用于筛选抗癌症医药组合物的多肽分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供至少一种多肽分子，用于检测样品中之三磷酸腺苷结合盒运输蛋白抗体含量，进而筛选出富含三磷酸腺苷结合盒运输蛋白抗体之样品，作为毒杀抗药性癌细胞之抗癌症医药组合物。
【专利说明】用于筛选抗癌症医药组合物的多化分子及其应用 【【技术领域】】
[0001] 本发明系关于一种用于筛选抗癌症医药组合物之多肤分子及其应用，特别 是关于一种用于筛选H磯酸腺巧结合盒运输蛋白抗体（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)之多肤分子及其应用。 【【背景技术】】
[0002] 化学治疗是中晚期癌症的主要治疗方法。一般而言，癌症病人在经过一段时间的 化学治疗后，虽然大多数的癌细胞都会死亡，但仍有少数未被毒杀成功的癌细胞会留存在 体内，数量约在1炉?1〇 9之间。该些留存的癌细胞会表现大量的H磯酸腺巧结合盒运输蛋 白（ATP binding-cassette transporter, W下简称ABC运输蛋白），并将ABC运输蛋白运 送到细胞膜上，W执行排除细胞内化学治疗药物的工作。亦即，留存的癌细胞会利用ABC运 输蛋白将癌细胞内的化学治疗药物转移到细胞外，因此，化学治疗药物不再能有效攻击该 些留存的癌细胞。此即临床上所谓的癌细胞抗药性。亟待找寻化学治疗W外的方法毒杀该 些具有抗药性的癌细胞。
[0003] 献 Sarkadi B. Homolva L.Szakdcs G.Vdradi A. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters:participation in a chemoimmunity defense system. Physiol Rev. 2006, 86 (4) : 1179-1236中提及与癌细胞抗药性有关的ABC运输蛋白，主要包 括下列亚家族：
[0004] H磯酸腺巧结合盒运输蛋白亚家族B(ATP-binding cassette protein subfamily B) ;例如ABCBl,又称为多重抗药性蛋白1 (multi化ug resistance protein 1，简称MDRl), 亦称为P醋蛋白（perme油ility glycoprotein);又例如ABCB4(又称为MDR3);另外还有例 如ABCBll，系P甜的同系家族（Sister of P甜）。
[0005] H磯酸腺巧结合盒运输蛋白亚家族C(ATP-binding cassette protein subfamily C) ;例如ABCCl,又称为多重抗药性相关蛋白1 (multi化ug resistance related protein 1，简称MRPl);又例如ABCC2,又称为多重抗药性相关蛋白2(multi化ug resistance related protein 2,简称 MRP2);可能还包括 ABCC3-6、ABCCIO-11。
[0006] H磯酸腺巧结合盒运输蛋白亚家族G(ATP-binding cassette protein subfamily G):例如ABCG2,又称为双轻意酿抗药性蛋白（mitoxantrone resistance protein,简称 MXR),亦称为乳癌抗药性蛋白化reast cancer resistance protein,简称 BCRP)。
[0007] 美国专利US7785812描述了一种毒杀抗药性癌细胞的方法，系利用表现在抗药 性癌细胞表面的大量ABC运输蛋白进行标祀攻击。其W人为方式制造ABC运输蛋白抗体 (anti-ATP binding-cassette transporter antibody),且利用该 ABC 运输蛋白抗体携带 足W毒杀细胞之药物，形成一抗体标祀药物。则，该抗体标祀药物藉由ABC运输蛋白抗体而 结合在抗药性癌细胞上，并W其所携带的药物在抗药性癌细胞周围进行毒杀作用。
[000引然而，无论是直接制备ABC运输蛋白抗体或是先制备ABC运输蛋白后再用W筛选 ABC运输蛋白抗体，其中制备ABC运输蛋白抗体/ABC运输蛋白的过程都必需考虑其是否能 被折叠成正确构型，制备中要考虑的因素困难且复杂，使成本难w降低。此外，依现有技术 所制造出的ABC运输蛋白抗体，仅能辨识单一种ABC运输蛋白，难W适用于所有种类的抗药 性癌细胞。再者，现有技术利用药物对抗药性癌细胞进行毒杀，长期下来，将对身体及肾脏 造成不小的负担。 【
