原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用的制作方法

原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了原发性胆汁性肝硬化（PBC）特异性自身抗原，其为EIF2C1。本发明筛选到6个新PBC自身抗原。在检测PBC患者血清中，这些自身抗原的阳性率都达到了15%以上，因此，这些新发现的自身抗原是潜在的区别其他自身免疫性疾病而准确诊断PBC的生物标记物。
【专利说明】原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用
[0001] 本申请是申请日为2012年03年26日，中国申请号为201210080385. 8,发明名称 为"原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用"的发明申请的分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明属于生物标志物领域，具体涉及原发性胆汁性肝硬化抗原标志物及其应 用。

【背景技术】
[0003] 原发性胆汁性肝硬化（PBC)是一种慢性胆汁淤积性肝脏疾病，以肝内中小胆管 的进行性破坏为主要特征，最终导致肝硬化和肝功能衰竭的一种疾病（Poupon，R 2010， Selmi，C. 2011)。其病理学表现为汇管区炎症，淋巴细胞围绕受损的胆管周围，并浸润至 胆管基底膜和胆管上皮细胞内，胆管上皮细胞呈空泡状变性坏死，进而引起上皮样组织细 胞增生，形成肉芽肿，这种形态学特点提示胆管上皮是PBC免疫攻击的目标。PBC最常见的 临床症状为乏力和皮肤瘙痒。与胆汁淤积有关的PBC特殊并发症主要有骨质疏松、脂溶性 纤维素缺乏、高脂血症和脂肪泻等。在疾病后期，可发生肝硬化和门脉高压的一系列与其他 原因导致的肝硬化所致者基本类似的并发症，如腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血和肝性 脑病等。
[0004] PBC最主要的血清生化指标就是血清碱性磷酸酶（ALP)和Y-谷氨酰转肽酶 (Gamma-glutamyltransferase，Y-GT)升高，一般升高3-4倍，并且可见于疾病的早期和无 症状期。但是谷丙转氨酶（ALT)和谷草转氨酶(AST)通常正常或轻度至中度升高。早期患 者没有黄疸，但随着病情的进展，在较晚期的患者中血清胆红素明显升高，血清胆红素水平 有助于判定PBC患者的预后及决定肝移植的时机。高胆红素、低白蛋白血症和延长的凝血 酶时间都是预后不良的指标。此外，PBC患者的血清胆汁酸水平通常会升高。
[0005] 血清中存在抗线粒体抗体（AMA)是PBC的重要标志。AMA并非PBC唯一的特异性 自身抗体，在PBC血清中亦可检测到抗核抗体（ANA)，有呈现核模型（M-ANA)，有呈现多核点 型（multiple nuclear dots, MND)。此外，部分PBC患者表现有抗平滑肌抗体阳性、抗甲状 腺抗体、抗DNA抗体和类风湿因子等自身抗体。
[0006] 自从医学工作者发现某些疾病患者的血清呈现特异的免疫荧光染色模式后，探索 这些自身抗体所针对的自身抗原以及建立相关检测技术的工作就一直在进行。鉴定自身抗 原方面，起初通过免疫荧光技术和细胞生物学知识初步确定靶抗原的细胞定位，再通过分 离提取不同的细胞器，确认自身抗体识别的蛋白质在细胞中较精细的定位。随着蛋白质电 泳技术、免疫印迹技术及生物质谱技术的发展，越来越多的自身抗原被鉴定。近年来，随着 cDNA表达文库技术以及高通量重组蛋白表达纯化技术的运用，特别是高通量蛋白质芯片技 术的发展，自身抗原的鉴定工作变得越来越简单、方便和快捷。
