一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种大黄鱼鱼鳔胶原肽及其制备方法和用途，该胶原肽的氨基酸序列为Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1），ESI-MS检测给出分子量为649.72Da（[M+H]+650.53Da）。制备时自来水洗净大黄鱼鱼鳔，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比1g:10~15mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至6.5~7.5，于40~50℃保温10~15min;按照鱼鳔湿重的10~1.5%加入中性蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h；将上述酶解液调pH值至7.5~8.0，按照鱼鳔湿重的0.8~1.0%加入胰蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h；将酶解液加热到90~95℃灭活10~15min，4500~5000r/min离心15~20min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易于控制，制备的胶原肽具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
【专利说明】一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鱼类活性抗氧化胶原肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]鱼鳔，俗名鱼泡，主要成分为胶原蛋白、黏多糖，并含有多种维生素及钙、锌、铁、硒等微量元素。鱼鳔含有的胶原蛋白，易于人体吸收和利用，可以较好改善人体组织营养状况和加速新陈代谢，是人体补充、合成蛋白质的优质原料。
[0003]但是， 申请人:研究发现，以大黄鱼鱼鳔为原料，利用酶解技术制备大黄鱼鱼鳔胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以鱼鳔酶解产物为材料制备抗氧化活性胶原肽及其应用更是未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼鳔胶原肽，该胶原肽安全无毒副作用，易于消化吸收，具有较强的抗氧化作用。
[0005]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。
[0006]本发明所要 解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的应用。
[0007]本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼鳔胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)，ES1-MS 检测给出分子量为 m/z 649.72 Da ([M+H]+ 650.53 Da)。
[0008]本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
1)将大黄鱼鱼鳔用自来水洗净，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比Ig: 1(T15 mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至6.5~7.5，于4(T50°C保温10~15 min;按照鱼鳔湿重的1.(Tl.5%加入第一种蛋白酶，于4(T50°C温度下酶解2~4 h;
2)将上述酶解液调pH值至7.5^8.0,按照鱼鳔湿重的0.8^1.0%加入第二种蛋白酶，于4(T50°C温度下酶解2~4h;
3)将酶解液加热到90~95°C灭活10~15min, 4500^5000 r/min离心15~20 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。
[0009]作为优选，所述步骤I)中的第一种蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力> 5.0X IO5 U/g。
[0010]作为优选,所述步骤2)中的第二种蛋白酶为胰蛋白酶,酶活力> 1.85 X IO6 U/g。
[0011]作为改进，所述步骤3)的超滤和层析的具体过程为:
超滤:将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作压力和25~30 V的工作温度下采用3 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa组分，得超滤酶解液；
层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成2(T25 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞O μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据超氧阴离子自由基清除率得I个高活性抗氧化肽 Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)。
[0012]优选,所述阴离子交换树脂为DEAE-52 cellulose,所述凝胶为葡聚糖凝胶G_25。
[0013]再优选，所述反相高效液相色谱条件为:进样量10-15 μ L ;色谱柱为KromasilC18 ;柱温为25~30 V ;流动相:30 %乙腈；洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
[0014]本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的应用，其特征在于大黄鱼鱼鳔胶原肽Phe-Arg-Gly-Thr-1Ie-Gly-Leu (SEQ IDNo:1)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ IDNo:1)具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明选用中性蛋白酶和胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，使抗氧化胶原肽最大程度地释放出来；制备的抗氧化胶原肽是鱼鳔胶原蛋白经酶水解制得，安全、无毒副作用，并且抗氧化作用显著，可用作药品、保健食品和食品添加剂。 【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52 cellulose层析图
图2是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52 cellulose层析所分离各组分的超氧阴离子自由基清除活性图；
图3是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析图；
图4是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析所分离各组分的超氧阴离子自由基清除活性
图；
图5是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物(F32)的RP-HPLC图；
图6是本发明的抗氧化胶原肽Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)的RP-HPLC 图；
图 7 是本发明的 Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)的质谱(ES1-MS)图和结构式。
【具体实施方式】
[0017]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0018]一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，制备工艺流程如下:大黄鱼鱼鳔〃组织捣碎〃双酶酶解"酶解物"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"胶原肽。