【发明内容】
】
[0009] 有鉴于现有技术的缺陷，本发明提供一种制程简单之多肤分子，W取代结构复杂 之ABC运输蛋白，作为筛选ABC运输蛋白抗体之主要依据。
[0010] 另外，本发明提供多种多肤分子及其组合，使能筛选出含有多种ABC运输蛋白抗 体之医药组合物，而能适用于各种不同种类的抗药性癌细胞。
[0011] 本发明亦提供一种对身体及肾脏负担较小的癌症医药组合物，W对抗抗药性癌细 胞。
[0012] 本发明再提供一种癌症医药组合物，可提升自然杀手细胞毒杀癌细胞之整体能 力。
[0013] 本发明更提供一种癌症医药组合物，可解决抗药性癌细胞的抗药性问题，进而与 化学治疗药物发生协同作用，抑制抗药性癌细胞之数量。
[0014] 于一较佳实施例中，本发明提供一种多肤分子，该多肤分子之氨基酸序列包含SEQ ID N0;1 序列、SEQ ID N0;2 序列、SEQ ID N0;3 序列、SEQ ID N0;4 序列、SEQ ID N0;5 序 列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或其组合。
[0015] 于一较佳实施例中，该多肤分子可与至少一种H磯酸腺巧结合盒运输蛋白之抗体 (anti-ATP binding-cassette transporter antibody)结合。
[0016] 本发明亦提供一种多肤分子之用途，用于筛选出一癌症医药组合物，其中该多肤 分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO ;1序列、SEQ ID NO ;2序列、SEQ ID NO ;3序列、SEQ ID NO ;4序列、SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或 其组合。
[0017] 于一较佳实施例中，用于从分离自人体之一血液、一血浆、或一血清中筛选出该癌 症医药组合物。
[0018] 于一较佳实施例中，该癌症医药组合物中包含至少一种H磯酸腺巧结合盒运输蛋 白之抗体。
[0019] 于一较佳实施例中，该癌症医药组合物可提升自然杀手细胞毒杀癌细胞之效果。
[0020] 于一较佳实施例中，该癌症医药组合物能与化学治疗药物发生协同作用，抑制抗 药性癌细胞之数量。
[0021] 本发明另外提供一种分离（或纯化）之抗体或人工生产之抗体，可与如下所述之 多肤分子结合：
[0022] 包含 SEQ ID NO ;1 序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序 列、SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或其组合 之多肤分子。
[0023] 于一较佳实施例中，可提升自然杀手细胞毒杀癌细胞之效果。
[0024] 于一较佳实施例中，可与化学治疗药物发生协同作用，抑制抗药性癌细胞之数量。
[00巧]本发明更提供一种检测套组，用W检测样品中之H磯酸腺巧结合盒运输蛋白之抗 体（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)含量；该检测套组中包含一多肤 分子，且该多肤分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO ;1序列、SEQ ID NO ;2序列、SEQ ID NO : 3 序列、SEQ ID N0;4 序列、SEQ ID N0;5 序列、SEQ ID N0;6 序列、W及 SEQ ID N0;7 序列 中之至少一者或其组合。
[0026] 于一较佳实施例中，本发明提供一种检测方法，系W-多肤分子作为一探针， 检测一样品中之H磯酸腺巧结合盒运输蛋白之抗体（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)含量，其中该多肤分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO ;1序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序列、SEQ ID NO ;5 序列、SEQ ID NO ;6 序 列、W及SEQ ID NO ;7序列中之至少一者或其组合。