[0007] 另一方面，自身抗体的临床实验室检测技术也取得了飞速发展，从起初的基于组 织和/或细胞的免疫组织化学技术及免疫突光技术，到传统的沉淀反应、免疫电泳技术、凝 集试验、补体结合试验技术等。随着分子生物学的发展，特别是重组蛋白表达技术的发展， 各种标记免疫测定技术（包括酶联免疫测定技术、放射免疫技术、荧光免疫测定、化学发光 免疫测定和金免疫技术等）已成为主要的免疫测定技术。此外，免疫印迹法也发挥了明显 的作用。近年来，随着基因组学和蛋白质组学技术的发展，蛋白质芯片技术以其较高的检测 灵敏度在自身抗原鉴定方面发挥了重要作用，目前已有不少于21种蛋白质芯片用于临床 (Hartmann，M.，J 2009)，其中至少有5种经FDA认证批准用于自身免疫性疾病的诊断。
[0008] 目前，自身抗原鉴定的方法主要包括以下五种：1) SEREX技术；2)噬菌体展示技 术；3) SERPA技术；4)蛋白质芯片技术；5) MAPPing技术。其中SEREX技术、噬菌体展示技 术需要构建表达文库，经过数轮的生物淘洗，最终确定候选自身抗原的身份，程序繁琐，耗 时耗力。此外还存在以下缺点，1)筛选到的表位主要以大肠杆菌容易表达的线性表位为主； 2)由于大部分的文库是从肿瘤组织或细胞中提取mRNA制备cDNA的，表达文库倾向于原本 就是较高丰度的胞内蛋白，而自身抗体识别的自身抗原大部分都是表达量较低的蛋白质。
[0009] SERPA技术是伴随中蛋白质组学技术的发展而产生的，在鉴定识别蛋白质翻译后 修饰自身抗体方面有独特的优势，并且也摆脱了构建表达文库费时费力的工作，但是由于 双向电泳技术分离细胞全蛋白的能力所限，特别是极端分子量和等电点的蛋白质抗原的分 离，以及电泳过程中天然蛋白质构象被破坏，筛选到的自身抗体仍然以识别线性表位为主。
[0010] MPPing技术是利用免疫亲和的方法首先使用对照血清预结合非疾病特异识别的 天然蛋白质自身抗原，然后再使用疾病血清免疫亲和作用下结合疾病特异的天然蛋白质自 身抗原。该方法更容易鉴定到能够识别天然蛋白质的自身抗体。其技术流程更接近与SEREX 技术和噬菌体展示技术，都是经过多次淘洗的过程，只是这里需要经过生物质谱鉴定自身 抗原的身份。其缺点就是鉴定自身抗原的身份比较麻烦，特别是由于天然细胞中存在大量 蛋白质-蛋白质相互作用的复合体，在预吸附的过程中有可能将与非特异性自身抗原结合 的疾病特异自身抗原一起除去，造成后续无法找到疾病特异的自身抗原。
[0011] 蛋白质芯片技术是一种高通量、高灵敏度、微型化的分析技术，是检测血清和其他 临床样本中多种自身抗体的有效工具。不但用于快速发现新的、对疾病的诊断和预后有重 要应用价值的疾病相关自身抗体标记物，而且用于大批量、低成本检测已知的疾病相关自 身抗体。由于蛋白质芯片上靶标抗原都是已知的，因此很容易判断鉴定的新的自身抗原的 身份。然而制备蛋白质芯片上成千上万的蛋白质抗原探针却并非易事。目前芯片抗原可以 使用经蛋白质组学技术分离的细胞全蛋白组分、各种已知抗体亲和捕获的天然蛋白质，以 及外源宿主表达的重组蛋白。外源宿主表达的重组蛋白可能会面临非天然蛋白质的构象， 克隆表达重组蛋白任务繁重等缺点。分离的细胞全蛋白组分和用已知抗体亲和捕获天然蛋 白质的方法基本消除了非天然蛋白质的顾虑，但是也面临多种条件限制，如蛋白质组学技 术分离的全蛋白组分的分离效果有待提高；鉴定目的靶标抗原比较麻烦；已知抗体的制备 也比较繁琐且不易获得等重大缺陷。此外亦有采用构建CDNA基因芯片，利用体外原位无细 胞表达体系制备相应的蛋白质芯片的报道，这种方法省去了纯化大量重组蛋白的麻烦，但 无法确保芯片上重组蛋白质的有效表达。
[0012] 如前所述，PBC是一种自身免疫性肝脏疾病，自身抗体标记物的检测在疾病的诊断 中具有重要作用。AMA是PBC临床诊断的重要标准之一，且可以在PBC无症状期或临床症状 前期出现在患者血清中。AMA (主要是II型抗线粒体抗体，AMA-M2)在PBC诊断中的敏感度 为90%左右。随着各种临床疾病研究的深入，发现AM可以广泛存在于其他多种自身免疫 性疾病，如原发性干燥综合征，硬皮病，自身免疫性肝炎以及病毒性肝炎等。甚至有报道发 现40. 9% (28/69)的急性肝衰竭患者呈现AMA-M2阳性（Ieung 2007)。此外，仍有10%左右 为AM阴性PBC患者，这部分患者的诊断只能依靠其他各种临床症状结合肝活检进行确认。
