从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点，步骤为：1)取待检测样品液，点样于高效薄层硅胶板上，同时，将标准液点样于同一块高效薄层硅胶板；展开剂加入展开缸中进行预平衡，后将高效薄层硅胶板放入展开缸中进行二次展开，取出晾干；2)烘烤染色；3)利用薄层扫描仪进行薄层层析扫描，得到胞壁酸Rf(比移值)和峰面积积分值；同时，计算出标准液质量和峰面积积分值的关系的回归方程，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中胞壁酸的质量浓度。本发明还提供了一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，通过洗涤、脱脂、酸解、萃取等对菌渣的各种处理，得到了纯化的胞壁酸。
【专利说明】从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，以及胞壁酸的薄层层析检测方法。
【背景技术】
[0002]胞壁酸是细菌细胞壁中肽聚糖的组成成分。
[0003]谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是好氧细菌,棒状,有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或成八字排列，菌体0.7?0.9微米X 1.0?2.5微米，革兰氏阳性，无芽孢，可用于微生物发酵工程生产谷氨酸并进而制取谷氨酸钠(味精)。谷氨酸发酵废醪菌渣是味精工业的主要副产品，每年产量可达上百万吨，主要用作肥料和饲料加工，价格低廉。以谷氨酸发酵废醪菌渣为原料，检测并提取纯化胞壁酸，可大幅度提升综合利用价值，提高经济效益和社会效益。目前尚未见到以谷氨酸发酵废醪菌渣为原料提取纯化胞壁酸的报道。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取纯化胞壁酸的方法，本发明还提供了一种胞壁酸的薄层层析检测方法。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，步骤如下:
[0007]I)取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(谷氨酸发酵废醪菌渣，即原料菌渣)，放在容器中，先用质量浓度为0.9%的生理盐水在室温多次(2?5次)洗涤菌渣，以除去异臭味和易溶物质，过滤，得滤渣；
[0008]进一步地，用生理盐水洗涤后，若滤渣还有异臭味，则向滤渣中加入蒸馏水，在温度55°C并伴随搅拌下洗涤菌渣(可通过恒温磁力搅拌器实现)，洗涤2?5次，过滤，得滤渣；
[0009]2)将步骤I)所得滤渣放入封闭容器，加入原料菌渣质量3?5倍的质量浓度为10%的三氯乙酸溶液，在温度45?60°C下，搅拌15min?Ih (可通过恒温磁力搅拌器实现，搅拌速度优选中速)，以裂解菌体，去除磷壁酸，过滤，得滤渣；
[0010]3)将步骤2)所得滤渣用蒸馏水洗涤I?2次，以除去三氯乙酸，然后依次用原料菌渣质量2?10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液(甲醇、氯仿按体积比1:1混合而成)、氯仿洗涤脱脂，各2次；得脱脂滤渣；
[0011]4)向步骤3)所得脱脂滤渣中加入浓度为5?8mol/L的盐酸，按每克原料菌渣加入4?10毫升盐酸，置于水浴中，在温度90?100°C下酸解4?8h ;酸解后，得棕黑色的酸解液，将酸解液在真空旋转蒸发仪上浓缩蒸干(50?65°C )，以尽量挥去盐酸，得胞壁酸粗品;
[0012]优选的，所述将酸解液在真空旋转蒸发仪上浓缩蒸干的温度为50?65°C ；
[0013]5)步骤4)所得胞壁酸粗品，用蒸馏水溶解，加入氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，弃去下层有机相(有机相中含有亲脂性和两性的杂质)，再加入氯仿萃取I?3次，得上层溶液；
[0014]优选的，所述蒸馏水的用量为原料菌渣质量的2?4倍，氯仿用量为蒸馏水体积的5?10倍；
[0015]6)将步骤5)所得上层溶液蒸发挥干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附I?3次，至溶液变为无色透明，即得胞壁酸溶液，浓缩干燥，得胞壁酸；
[0016]优选的，所述活性炭选用型号303糖用活性炭，每次的活性炭用量为原料菌渣质量的0.5?1.5倍。
[0017]一种胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，步骤如下:
[0018]I)取待检测样品液(即上述方法制备得到的胞壁酸溶液)，点样于高效薄层硅胶板上，同时，将不同浓度的标准液点样于同一块高效薄层硅胶板；展开剂加入展开缸中进行预平衡，后将高效薄层硅胶板放入展开缸中进行二次展开，取出晾干；
[0019]所述高效薄层娃胶板选用IOcmX IOcm的GF254高效薄层娃胶板；
[0020]所述待检测样品液的点样量为10 μ L/点；
[0021]所述标准液为5种不同浓度的标准液，浓度分别为2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mg/ml,点样量为I μ l/点；