[0027] 于一较佳实施例中，系利用酵素免疫吸附法、西方墨点法、生物芯片法、磁珠分离 暨定量方式、W及其他探针检测方式之至少一者，检测该样本中之H磯酸腺巧结合盒运输 蛋白之抗体含量。
[0028] 于一较佳实施例中，其至少包括下列步骤：
[0029] 涂覆（coating)该多肤分子至一容器中；
[0030] 去除该容器中之一第一息浮液；
[0031] 置入该样品之一适当浓度样本至该容器中；
[0032] 去除该容器中之一第二息浮液；
[0033] 置入一第二抗体；
[0034] 去除该容器中之一第H息浮液；W及 [00巧]检测该容器中之该第二抗体之含量。
[0036] 于一较佳实施例中，该容器系96孔盘。
[0037] 于一较佳实施例中，该样品系分离自人体之一血液、一血浆或一血清中之至少一 者。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0038] 图1 ;系一方块流程图，表示出本申请检测ABC运输蛋白抗体含量之一方法实施 例。
[0039] 图2 ;系癌症医药血浆对癌细胞抗药性之影响之直方图。
[0040] 图3 ;系癌症医药血浆对自然杀手细胞毒杀癌细胞之影响之直方图。
[0041] 图4;系一方块流程图，表示出利用本申请多肤分子纯化ABC运输蛋白抗体之一方 法实施例。 【【具体实施方式】】
[0042] 鉴于现有技术的限制及缺陷，本发明提供至少一种筛选癌症医药组合物之多肤分 子及其应用方法，系W构型简单的多肤分子筛选富含抗体的医药组合物，并利用该医药组 合物达到毒杀抗药性癌细胞的效果。
[0043] 已知自然杀手细胞（化化ral killer cells ;通常被定义为CD3-CD56+亚群的淋己 细胞）在人类免疫系统上扮演对抗癌细胞的重要角色，主要系通过抗体依赖性细胞介导的 细胞毒杀作用（antibody-cbpendent cell-mediated c}ftotoxicity，简称 ADCC)杀死癌细 胞。详言之，当癌细胞表现ABC运输蛋白（因而具有抗药性），而被身体内或外来的ABC运 输蛋白抗体结合时，自然杀手细胞表面的CD16分子【化浊III ;系抗体恒定区（化agment of constant region)之受体，会专一'f生结合于所有人类抗体之恒定区】会辨识并与该ABC运 输蛋白抗体的恒定区（例如IgG抗体的恒定区）结合，继而引发自然杀手细胞之抗体依赖 性细胞介导的细胞毒杀作用（W下简称ADCC作用），释放丙型干扰素（IFN-y)等细胞因子 来毒杀该抗药性癌细胞。
[0044] 依发明人多年之经验及研究结果，认为应能揃取现有技术W ABC运输蛋白为标祀 之优点，去除需制备构型复杂之抗体/蛋白质W及需利用药物毒杀等两种缺点，发展出一 种更简便、对身体负担较小之毒杀抗药性癌细胞的方法。亦即，研发一种线性多肤抗原，W 筛选含有多种ABC运输蛋白抗体之医药组合物。该医药组合物中的ABC运输蛋白抗体会与 抗药性癌细胞表面的ABC运输蛋白结合，形成标祀，且该ABC运输蛋白抗体能引发自然杀手 细胞之ADCC作用，使自然杀手细胞毒杀该些抗药性癌细胞。此外，发明人认为若线性多肤 抗原设计得当，所筛选出的医药组合物中之ABC运输蛋白抗体应能同时阻断ABC运输蛋白 之功能，抑制抗药性癌细胞将化学治疗药物转移到胞外，进而解决抗药性癌细胞的抗药性 问题。
[0045] W下系提供利用本发明之实施例之详细说明书，W及本发明之技术及特点。然本 实施例并非用W限定本发明，任何熟悉此技术者，在不脱离本发明之精神和范围内所完成 之各种更动或润饰，均应包含于本申请之申请专利范围内。
[004引实验一；ABC运输蛋白线性多肤分子的设计
[0047] 利用生物信息学方法，从各种ABC运输蛋白（指能引发化学治疗抗药性的ABC运 输蛋白）序列中，找寻与人类白血球抗原化uman leukocyte antigen,简称HLA;即人类之 Major histocompatibility complex,简称MHC)有较高亲和力的序列位置。W此方法找出 的线性多肤序列较可能刚好位于ABC运输蛋白表面，而能取代ABC运输蛋白，专一性地与 ABC运输蛋白抗体结合。