[0019]实施例1:1)将大黄鱼鱼鳔用自来水洗净，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比Ig: 15 mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至7.0,于45 °C保温10 min;按照鱼鳔湿重的1.5 %加入中性蛋白酶(酶活力≥5.0XlO5 U/g)，于45 °C温度下酶解3h;
2)将上述酶解液调pH值至8.0，按照鱼鳔湿重的1.0%加入胰蛋白酶(酶活力≥1.85X IO6 U/g)，于45 °C温度下酶解3h;
3)将酶解液加热到90°C灭活15 min, 5000 r/min离心15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。
[0020]①超滤:将酶解上清液调至pH 7.0，于0.15 MPa的工作压力和30 V的工作温度下采用3 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液；
②DEAE-52cellulose阴离子交换层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成25 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液(F3)(图1) ③凝胶层析:将上述离子交换层析酶解液(F3)用双蒸水配成15mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物(F32)(图2)
④高效液相色谱精制:将上述凝胶制备酶解物(F32)用双蒸水配成50μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(条件:进样量15 μ L ;色谱柱为Kromasil C18(250 mm X 4.6 mm, 5 μ m);柱温为30 V ;流动相:30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm，根据超氧阴离子自由基清除率得I个高活性抗氧化肽(见图3)。
[0021]⑤结构检测:收集超氧阴离子自由基清除活性最高的I个抗氧化肽经检测为单一峰(见图4),利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu(SEQ ID No:1)，ES1-MS 检测给出分子量为 m/z 649.72 Da ([M+H]+ 650.53 Da)(见图 5)。
[0022]将上述制得的大黄鱼鱼鳔胶原肽Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)进行DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明:Phe-Arg-Gly-Thr-1Ie-Gly-Leu (SEQ ID No:1)对 DPPH 自由基(EC50 0.55 mg/mL)、羟基自由基(EC5tl 0.83 mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC50 0.73 mg/mL)具有良好的清除作用；同时，Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ IDNo:1)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。
[0023]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种大黄鱼鱼鳔蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)，分子量为 649.72 Da。
2.—种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将大黄鱼鱼鳔用自来水洗净，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比Ig: 1(T15 mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至6.5~7.5，于4(T50°C保温10~15 min;按照鱼鳔湿重的1.(Tl.5 %加入第一种蛋白酶，于4(T50°C温度下酶解2~4 h; 2)将上述酶解液调pH值至7.5^8.0,按照鱼鳔湿重的0.8^1.0%加入第二种蛋白酶，于4(T50°C温度下酶解2~4h; 3)将酶解液加热到90~95°C灭活10~15min, 4500^5000 r/min离心15~20 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤I)中的第一种蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥5.0X IO5 U/g。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的第二种蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥1.85X IO6 U/g。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的超滤和层析的具体过程为: 超滤:将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作压力和25~30°C的工作温度下采用3 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液； 层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成2(T25 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成1(T15 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞O μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据超氧阴离子自由基清除率得I个高活性抗氧化肽 Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)。
6.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52cellulose，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量10-?5μ L ;色谱柱为Kromasil C18 ;柱温为25~30。。;流动相:30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长280 nm。
7.—种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳔胶原肽的应用，其特征在于Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:I)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Phe-Arg-Gly-Thr-1le-Gly-Leu (SEQ ID No:1)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Phe-Arg-Gly-Thr-1Ie-Gly-Leu (SEQ IDNo:1)具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
【文档编号】C07K1/16GK103992385SQ201410218191
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】迟长凤, 王斌, 陈荫, 胡发远 申请人:浙江海洋学院