[0013] 除AMA外，抗gp210抗体、抗p62抗体、抗splOO抗体、抗spl40抗体及抗LBR抗体 等自身抗体在PBC的诊断中也有重要临床价值，但是普遍阳性率偏低（1%-30%)，且大部分 与AMA-M2同时出现。
[0014] PBC是一种遗传因素和环境因素相互作用下的自身免疫性疾病，其发病机制并不 清晰。自身抗体在PBC发病机制中的作用了解不足且存在争议。尽管AMA在PBC中拥有较 高的敏感度和特异性，有实验表明，AM的滴度可能与疾病活动性相关，提示AM可能参与 了肝脏组织的损伤。但也有相反的观点，争议颇多。因此鉴定更多的自身抗体可能有助于 揭示PBC的发病机制，特别是自身抗体在其中的作用。
[0015] 由于PBC的治疗比较特殊，完全不同于其他疾病，特别是自身免疫性肝炎和病毒 性肝炎等其他肝脏疾病。因此在肝炎基数较大的中国，PBC的鉴别诊断非常重要。因此有 必要鉴定更多PBC相关的自身抗体标记物，以服务于PBC的临床诊断。


【发明内容】

[0016] 为了解决上述问题，本发明提供原发性胆汁性肝硬化（PBC)特异性自身抗原及其 应用。
[0017] 本发明通过高密度蛋白质芯片与小样本血清杂交筛选候选PBC自身抗原及后续 的制备PBC芯片并与大样本血清杂交筛选相结合的方案共筛选出6个与原发性胆汁性肝硬 化（PBC)高度相关且敏感度均大于15%的特异性自身抗原，分别为HKl亚型UHKl亚型2、 KLHL12、KLHL7、ZBTB2 和 EIF2C1。
[0018] 进一步地，本发明还提供所述的自身抗原作为生物标志物在制备原发性胆汁性肝 硬化检测试剂中的应用。
[0019] 其中，所述试剂为基于放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫或金免疫技术的试剂， 如包被所述抗原的免疫荧光试纸条、免疫放射试纸条，免疫金试纸条等，但不限于此。
[0020] 其中，所述的自身抗原可为两个或两个以上自身抗原融合的抗原。
[0021] 在本发明优选的一个实施方案中，所述的检测试剂为包被有一种或多种所述的自 身抗原的原发性胆汁性肝硬化检测芯片。
[0022] 其中，所述的检测芯片还可包被 BC0ADC-E2、PDC-E2、0GDC-E2、E3BP、PDC-El 3、 PDC-El a、Gp210、p62、LBR、CENP-B、SplOO和Spl40中的一种或多种原发性胆汁性肝硬化 特异性自身抗原。
[0023] 在本发明另一个实施方案中，所述检测芯片包被KLHL12、ZBTB2和gp210。
[0024] 其中，所述的检测芯片，还可包被质控抗原。其中，所述的质控抗原可为本领域中 合适的任何质控抗原，如鼠IgG、人IgG和禽流感病毒核蛋白中的一种或多种。
[0025] 进一步地，本发明还提供一种原发性胆汁性肝硬化ELISA检测试剂盒，其含有酶 标板，所述的酶标板包被一种或多种所述的自身抗原。
[0026] 优选的，所述的酶标板还可包被 BC0ADC-E2、PDC-E2、0GDC-E2、E3BP、PDC-El 3、 PDC-El a、Gp210、p62、LBR、CENP-B、SplOO和Spl40中的一种或多种原发性胆汁性肝硬化 特异性自身抗原，以提高检测PBC的灵敏度。
[0027] 本发明通过高密度蛋白质芯片与PBC患者血清杂交筛选到23个候选PBC相关自 身抗原。为了进一步验证这些自身抗原的特异性，构建了包含其中的21个候选PBC相关自 身抗原以及9个临床上已经使用或报道的PBC特异性自身抗原在内的PBC芯片，然后通过 大样本血清（包括191份PBC血清，及321份对照血清：43 AIH，55 HBV，31HCV，48 RA, 45 SLE，49 SSc and 50健康人)与PBC芯片杂交，通过数据结果分析，共鉴定到13个自身 抗原在PBC血清中具有较高的灵敏度和特异性，数据分析显示13种蛋白质在PBC中的敏感 度达到15%以上，其中6个为新发现的，分别为HKl (isoforms I和isoforms II)，KLHL7， KLHL12，ZBTB2,和 EIF2C1。