A28tl)部分于-20°C下储存备用。如此纯化的蛋白质纯度>97%。
[0050]实施例3:利用体外培养的肿瘤细胞抑制法测定融合蛋白的生物学活性作用，(具体操作参考中国药典2010版第三部附录XC)。
[0051]细胞病变抑制试验:
将培养的人肿瘤细胞单层细胞经胰蛋白酶消化，吹打收集细胞悬液，利用细胞计数板记数后，调整细胞数量为60000个/ml，按照80 μ I/孔加入到96孔培养板中(每孔5000细胞)，5% 0)2，371:条件下培养411。调整制备的LPO蛋白质样品浓度为lmg/ml，定量的样品经过滤除菌，按等倍稀释法将不同量的样品加入各细胞孔中，然后补足培养基，使之总体积为100 μ 1， 5% C02，37°C条件下培养24h。然后弃去细胞板中上清液，每孔加入50 μ I染色液，室温放置30min后,用流水冲去染色液,并吸干残留水分,每孔加入脱色液100 μ 1，室温放置5min，混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm出测定吸光度，记录测定结果。
`[0052]实验数据采用计算机程序进行参数回归计算:对各实验样品的各实验点OD值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序进行处理。分别计算各实验样品的半效稀释倍数并计算50%效应点的浓度(结果下表)。
【权利要求】
1.基因片段2/--，它的碱基序列如序列表SEQID NO:1所示。
2.融合蛋白质LPO，它的氨基酸序列如序列表SEQID N0:2所示。
3.融合蛋白质LPO的制备方法，它包括: 1)人工合成如序列表SEQID NO:1所示的基因； 2)利用Nco1、EcoRI双酶切PET28a质粒和序列表SEQID NO:1所示的基因，连接，构建质粒PET28a-Z/^转JM109工程菌扩增； 3)阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达； 4)纯化。
4.权利要求2所述的融合蛋白质LPO在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根椐权利要求4所述的应用，其特征在于:所述的肿瘤为有LHRH受体的肿瘤。
6.根据权 利要求5所述的应用，其特征在于:所述的肿瘤为结肠癌L0V0、肺癌A549、口腔癌KB或前列腺癌PC-3M。
【文档编号】C07K19/00GK103820479SQ201410082513
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月8日 优先权日:2013年12月21日
【发明者】张国利, 史飞, 李泽鸿, 田园, 刘雨玲, 岳玉环, 吴广谋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所