[0022]所述展开剂为甲醇-丙酮-乙酸-水-异丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为4?6:2?4:0.5?1:0.5?1:0.5?2 ;
[0023]所述展开剂预平衡和硅胶板展开过程的温度为25°C，20分钟，二次展开，每次展距8cm(每次都是从原点计)。
[0024]2)将质量浓度为I %的茚三酮乙醇溶液喷到高效薄层硅胶板上进行烘烤染色；
[0025]进一步地，所述染色的烘烤温度为110°C，时间5min ；
[0026]3)利用薄层扫描仪进行薄层层析扫描，得到胞壁酸Rf (比移值)和峰面积积分值；同时，计算出标准液质量和峰面积积分值的关系的回归方程(通过薄层色谱仪管理软件计算出，为常规手段)，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中胞壁酸的质量浓度。
[0027]本发明在进行薄层层析时，为取得有效效果，对展开剂进行了许多探索，并利用不同的试剂组合:丙酮-水；异丙醇-冰乙酸-水；正丁醇-甲苯-冰乙酸-水；正丁醇-冰乙酸-异丙醇；正丁醇-甲苯-冰乙酸-水；异丙醇:乙酸冰:甲醇和甲醇:丙酮:乙酸冰:异丙醇等。每一种组合，都进行了多次的比例调试，最后，发现以甲醇-丙酮-乙酸-水-异丙醇，体积比为4?6:2?4:0.5?1:0.5?1:0.5?2配比的展开剂和展开温度25°C时展开效果较佳，以甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为5:3:1:1:1时最佳。
[0028]本发明的从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，除去了菌渣中的杂质，得到了纯化的胞壁酸。本发明的胞壁酸的薄层层析检测方法，具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0030]实施例1提取胞壁酸并进行薄层层析检测
[0031]提取:取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(原料菌渣)5克，放在150ml烧杯中，先用0.9 %的生理盐水在室温下多次洗涤菌渣，除去异臭味，过滤，得滤渣，转入200ml三角瓶中，加入25mll0%的三氯乙酸溶液，用恒温磁力搅拌器在55°C、适当转速下进行搅拌30min，以裂解菌体，去除磷壁酸，过滤，除去滤液，用蒸馏水洗涤残渣以洗去三氯乙酸，然后依次用50ml甲醇、50ml甲醇-氯仿混合液(甲醇与氯仿按体积比1:1混合而成)、50ml氯仿洗涤脱脂，各2次，得脱脂滤渣；加入6mol/L的盐酸50ml，在水浴锅95°C加热酸解5h，得棕黑色的酸解液；将棕黑色的酸解液在旋转蒸发仪浓缩50°C蒸干，以尽量挥去盐酸，用20ml三蒸水溶解，加入IOOml氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，除去下层亲脂性和两性的杂质；再加入氯仿萃取2次，每次氯仿用量为100ml，得上层溶液；蒸发挥干，用30ml的甲醇溶解，加入5g303糖用活性炭混合吸附3次，至溶液变为无色透明，得胞壁酸溶液。
[0032]检测:取胞壁酸溶液1ml，稀释15倍，得样品液。配制胞壁酸的标准液，浓度分别为:0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。将样品液(10 μ L/点)和标准液(I μ L/点)点于同一块GF254高效薄层娃胶板(IOcmXlOcm)上。展开剂为甲醇-丙酮-冰乙酸-水-异丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为5:3:1:1:1。将展开剂加入展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)在25°C下预平衡20分钟。高效薄层板放入展开缸中，在25°C下展开，展距达到8cm时，将硅胶板板取出晾干。然后再次放回展开缸二次(从原点计)展开8cm，展开结束后，将硅胶板板取出晾干。用质量浓度为I %的茚三酮乙醇溶液喷板染色,然后置于110°C下烘烤5分钟。样品液和标准品对应的点染成红色。用camag3型薄层扫描仪，以492nm的吸收波长扫描，得到峰面积积分值和胞壁酸迁移值Rf为0.84，薄层扫描仪软件winCATSl.4.1统计计算峰面积积分值与标准液质量的关系的回归方程，相关性Y =16.854X+4572.2，r = 0.9991RSD = 1.53%。经检测和计算，得谷氨酸棒状杆菌菌渣中胞壁酸含量为L 10g/100g。
[0033]实施例2提取胞壁酸并进行薄层层析检测
[0034]提取:取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(原料菌渣)5克，放在150ml烧杯中，先用