其中，HKl 亚型 I、HKl 亚型 II、KLHL12、KLHL7 的阳性率达 到了 35%以上。结果还发现，联合KLHL12、ZBTB2和gp210检测对AMA-M2阴性的PBC患者 诊断起重要辅助作用，检测敏感度为47. 8%，特异性为89. 4%，与AMA-M2检测PBC基本一致 (89. 7%)。为了方便于临床检测，297份PBC血清和637份对照血清用于基于ELISA技术的 抗KLHL12和ZBTB2自身抗体检测，结果发现其阳性率分别为29. 6%和11. 2%，特异性分别为 98%和99. 7%。另外Western blot结果证实PBC血清中抗HKl和KLHL7的自身抗体不但能 被芯片可检测，Western blot也是可检测的。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1所示为PBC血清及对照血清杂交高密度蛋白质芯片局部效果图。A、B和C图 显示的是三份PBC血清与芯片杂交的效果图；D、E和F图显示的是三份对照组血清与芯片 杂交的效果图。绿色方框中两个平行点蛋白质探针为ffil亚型I (isoform I);黄色方框 中探针为KLHL12 ;蓝色方框中为ZBTB2。
[0029] 图2为高密度蛋白质芯片与46份血清样本杂交后每份血清所识别的阳性探针的 数量比较。A为26份PBC血清识别阳性探针数量的分布；B为20份对照血清识别阳性探针 数量的分布。
[0030] 图3 PBC自身抗原蛋白质芯片的布局及抗GST抗体检测。A重新表达纯化的30个 PBC自身抗原及阳性对照(红色填充）和阴性对照(灰色填充）在芯片中的分布。B抗GST抗 体检测结果，所有30个重组抗原均带有GST标签，对照中AIV-NP为大肠杆菌表达，带6*Hi s 标签。
[0031] 图4大样本血清与PBC自身抗原芯片杂交局部效果图。A-D显示的是四份PBC血 清与芯片杂交的效果图；E-I显示的对照血清与芯片杂交效果图。
[0032] 图5在PBC血清中敏感度大于15%的7种已知PBC自身抗原与191份PBC血清及 321份对照组血清杂交后的信号分布。
[0033] 图6在PBC血清中敏感度大于15%的6种新鉴定的PBC自身抗原与191份PBC血 清及321份对照组血清杂交后的信号分布。
[0034] 图7 ELISA法检测KLHL12和ZBTB2分别与934份各种血清杂交反应的信号分布。
[0035] 图8部分血清与HKl (isoform I)和KLHL7的免疫印迹检测。

【具体实施方式】
[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0037] PBC的诊断是按照2000年AASLD确立的标准诊断（Heathcote，E. J. 2000)。所 有血清由北京协和医院风湿免疫科自2006年至2010年收集，所有疾病血清均来自临床确 诊患者。所有PBC血清均进行了 AMA、ANEA、ACA及核点型抗体以及AMA-M2的检测。AMA、 ANEA、ACA及核点抗体的检测是基于H印2细胞(德国Euroimmune公司）的免疫荧光技术。 而抗AMA-M2抗体的检测是利用anti-MIT3E kit (德国Euroimmune公司）试剂盒进行的 ELISA检测。所有AMA或/和抗M2抗体阴性的血清均满足PBC穿刺肝活检及生化检测的诊 断标准。下述实施例中涉及的各试验均得到北京协和医院伦理委员会的审核批准。
[0038] 实施例1利用高密度蛋白质芯片筛选候选PBC相关的自身抗原 高密度蛋白质芯片由美国约翰?霍普金斯大学朱衡老师实验室提供。每张高密度蛋 白质芯片中含有48个矩阵，每个矩阵包含800个探针，呈32X25的阵列排列。在芯片上每 种蛋白质探针有一个平行点，该蛋白质芯片包含16, 368种重组蛋白质。大部分重组蛋白 来自酿酒酵母宿主表达的相应基因全长0RF，且在N端具有GST标签（Jeong，2012)。该 高密度蛋白质芯片已经公开于 Jeong et al.，Rapid Identification of Monospecific Monoclonal Antibodies Using a Human Proteome Microarray, Molecular & Cellular Proteomics (2012. 2. 3在线公开），本领域技术人员可据此进行制备。