[0048] 经过一系列地设计改良及实验筛选，研发出7种ABC运输蛋白线性多肤分子（多 肤分子一般由20?50个氨基酸组成，但不W此为限），即SEQ ID N0;1、SEQ ID N0;2、 沈Q ID N0;3、沈Q ID N0;4、沈Q ID N0;5、沈Q ID N0;6、W及沈Q ID N0;7。此 7 种 ABC运输蛋白线性多肤分子或其组合，均可与至少一种ABC运输蛋白之抗体（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)结合，而能筛选出癌症医药组合物。尤其，此 7种ABC运输蛋白线性多肤分子或其组合，均与至少一种引发癌症化学治疗药物抗药性之 ABC运输蛋白之抗原表位（epitope)构型相似，因此可和该些引发化学治疗药物抗药性之 ABC运输蛋白之抗体结合，W筛选出能对抗抗药性癌细胞之癌症医药组合物。
[0049] 其中，该些ABC运输蛋白线性多肤分子与该至少一种ABC运输蛋白之抗体间的结 合力，大于磯酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,简称PBS;pH 7. 4)与该至少一种 ABC运输蛋白之抗体间的结合力。
[0050] 实验二：制备ABC运输蛋白线性多肤分子
[0051] W化学法合成该些ABC运输蛋白线性多肤分子，纯度须大于95%。可委巧胜肤 合成服务公司合成该些ABC运输蛋白线性多肤分子。 申请人:系委巧明欣生物科技有限公 司（地址；台北市南港区园区街3号10楼之1 ;电话；02-26557128 ;网址；http://www. missionbio. com. tw/)制备该7种ABC运输蛋白线性多肤分子。
[005引将合成的ABC运输蛋白线性多肤分子溶于67%的己酸中巧mg线性多肤分子/I血 之67%己酸），于-2(TC之低温冰箱中保存。
[0053] 实验H ;筛选癌症医药组合物
[0054] 将上述7种ABC运输蛋白线性多肤分子之至少一种与样品（例如分离自人体之一 血液、一血浆、或一血清中之至少一者）混合，检测样品中ABC运输蛋白线性多肤分子-ABC 运输蛋白抗体复合物下简称多肤分子-抗体复合物）之含量。多肤分子-抗体复合物含 量较多者，代表原样品中含有大量ABC运输蛋白之抗体，可作为癌症医药组合物，W引发自 然杀手细胞之抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，杀死表现ABC运输蛋白之抗药性癌细胞。
[0055] 其中，可利用酵素免疫吸附法巧nzyme-linked immunosorbent assay,简称 ELISA)或其他利用多肤分子为探针之检测方式（例如西方墨点法、生物芯片法、磁珠分离 暨定量方式），检测样品中ABC运输蛋白抗体之含量，W筛选适合作为癌症医药组合物之 样品，尤指含有至少一种引发癌症化学治疗抗药性之ABC运输蛋白之抗体的癌症医药组合 物。W下W酵素免疫吸附法为例进行详细说明：
[0056] 请参阅图1，其系一方块流程图，表示出本申请检测ABC运输蛋白抗体含量之一方 法实施例。本发明一种检测ABC运输蛋白抗体含量的较佳实施方法至少包括：
[0057] 步骤S1 ;涂覆多肤分子至一容器中；
[0058] 步骤S2 ;去除该容器中之一第一息浮液；
[0059] 步骤S3 ;置入一样品之一适当浓度样本至该容器中；
[0060] 步骤S4 ;去除该容器中的一第二息浮液；
[006U 步骤S5 ;置入一第二抗体；
[006引步骤S6 ;去除该容器中的一第立息浮液；W及
[0063] 步骤S7 ;检测该容器中之该第二抗体之含量。
[0064] 于本较佳实施例中，步骤S1中之该容器，系96孔盘。步骤S1系在96孔盘的一第 一孔及一第二孔中，加入100 y L之ABC运输蛋白线性多肤分子，并在96孔盘的一第H孔及 一第四孔中，加入100 y L之植物性蛋白多肤分子，4C涂覆8小时（或过夜）。