0.9 %的生理盐水在室温下多次洗涤菌渣，除去异臭味，过滤，得滤渣，转入200ml三角瓶中，加入15111110%的三氯乙酸溶液,用恒温磁力搅拌器在45°C、适当转速下进行搅拌15分钟，以裂解菌体，去除磷壁酸，过滤，除去滤液，用蒸馏水洗涤残渣以洗去三氯乙酸，然后依次用IOml甲醇IOml甲醇-氯仿混合液(甲醇与氯仿按体积比1:1混合而成)、IOml氯仿洗涤脱脂，各2次，得脱脂滤渣；加入5mol/L的盐酸20ml，在水浴锅90°C加热酸解4h，得棕黑色的酸解液；将棕黑色的酸解液在旋转蒸发仪浓缩50°C蒸干，以尽量挥去盐酸，用IOml三蒸水溶解，加入50ml氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，除去下层亲脂性和两性的杂质；再加入氯仿萃取2次，每次氯仿用量为50ml，得上层溶液；蒸发挥干，用30ml的甲醇溶解，力口入2.5g303糖用活性炭混合吸附3次，至溶液变为无色透明，得胞壁酸溶液。
[0035]检测:取胞壁酸溶液1ml，稀释15倍，得样品液。配制胞壁酸的标准液，浓度分别为:0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。将样品液(10 μ L/点)和标准液(I μ L/点)点于同一块GF254高效薄层娃胶板(IOcmX IOcm)上。展开剂为甲醇-丙酮-冰乙酸-水-异丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为4:2:0.5:0.5:0.5。将展开剂加入展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)在25°C下预平衡20分钟。高效薄层板放入展开缸中，在25°C下展开，展距达到8cm时，将硅胶板板取出晾干。然后再次放回展开缸二次(从原点计)展开8cm，展开结束后，将硅胶板板取出晾干。用质量浓度为I %的茚三酮乙醇溶液喷板染色，然后置于110°C下烘烤5分钟。样品液和标准品对应的点染成红色。用camag3型薄层扫描仪，以492nm的吸收波长扫描，得到峰面积积分值和胞壁酸迁移值Rf为0.84，薄层扫描仪软件winCATSl.4.1统计计算峰面积积分值与标准液质量的关系的回归方程，相关性Y =4113.9915+30.0484*X, r = 0.99953RSD = 3.71%。经检测和计算，得谷氨酸棒状杆菌菌渣中胞壁酸含量为1.16g/100g。
[0036]实施例3提取胞壁酸并进行薄层层析检测
[0037]提取:取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(原料菌渣)5克，放在150ml烧杯中，先用
0.9 %的生理盐水在室温下多次洗涤菌渣，除去异臭味，过滤，得滤渣，转入200ml三角瓶中，加入20ml 10%的三氯乙酸溶液，用恒温磁力搅拌器在60°C、适当转速下进行搅拌I小时，以裂解菌体，去除磷壁酸，过滤，除去滤液，用蒸馏水洗涤残渣2次以洗去三氯乙酸，然后依次用30ml甲醇、30ml甲醇-氯仿混合液(甲醇与氯仿按体积比1:1混合而成)、30ml氯仿洗涤脱脂，各2次，得脱脂滤渣；加8mol/L的盐酸30ml，在水浴锅100°C加热酸解8h，得棕黑色的酸解液；将棕黑色的酸解液在旋转蒸发仪浓缩65°C蒸干，以尽量挥去盐酸，用15ml三蒸水溶解，加入90ml氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，除去下层亲脂性和两性的杂质；再加入氯仿萃取2次，每次氯仿用量为90ml，得上层溶液；蒸发挥干，用20ml的甲醇溶解，力口入7.5g303糖用活性炭混合吸附3次，至溶液变为无色透明，得胞壁酸溶液。
[0038]检测:取胞壁酸溶液1ml，稀释15倍，得样品液。配制胞壁酸的标准液，浓度分别为:0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/ml。将样品液(10 μ L/点)和标准液(I μ L/点)点于同一块GF254高效薄层娃胶板(IOcmX IOcm)上。展开剂为甲醇-丙酮-冰乙酸-水-异丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为6:4:0.9:0.8:2。将展开剂加入展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)在25°C下预平衡20分钟。高效薄层板放入展开缸中，在25°C下展开，展距达到8cm时，将硅胶板板取出晾干。然后再次放回展开缸二次(从原点计)展开8cm，展开结束后，将硅胶板板取出晾干。用质量浓度为I %的水合茚三酮乙醇溶液喷板染色，然后置于110°C下烘烤5分钟。样品液和标准品对应的点染成红色。用camag3型薄层扫描仪，以492nm的吸收波长扫描，得到峰面积积分值和胞壁酸迁移值Rf为0.84，使用实施例1中所得关系回归方程，经检测和计算，得谷氨酸棒状杆菌菌渣中胞壁酸含量为1.13g/100g。
【权利要求】
1.一种胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:步骤如下: 1)取待检测样品液，点样于高效薄层硅胶板上，同时，将不同浓度的标准液点样于同一块高效薄层硅胶板；展开剂加入展开缸中进行预平衡，后将高效薄层硅胶板放入展开缸中进行二次展开，取出晾干； 所述展开剂为甲醇-丙酮-乙酸-水-异丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为4~6:2~4:0.5~1:0.5~1:0.5~2 ; 2)将质量浓度为I%的茚三酮乙醇溶液喷到高效薄层硅胶板上进行烘烤染色； 3)利用薄层扫描仪进行薄层层析扫描，得到胞壁酸Rf(比移值)和峰面积积分值；同时，计算出标准液质量和峰面积积分值的关系的回归方程，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中胞壁酸的质量浓度。