[0039] 由于所有芯片上的蛋白质探针N端均带有GST标签，因此首先使用鼠抗GST单克 隆抗体与芯片杂交验证芯片质量。接着挑取26份PBC确诊患者血清以及20份对照血清（5 份自身免疫性肝炎（AIH)血清、5份乙型病毒性肝炎（HBV)血清和10份健康人血清）与46 张芯片杂交，通过信号采集及数据分析鉴定候选的PBC相关自身抗原。
[0040] 1)芯片质量验证 利用抗GST抗体杂交蛋白质芯片，验证芯片上有效蛋白质探针的数量以及平行探针之 间的相关性，具体操作步骤如下： 取出-80°C保存的高密度蛋白质芯片后直接浸入3% BSA的封闭液中，37°C封闭Ih ; 取0.5iU小鼠抗GST单克隆抗体按照1:1000的比例稀释于3% BSA中，震荡混匀， 10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的一抗。芯片从封闭液中取出后，用吸水纸将多余 的封闭液从一侧尽量吸干，置于湿盒中。然后吸取180 稀释好的一抗加到芯片上，缓慢 加盖玻片，避免气泡产生，37°C孵育Ih ; 将孵育好的芯片置于PBST中，小心取下盖玻片，芯片放入洗盒中用37°C预热的PBST 40rpm漂洗3次，每次10分钟； 取0. 5 ill cy5标记的山羊抗小鼠IgG抗体，按照1:1000的比例稀释于3% BSA中，震 荡混勻，10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的二抗。从洗盒中取出芯片，用吸水纸从一 侧吸干多余的洗液，置于湿盒中。吸取180U1稀释好的二抗加到芯片上，缓慢加盖玻片， 避免气泡产生，37°C避光孵育二抗Ih ; 将孵育好的芯片置于PBST中，小心取下盖玻片，芯片放入洗盒中用37°C预热的PBST 40rpm避光漂洗3次，每次10分钟。然后再用37°C预热的纯水40rpm避光漂洗3次，每 次10分钟； 取出芯片，置于50ml离心管中，芯片上有探针的一侧朝外，2000rpm*3min离心，甩干 芯片上残余的纯水，LuxScan-lOK/A芯片扫描仪扫描芯片，每次杂交完成后都设置相同的扫 描参数扫描芯片。扫描仪的参数设置如下：光电倍增管（PMT)设置为850,激光能量（Power) 设置为95,扫描的像素为5um, 当芯片上探针的信噪比（SNR)大于3时，认为芯片上该探针可被检测，然后计算芯片上 可被检测的蛋白质探针的比例及每个探针的两个平行点之间的相关性。
[0041] 每张高密度蛋白质芯片上共计38400个探针点（包括阳性对照点和阴性对照点； 每种探针具有两个平行点)，其中包括16368种非冗余重组人源蛋白质。
[0042] 每张芯片上所有探针共组成48个矩阵，每个矩阵呈32X25的微阵列排列。由于所 有重组蛋白质探针的N端均带有GST标签，因此使用小鼠抗GST单克隆抗体进行检测芯片 上所有探针，确保用于血清筛选的芯片上绝大多数重组蛋白能被检测到。以每个蛋白质探 针的2个平行点的信号强度作做散点图，平行点之间的相关系数为97. 8%，显示平行探针点 之间具有良好的重复性。
[0043] 2)筛选候选PBC相关的自身抗原 筛选用血清的组成：26份PBC血清以及20份对照血清（5AIH血清、5HBV血清和10健 康人血清)。每一份血清与一张蛋白质芯片杂交,除了一抗为PBC患者血清或对照疾病血清 及二抗为cy5标记的羊抗人IgG抗体外，杂交方法如步骤1)中1-6。
[0044] 按照GenePix Pro 6.0软件的操作手册，将所有芯片扫描图片的亮度和对比度均 设置为99,然后使用芯片图像采集软件GenePix Pro 6.0分析并获取每张芯片上各靶标蛋 白质点杂交的信号强度。