[006引其中，该ABC运输蛋白线性多肤分子及该植物性蛋白多肤分子已先W磯酸盐缓冲 液（Phosphate Buffered Saline,简称 PBS;抑 7. 4)稀释至 5 ?20 yg/mL。且该 ABC 运输 蛋白线性多肤分子系 SEQ ID N0;1、SEQ ID N0;2、SEQ ID N0;3、SEQ ID N0;4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID N0;6、W及SEQ ID N0;7 W等比例混合所得。
[0066] W涂覆ABC运输蛋白线性多肤分子之该第一孔为实验组，涂覆植物性多肤分子之 该第H孔为对照组，涂覆ABC运输蛋白线性多肤分子之该第二孔为第一空白对照组，涂覆 植物性多肤分子之该第四孔为第二空白对照组。
[0067] 再则，步骤S2系去除该第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第一息浮液。较佳者， 去除第一息浮液后，再W磯酸盐缓冲液（pH 7.4)清洗H次。
[006引此外，步骤S3中之该样品系分离自人体之一血浆（亦可置换为一血液、一血清，但 不W此为限）。该适当浓度样本系该血浆（或该血液、该血清，但不W此为限）经磯酸盐缓 冲液（pH 7. 4)稀释100?200倍后所制成。步骤S3中，系于该第一孔及该第H孔中加入 100 y L该适当浓度样本，该第二孔及该第四孔中则加入100 y L磯酸盐缓冲液（pH 7. 4)，并 于适当温度下作用一段时间。较佳者，于室温作用2小时。
[0069] 步骤S4系去除该第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第二息浮液。较佳者，去除 第二息浮液后，再W磯酸盐缓冲液（pH 7.4)清洗H次。
[0070] 步骤S5中的该第二抗体系可与人类ABC运输蛋白抗体专一性结合之抗体，例如兔 抗人免疫球蛋白 G 抗体(Anti-Human IgG (Fc speci円c) antibody produced in rabbit)或 山羊抗人免疫球蛋白 G抗体(Anti-Human IgG (Fc speci円c) antibody produced in goat)。 步骤S5中，系加入例如200 y L适当浓度之该第二抗体（例如W磯酸盐缓冲液（pH 7. 4)稀 释10000倍），并于适当温度下作用一段时间。较佳者，于室温作用2小时。
[0071] 步骤S6系去除该第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第H息浮液。较佳者，去除 第H息浮液后，再W磯酸盐缓冲液（pH 7.4)清洗H次至五次。
[0072] 步骤S7之检测原理，系利用该第二抗体携带的一酵素，将一化合物转换为一 呈色化合物，则该第二抗体之含量与该酵素的量及呈色深浅呈正比，可藉由检测颜色深 浅而回推该第二抗体之含量。较佳者，该第二抗体携带的该酵素，可将四甲基联苯胺 (Tetramethy化enzidine，简称TMB)转换为蓝色产物。或是，步骤S7之检测原理，系利用该 第二抗体携带的一英光物质进行检测，藉由检测英光强度而回推该第二抗体的含量。
[0073] 于本较佳实施例中，步骤S7之具体步骤系于该第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中 加入lOOuL TMB，反应20分钟，再加入50yL 2M H2SO4终止反应。W 450nm为检测波长， 630皿为参考波长，测定吸光值（0D值），并计算特异性结合指数（specific binding index, 简称SBI):
[0074] SBI =(实验组之吸光值一第一空白对照组之吸光值）/(对照组之吸光值一第二 空白对照组之吸光值）
[00巧]W SBI作为筛选样品（例如分离自人体之一血液、一血浆、或一血清之至少一者， 但不W此为限）之参考数值，凡是比值大于1. 5者，可作为治疗癌症的癌症医药组合物，用 于引导自然杀手细胞之「抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用（即ADCC作用）」。所述癌 症医药组合物中，SBI值大于1. 5的血液，称为癌症医药血液；SBI值大于1. 5的血浆，称为 癌症医药血浆；SBI值大于1. 5的血清，称为癌症医药血清。
[0076] 实验四；测试癌症医药组合物之效果
[0077] (一）筛选具有化学治疗药物抗药性的癌细胞株