2.根据权利要求1所述的胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述高效薄层硅胶板选用GF254高效薄层硅胶板。
3.根据权利要求1所述的胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述标准液为5种不同浓度的标准液，浓度分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mg/ml。
4.根据权利要求1所述的胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为5:3:1:1:1。
5.根据权利要求1所述的胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述展开剂预平衡和硅胶板展开过程的温度为25°C,时间20min。
6.根据权利要求1所述的胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述烘烤染色的烘烤温度为110°C，时间5min。
7.根据权利要求1所述的胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:所述样品液是通过以下方法制备得到的: 1)取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(原料菌渣)，先用质量浓度为0.9%的生理盐水在室温下多次洗涤菌渣，以除去异臭味和易溶物质，过滤，得滤渣； 2)步骤I)所得滤渣，加入原料菌渣质量3~5倍的质量浓度为10%的三氯乙酸溶液，在温度45~60 °C下,搅拌15min~Ih,过滤,得滤洛； 3)将步骤2)所得滤渣用蒸馏水洗涤I~2次，以除去三氯乙酸，然后依次用滤渣质量2~10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液、氯仿洗涤脱脂，各2次；得脱脂滤渣； 4)向步骤3)所得脱脂滤渣中加入浓度为5~8mol/L的盐酸，按每克原料滤渣加入4~10毫升盐酸，置于水浴中，在温度90~100°C下酸解4~8h ;酸解后，得棕黑色的酸解液，将酸解液浓缩蒸干，得胞壁酸粗品； 5)步骤4)所得胞壁酸粗品，用蒸馏水溶解，加入氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，弃去下层有机相，再加入氯仿萃取I~3次，得上层溶液； 6)将步骤5)所得上层溶液蒸发挥干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附I~3次，至溶液变为无色透明，即得样品液。
8.一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，其特征在于:步骤如下: 1)取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(原料菌渣)，先用质量浓度为0.9%的生理盐水在室温下多次洗涤菌渣，以除去异臭味和易溶物质，过滤，得滤渣； 2)步骤I)所得滤渣，加入原料滤渣质量3~5倍的质量浓度为10%的三氯乙酸溶液，在温度45~60 °C下,搅拌15min~1h,过滤,得滤洛； 3)将步骤2)所得滤渣用蒸馏水洗涤1~2次，以除去三氯乙酸，然后依次用原料菌渣质量2~10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液、氯仿洗涤脱脂，各2次；得脱脂滤渣； 4)向步骤3)所得脱脂滤渣中加入浓度为5~8mol/L的盐酸，按每1克原料菌渣加入4~10毫升盐酸，置于水浴中，在温度90~100°C下酸解4~8h ;酸解后，得棕黑色的酸解液，将酸解液浓缩蒸干，得胞壁酸粗品； 5)步骤4)所得胞壁酸粗品，用蒸馏水溶解，加入氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，弃去下层有机相，再加入氯仿萃取1~3次，得上层溶液； 6)将步骤5)所得上层溶液蒸发挥干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附1~3次，至溶液变为无色透明，即得胞壁酸溶液，浓缩干燥，得胞壁酸。
9.根据权利压球8所述的从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，其特征在于:所述活性炭选用型号303糖用活性炭。
【文档编号】C07H1/08GK103954726SQ201410188150
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】蒋新英, 刘代成 申请人:山东师范大学