[0045] 将GenePix Pro 6.0软件采集到的每张芯片上所有探针的信号信息导入Excel 表格中。每个探针点的前景信号强度（F635median)分别除以其周围背景信号强度 (B635median)作为该点的信号值。
[0046] Iij= F635median/ B635median Iij代表block j中的蛋白质i点的信号值。
[0047] 蛋白质抗原探针的信号值越趋近于1，说明血清中相应的自身抗体越无法检测到。 信号值越高说明自身抗体的结合靶标蛋白质抗原探针的能力越强。
[0048] 为了消除不同批次芯片及同一批次芯片上不同空间对杂交造成的差异，芯片数据 的处理采用芯片内归一化（within-chip normalization)的方法对每张芯片上的信号进行 归一化。即假设芯片内所有靶标蛋白是随机点制到基片上的，且只有很少部分(小于5%)的 靶标蛋白质作为自身抗原被血清中相应的靶标自身抗体识别而被检测到，因此芯片上信号 的分布是随机的，不同矩阵（block)之间是一致的。本研究设定每个block中的所有探针 点信号值的中位值是1，以此来归一化芯片上不同block内探针点的信号值。
[0049] 即 ij =Iij - median(Ij) + 1。
[0050] median(Ij)代表block j中所有点信号值的中位值，ij代表归一化后的block j 中的蛋白质i点的信号值。
[0051] 在此基础上，按照朱衡老师实验室已发表的文章（Hu，2009)中所述方法设定 cutoff值判断芯片上所有探针点是否为阳性。即计算整张芯片上所有点信号值的均值 I avCTage，以及所有信号值小于1的信号值的标准差SD，以IaveMge+6SD为cutoff值，来判断芯 片上的探针点是否为阳性。然后统计每份血清杂交的芯片上阳性反应的蛋白质抗原探针的 个数，利用非参数检验卡方检验（chi-square test,X2)或Fisher精确检验（Fisher exact test)确定候选的PBC相关自身抗原。同时，将特异性达到100%，敏感度不小于15%的抗原 也作为候选的PBC自身抗原。
[0052] 高密度蛋白质芯片与血清反应后的代表性局部图像如图1所示(方框内为差异的 蛋白抗原探针)。总体来说，无论是PBC患者血清，还是肝病对照组（AIH血清和HBV血清） 和健康人血清，都只能识别芯片上很少的蛋白。
[0053] 使用芯片内归一化的方法对每张芯片上的信号进行归一化，然后统计分析确定每 张芯片上的阳性探针。芯片上能够被每份血清识别的蛋白质的数目不尽相同，如图2所示， 蛋白质抗原被识别的数目在PBC与对照中基本没有区别。26份PBC血清识别的蛋白质抗原 的数目为70-709 (平均数土标准差：347± 191)，20份对照血清识别的蛋白质抗原数据为 74-1440 (429±306)。
[0054] 对于芯片上每个蛋白质探针是否为PBC相关的自身抗原，利用X2检验或Fisher精 确检验确定7个蛋白质为PBC特异反应的革巴标蛋白质抗原。同时，本研究亦将特异性达到 100%，敏感度不小于15%为标准，共有16个抗原也作为候选的PBC特异自身抗原。详细信 息如表1。
[0055] 表1小样本血清与高密度蛋白质芯片杂交筛选到23个候选PBC特异自身抗原。
[0056] 实施例2 PBC自身抗原蛋白质芯片的构建与血清筛选验证 利用实施例1筛选得到23个候选PBC自身抗原及9个临床上已知或最近几年文献报 道的PBC特异性自身抗体标记物制备PBC芯片时，芯片中计划表达的重组蛋白质抗原为32 个。但是由于一些不可控的因素，本实施例以其中的30个PBC相关自身抗原的继续开展研 究(表2)。
[0057] 将上述30个蛋白质抗原重新表达纯化用于制备PBC相关抗原蛋白质芯片，图3_A 为30个PBC相关自身抗原与对照探针在小芯片上的点阵布局。除了 30个PBC相关自身抗 原探针外，还包括阳性对照探针 1)AIV_NP (avian influenza virus- Nucleoprotein，禽 流感病毒核蛋白）;2)鼠IgG (鼠抗人IgG抗体);3)人IgG及阴性对照探针DBuffer (重 组蛋白洗脱液);2) GST标签蛋白。图3-B为抗GST抗体检测芯片上一个点阵中所有PBC相 关自身抗原的结果。