[007引 在24孔盘（24well)中种入MCF-7乳癌细胞株，细胞浓度为SXloVmL。加入lOOnM 双轻意酿（即Mitoxantrone，为一种化学治疗药物；可购自美国Sigma-Al化ich公司，产品 名称为Mitoxantrone dihy化ochloride)继代培养一个月，存活之细胞即为具有双轻意酿 抗药性之MCF-7乳癌细胞。
[0079] (二）癌症医药组合物对癌细胞抗药性之影响
[0080] 在96孔盘巧Swell)中种入具有双轻意酿抗药性之MCF-7乳癌细胞，使每孔中含 有5000个细胞。对照组中添加lOOnM双轻意酿培养。实验组中添加lOOnM双轻意酿W及 5%癌症医药血浆（将5 y L癌症医药血浆加入95 y L细胞液中），共同培养。于培养24、48、 72小时后，W MTT生物活性分析法（MTT assay)检测并计算细胞存活率。
[0081] 其中，用于筛选该癌症医药血浆之ABC运输蛋白线性多肤分子包含本案7种ABC 运输蛋白线性多肤分子。亦即，将氨基酸序列为SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及 SEQ ID N0;7 之走种 ABC 运输蛋白线性 多肤分子，W等比例混合，得到ABC运输蛋白线性多肤分子混合物。再利用ABC运输蛋白线 性多肤分子混合物筛选出SBI值大于1. 5的血浆，获得该癌症医药血浆。
[0082] 请参阅图2,为癌症医药血浆对癌细胞抗药性之影响之直方图。图2中，左侧组 别是添加双轻意酿之对照组，右侧组别则是添加双轻意酿及癌症医药血浆共同培养之实验 组。对照组细胞经培养1天、2天、3后，细胞数量分别达到6. 4X 103个细胞/孔、9. 4X 1〇3 个细胞/孔、12. 9 X 103个细胞/孔。实验组细胞经培养1天、2天、3天后，细胞数量分别达 到4. 0X 1〇3个细胞/孔、4. 8X 1〇3个细胞/孔、6. 2X 1〇3个细胞/孔，与培养同样时间长度 的对照组之间均具有显著差异（P<〇. 001)。
[0083] 图2显示癌症医药血浆能抑制具有双轻意酿抗药性之MCF-7乳癌细胞生长，且抑 制效果随作用时间长度而增加。其中，W癌症医药血浆作用1天后之抑制比例达37. 5%，作 用2天后之抑制比例达48. 9%，作用3天后之抑制比例达51.9%。
[0084] 据此，W本发明7种ABC运输蛋白线性多肤分子所筛选出的癌症医药血浆，具有高 浓度ABC运输蛋白抗体，能够与抗药性癌细胞表面的ABC运输蛋白结合，进而阻断抗药性癌 细胞将化学治疗药物转移到胞外的路径，使化学治疗药物能继续发挥抑制癌细胞生长的效 果。因此，利用本发明7种ABC运输蛋白线性多肤分子所筛选出的癌症医药组合物，有助于 解决抗药性癌细胞的抗药性问题，而能与化学治疗药物发生协同作用，显著抑制抗药性癌 细胞之数量。
[0085] (H)癌症医药组合物对自然杀手细胞毒杀癌细胞之影响
[008引在96孔盘巧Swell)中种入具有双轻意酿抗药性之MCF-7乳癌细胞，使每孔中含 有5000个细胞。对照组中，每孔添加2X104个自然杀手细胞共同培养。实验组中，每孔添 加2 X 104个自然杀手细胞W及5 %癌症医药血浆（将5 y L癌症医药血浆加入95 y L混合 细胞液中），共同培养。于培养24、48、72小时后，WMIT生物活性分析法（MTT assay)检测 并计算MCF-7乳癌细胞之存活率。
[0087] 其中，用于筛选该癌症医药血浆之ABC运输蛋白线性多肤分子包含本案7种ABC 运输蛋白线性多肤分子。亦即，将氨基酸序列为SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及 SEQ ID N0;7 之走种 ABC 运输蛋白线性 多肤分子，W等比例混合，得到ABC运输蛋白线性多肤分子混合物。再利用ABC运输蛋白线 性多肤分子混合物筛选出SBI值大于1. 5的血浆，获得该癌症医药血浆。
[0088] 请参阅图3,为癌症医药血浆对自然杀手细胞毒杀癌细胞之影响之直方图。图3 中，左侧组别是添加自然杀手细胞之对照组，右侧组别则是添加自然杀手细胞及癌症医药 血浆共同培养之实验组。对照组细胞经培养1天、2天、3天后，细胞数量分别达到4. 5X 1〇3 个细胞/孔、5. 9X 103个细胞/孔、8. 5X 103个细胞/孔。实验组细胞经培养1天、2天、3 后，细胞数量则分别达到3. 1 X 1〇3个细胞/孔、3. 5 X 1〇3个细胞/孔、5. 0 X 1〇3个细胞/孔， 与培养同样时间长度的对照组之间均具有显著差异（P<〇. 001)。
