一种阳离子抗菌肽及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种阳离子抗菌肽及其制备方法与应用，所述阳离子抗菌肽序列为：SK1：FRWWR-NH2((Phe-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)，制备方法为固相化学合成法。本发明阳离子抗菌肽具有对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的广谱杀伤活性、较天然抗菌肽有更强的杀菌活性；结构简单、人工合成方便、不需要任何修饰连接；且溶血毒性小、对动、植物细胞无任何毒害作用的优点，在抗菌药物的开发和应用方面有很重要价值。
【专利说明】一种阳离子抗菌肽及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】，涉及抗菌肽及其制备方法和应用，具体涉及阳离 子抗菌肽及其制备方法和在治疗细菌感染疾病中的应用。
[0002]
【背景技术】
[0003] 自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染中取得了巨大的成就。但随 着目前抗生素的持续使用，微生物抗药性已成为微生物感染控制的重大问题，以至于现在 某些微生物细菌已没有控制杀灭的物质，如在临床药物治疗中，万古霉素抗性的葡萄球菌、 肠球菌以及其他革兰氏阴性菌感染疾病，这些疾病的治疗均是世界范围内的难题。
[0004] 抗菌肽是一类广泛存在于微生物及动植物体内的小分子多肽，通常由30多个氨 基酸残基组成，分子量为2-7KDa。抗菌肽的杀菌机制在于它能破坏细菌的细胞膜，致使细胞 内容物因高渗透压而溢出，最终导致细菌死亡。
[0005] 抗菌肽因广泛的生物学活性而在医学上显示出良好的应用前景，但现有天然抗菌 肽在含量、抗菌活性和溶血作用等方面还存在缺陷。由于抗菌肽在动物体内含量极微，从动 物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，这成为制约天然抗菌肽进入实际 应用的最大障碍。
[0006] 近年来，合成多肽在人体中的作用已越来越多地被科学界发现，其产生的医药效 果也引起了人们的高度关注。其中阳离子抗菌肽可以作为一类新型的抗生素，把细胞膜作 为主要靶点，通过在细胞膜上聚集并导致细胞通透性的增加，从而使细胞膜丧失其屏蔽功 能，进而导致细胞死亡。然而，目前公开的阳离子抗菌肽的结构复杂、抗菌活性较低且具有 较高的溶血毒性，因此，开发具有结构简单、抗菌活性高、化学合成容易且溶血毒性低特点 的阳离子抗菌肽迫不可待。
[0007]
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种结构简单、抗菌活性高 且溶血毒性低的阳离子抗菌肽。
[0009] 本发明的另一个目的是提供快捷、简便的一种阳离子抗菌肽的制备方法。
[0010] 本发明还提供上述阳离子抗菌肽的应用。
[0011] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种阳离子抗菌肽，其特征在于，在天 然发现的抗菌肽序列Lactoferricin B4-9 (RRWQWR)的基础上，结合虚拟组合库设计技术， 设计一组含有5个氨基酸的多肽序列，序列为：SKl :FRffffR-NH2 ((Phe-Arg-Trp-Trp-Arg-N H2)。
[0012] 上述阳离子抗菌肽的制备方法，采用固相化学合成法从N末端到C末端合成；具体 包括如下步骤： (1) 抗菌肽的制备： 制备从N端到C端逐个进行，由多肽合成仪自动控制；首先称量0. I mmol的结合了第 一个氨基酸即Phe的树脂，装柱，再用20%(v/v)哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，然后用二甲 基甲酰胺清洗，将用9-笏甲氧羰基（Fmoc)保护的氨基酸Arg溶解于碳二亚胺（DCC)，并加 入羟基苯并三唑（HOBt)/二异丙基乙基胺（DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30 min后，用三氟乙酸（TFA)清洗，并重复以上脱保护到偶合反应步骤直到SKl序列中所有氨 基酸均被接入，制备结束，以乙醚将三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固体粗品抗菌肽； (2) 抗菌肽的纯化： 称量IOmg干燥后的固体粗品抗菌肽SK1，溶于IOmL 0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超 纯水溶液中，样品处理后用反相液相色谱（Vydac 218TP1022柱，2. 2X25cm)进行纯化，洗 脱液：流动相A为0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超纯水溶液，流动相B为0. 1% (v/v)的乙 腈（ACN)超纯水溶液；洗脱梯度为：A相：5%?30% (v/v);流速15 mL/min，检测波长220nm， 进样体积为4 mL，收集洗脱峰；并将反相液相色谱（RP-HPLC)纯化出来的目标峰放置冻干 机中，在_50°C冻干后，再用质谱确认正确与否，HPLC检测纯度。
[0013] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果： (1)本发明阳离子抗菌肽结构简单，且人工合成方便，不需要任何修饰连接，为本发明 大规模制备奠定了基础。