[0058] PBC自身抗原蛋白质芯片上所有35个探针都具有重复的双点。每张基片上共点制 12个点矩阵，在血清与芯片的杂交反应前，用围栏将每一个点阵隔离开，这样每一个点阵都 形成一个独立的空间，因此每张芯片可同时检测12份血清。
[0059] 与PBC自身抗原蛋白质芯片杂交的大样本血清包括43份AIH血清，55份HBV血 清，31份HCV血清，50份健康人血清，191份PBC血清，48份类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA)血清，45 份系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE)血清， 49份系统性硬皮病（Systemic Scler〇Sis，SSC)血清。图4为PBC自身抗原蛋白质芯片与 PBC血清及对照血清反应的代表性图像。从中可以明显的看到PBC血清杂交的结果中信号 强度大(红色）的探针数量明显比AIH，SSc，SLE等其他自身免疫性疾病多。
[0060] 对每个探针来说，首先计算50份健康人血清杂交信号的平均值及其标准差，采用 高于平均值五倍标准差的数值为cutoff值来判断所有血清与该探针是否呈阳性反应。然 后统计各个探针在191份PBC血清及个对照组血清中的阳性率。
[0061] 具体各血清组与芯片上所有30种蛋白质抗原阳性反应的例数及其阳性率见表2 (1种已知蛋白质抗原）和表3 (18种候选PBC蛋白质抗原)。
[0062] 表2各血清组与芯片上12种已知PBC自身抗原杂交反应呈现阳性的病例数及其 阳性率

【权利要求】
1. 原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原，其为EIF2C1。
2. 权利要求1所述的自身抗原作为生物标志物在制备原发性胆汁性肝硬化检测试剂 中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂为包被有权利要求1所述 的自身抗原的原发性胆汁性肝硬化检测芯片。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测芯片还包被BC0ADC-E2、 PDC-E2、0GDC-E2、E3BP、PDC-E1 β、PDC-E1 a、Gp210、p62、LBR、CENP-B、SplOO 和 Spl40 中 的一种或多种原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原。
5. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的检测芯片还包被质控抗原。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的质控抗原为鼠 IgG、人IgG和禽流 感病毒核蛋白中的一种或多种。
7. 原发性胆汁性肝硬化ELISA检测试剂盒，其特征在于，其含有酶标板，所述酶标板包 被权利要求1所述的自身抗原。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标板还包被BC0ADC-E2、 PDC-E2、0GDC-E2、E3BP、PDC-E1 β、PDC-E1 a、Gp210、p62、LBR、CENP-B、SplOO 和 Spl40 中 的一种或多种原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原。
【文档编号】C07K14/47GK104292322SQ201410465119
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年3月23日 优先权日:2012年3月23日
【发明者】李永哲, 吴 琳, 胡朝军, 宋光
申请人:中国医学科学院北京协和医院, 中国科学院北京基因组研究所