[0089] 图3显示癌症医药血浆能显著提升自然杀手细胞毒杀癌细胞的效果，且效果随著 作用时间长度而增加。其中，W癌症医药血浆作用1天之毒杀效果提升31. 1 %，作用2天之 毒杀效果提升40. 7%，作用3天后之毒杀效果提升41. 2%。
[0090] 据此，W本发明7种ABC运输蛋白线性多肤分子所筛选出的癌症医药血浆，具有 高浓度ABC运输蛋白抗体，能够引发自然杀手细胞之抗体依赖性细胞介导的细胞毒杀作用 (antibody-dependent cell-mediated巧totoxicity),使自然杀手细胞毒杀癌细胞之整 体效果提升，大幅降低抗药性癌细胞之数量。
[0091] 依本发明人多年的经验及发明研究结果，于动物体内施用本发明之医药组合物 时，建议每次化学疗程输入150?300mL该医药组合物一次。
[009引实验五：纯化ABC运输蛋白抗体
[0093] 请参阅图4,其系一方块流程图，表示出利用本申请多肤分子纯化ABC运输蛋白抗 体之一方法实施例。
[0094] 步骤S11 ;制备带有一多肤分子之一磁珠，形成一磁珠多肤分子；
[0095] 步骤S12 ;混合该磁珠多肤分子与一样品，而得一混合液；
[0096] 步骤S13 ;将该混合液通过受有一磁力之一管柱（column);
[0097] 步骤S14 ;将一缓冲液注入该管柱中，W分离一磁珠多肤分子暨抗体复合物中的 该磁珠多肤分子及一 ABC运输蛋白抗体。
[0098] 其中，步骤 S11 中之该多肤分子系 SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及 SEQ ID N0;7 中之至少一者。步骤 Sll 可委巧 磁珠厂商代为执行，例如委巧台湾圆点奈米技术股份有限公司（地址：桃园县桃园市龙寿 街 81 巷 12 弄 2 号；电话；03-3607555 ;网址；ht1:p://www. tanbead. com/)代为执行。
[0099] 步骤S12中，该混合液中带有一磁珠多肤分子暨抗体复合物。
[0100] 执行步骤S13之过程中，该混合液中的该磁珠多肤分子暨抗体复合物会受磁力影 响而吸附在该管柱上。
[0101] 步骤S14中，该缓冲液应选用能打断该磁珠多肤分子与该ABC运输蛋白抗体之连 结关系者。若步骤S11是委巧磁珠厂商进行，则该厂商会一并提供合适的缓冲液。
[0102] W此方式纯化之ABC运输蛋白抗体，可引发自然杀手细胞之抗体依赖性细胞介导 的细胞毒杀作用，且可进一步用于制备癌症药物或制备癌症医药组合物。
[0103] 综合W上所述，本申请提供7种ABC运输蛋白线性多肤分子，能筛选出癌症医药血 液、癌症医药血浆、癌症医药血清、或纯化出ABC运输蛋白抗体等各种癌症医药组合物。所 述癌症医药组合物能使自然杀手细胞毒杀癌细胞之整体效果提升，也能解决抗药性癌细胞 的抗药性问题，进而使化学治疗药物发挥毒杀抗药性癌细胞之效果。
[0104] 本申请提供之一种用于筛选抗癌症医药组合物之多肤分子即SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、沈Q ID NO ;3、沈Q ID NO ;4、沈Q ID NO ;5、沈Q ID NO ;6、W及 SEQ ID NO ;7 中 之至少一者，亦或是，一种由20?50个氨基酸组成之多肤分子，其序列包含SEQ ID NO ;1、 沈Q ID N0;2、SEQ ID N0;3、SEQ ID N0;4、SEQ ID N0;5、SEQ ID N0;6、W及沈Q ID N0;7 中之至少一者。
[0105] 应能理解的是，一种衍生多肤分子，系将界定于SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID N0;3、沈Q ID N0;4、沈Q ID N0;5、沈Q ID N0;6、W及沈Q ID N0;7 中之序列进行一或 多个氨基酸之取代、删除或添加后所衍生，且能与至少一种H磯酸腺巧结合盒运输蛋白之 抗体结合者，亦应包含于本申请之申请专利范围内。
[0106] W上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用W限定本发明之申请专利范围，因此 凡其它未脱离本发明所掲示之精神下所完成之各种更动或润饰等，均应包含于本申请之申 请专利范围内。
【权利要求】
1. 一种多肽分子，其氨基酸序列包含SEQ ID NO :1序列、SEQ ID NO :2序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、SEQ ID NO :5 序列、SEQ ID NO :6 序列、以及 SEQ ID NO :7 序列中之至少一者或其组合。
2. 如权利要求1所述之多肽分子，该多肽分子可与至少一种三磷酸腺苷结合盒运输蛋 白之抗体结合。
3. -种多肽分子之用途，用于筛选出一癌症医药组合物，其中该多肽分子之氨基酸序 列包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、SEQ ID NO :5序列、SEQ ID NO :6序列、以及SEQ ID NO :7序列中之至少一者或其组合。
4. 如权利要求3所述之多肽分子之用途，用于从分离自人体之一血液、一血浆、或一血 清中筛选出该癌症医药组合物。
5. 如权利要求3所述之多肽分子之用途，该癌症医药组合物中包含至少一种三磷酸腺 苷结合盒运输蛋白之抗体。
6. 如权利要求5所述之多肽分子之用途，该癌症医药组合物可提升自然杀手细胞毒杀 癌细胞之效果。
7. 如权利要求5所述之多肽分子之用途，该癌症医药组合物能与化学治疗药物发生协 同作用，抑制抗药性癌细胞之数量。
8. -种分离或纯化之抗体或人工生产之抗体，可与如下所述之多肽分子结合： 包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、 SEQ ID N0:5序列、SEQ ID N0:6序列、以及SEQ ID N0:7序列中之至少一者或其组合之多 肽分子。
9. 如权利要求8所述之分离或纯化之抗体或人工产生之抗体，可提升自然杀手细胞毒 杀癌细胞之效果。
10. 如权利要求8所述之分离或纯化之抗体或人工产生之抗体，可与化学治疗药物发 生协同作用，抑制抗药性癌细胞之数量。
11. 一种检测套组，用以检测样品中之三磷酸腺苷结合盒运输蛋白之抗体含量，该检测 套组中包含一多肽分子，且该多肽分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO :1序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、SEQ ID NO :5 序列、SEQ ID NO :6 序列、以及 SEQ ID NO :7序列中之至少一者或其组合。
12. -种检测方法，系以一多肽分子作为一探针，检测一样品中之三磷酸腺苷结合盒运 输蛋白之抗体含量，其中该多肽分子之氨基酸序列包含SEQ ID NO :1序列、SEQ ID NO :2序 列、SEQ ID N0:3 序列、SEQ ID N0:4 序列、SEQ ID N0:5 序列、SEQ ID N0:6 序列、以及 SEQ ID NO :7序列中之至少一者或其组合。
13. 如权利要求12所述之检测方法，系利用酵素免疫吸附法、西方墨点法、生物芯片 法、磁珠分离暨定量方式、以及其他探针检测方式之至少一者，检测该样本中之三磷酸腺苷 结合盒运输蛋白之抗体含量。
14. 如权利要求12所述之检测方法，其至少包括下列步骤： (a) 涂覆该多肽分子至一容器中； (b) 去除该容器中的第一悬浮液； (c) 置入该样品之一适当浓度样本至该容器中； (d) 去除该容器中的第二悬浮液； (e) 置入一第二抗体； (f) 去除该容器中的第三悬浮液；以及 (g) 检测该容器中之该第二抗体之含量。
15. 如权利要求14所述之检测方法，其中该容器系96孔盘。
16. 如权利要求12所述之检测方法，其中该样品系分离自人体之一血液、一血浆或一 血清中之至少一者。
【文档编号】C07K14/00GK104513297SQ201410417537
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】李光辉 申请人:李光辉