[0014] (2)本发明阳离子抗菌肽SKl高浓度下的溶血率非常低，表明本发明抗菌肽的溶 血毒性极小，为实际应用开发奠定了基础。
[0015] (3)本发明阳离子抗菌肽SKl对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱杀伤活 性，并较天然抗菌肽具有更强的杀菌和抑菌活性。
[0016] (4)本发明阳离子抗菌肽SKl作用机制不同于传统抗生素，对实验的多种耐药菌 均有良好的抗菌作用，拟开发为一种抗耐药菌药物。
[0017] (5)本发明阳离子抗菌肽SKl在琼脂孔穴扩散法测定体外活性时，能保持长时间 的抗菌活性，表明抗菌肽具有良好的抗水解能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明阳离子抗菌肽SKl的质谱图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0021] 实施例中，所有用于制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司，所有用于 活性测定试验的各种菌株均购于中国生物制品检定所。
[0022] 本发明设计如下：在Lactoferricin B4_9(RRWQWR)基础上，结合虚拟新合库设计技 术，使用DNAstar，Bioedit，sequence logo等分析软件和网站，通过氨基酸替换与截取后获 得系列五肽分子，并经系列试验之后，发现该抗菌肽具有显著抗菌活性，而且相比LfcinB6 未出现溶血毒性，有望作为治疗细菌感染的新药研究和开发。
[0023] 实施例1 : (1)抗菌肽的制备（以制备0. Immol量为例）： 制备从N端到C端逐个进行，由pioneer多肽合成仪自动控制。首先称量0. Immol的结 合了第一个氨基酸即Phe的树脂（购于美国应用生物系统公司），装柱，再用20%(v/v)哌啶 二甲基甲酰胺溶液脱保护，然后用二甲基甲酰胺清洗，将用9-笏甲氧羰基（Fmoc)保护的氨 基酸Arg溶解于碳二亚胺（DCC)，并加入羟基苯并三唑（HOBt)/二异丙基乙基胺（DIPEA)， 溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30min后，用三氟乙酸（TFA)清洗，并重复以上脱保护到 偶合反应步骤直到SKl序列中所有氨基酸均被接入，制备结束，（具体操作步骤见pioneer 多肽合成仪操作指南），以乙醚将三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固体粗品抗菌肽。
[0024] (2)抗菌肽的纯化： 称量一定量（IOmg)干燥后的固体粗品抗菌肽SK1，溶于IOmL 0. 1% (v/v)的三氟乙酸 (TFA)超纯水溶液中，样品处理后用反相液相色谱（Vydac 218TP1022柱，2. 2 X 25cm)进行 纯化，洗脱液：流动相A为0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超纯水溶液，流动相B为0. 1% (v/ v)的乙腈（ACN)超纯水溶液；洗脱梯度为：A相：59^30% (v/v);流速15 mL/min，检测波长 220nm，进样体积为4mL，收集洗脱峰。并将反相液相色谱（RP-HPLC)纯化出来的目标峰放置 冻干机中，在_50°C冻干后，再用质谱确认正确与否，HPLC检测纯度。
[0025] (3)抗菌肽的鉴定： 参见图1，制备的阳离子抗菌肽SKl经过MALDI-T0F和EPI质谱（MS)分析，质谱条件 为：ESI正离子模式，喷雾电压：4. 5 KV;鞘气：35 arb ;辅助气：10 arb ;毛细管温度：300 °C ;碰撞气：氦气（I. 5 mtorr)，结果显示，SKl在质谱图中显示分子量为848. 99,由多肽序 列计算出的理论值为849. 00。即证明制备的多肽为设计的SKl抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽 产物备用。
[0026] 为了深入研究本发明阳离子活性肽SKl的结构与功能的关系，利用美国应用系统 生物公司生产的Pioneer多肽阳离子仪制备本发明公开的阳离子抗菌肽SKl和作为对照的 抗菌肽LfcinB6，进行以下活性测定试验。
[0027] (4)抗菌肽杀菌活性的测定： 采用琼脂板扩散法对合成抗菌肽SKl的杀菌活性进行检测，并以固相化学法合成的抗 菌肽LfcinB6作为对照，评价本发明中抗菌肽SKl的杀菌活性，步骤如下： 菌种复苏，分别接种斜面于37 °C培养过夜，再挑菌于普通LB培养基中，37 °C培养过夜， 稀释菌液使菌浓度为IO5?IO6Cfu /mL，按每个平板100 ii L菌液接种于15mL LB固体培养 皿中，待凝固且涂布均匀后，打孔5mm，3个/平板，分别加入浓度为I mg/mL的阳离子抗菌 肽SKl溶液、I mg/mL的LfcinB6溶液和超纯水各10 ii L溶液（LfcinB6作为阳性对照，超 纯水作为阴性对照），4°C静置3h后，将平板置于37°C培养8h，测量抑菌圈大小，判定杀菌能 力，同时观察抑菌圈在7d之内的变化，判定杀菌持续时间长短。结果见表1。
[0028] 表I I mg/mL抗菌肽对不同细菌的抗菌活性的测定比较
【权利要求】
1. 一种阳离子抗菌肽，其特征在于，在天然发现的抗菌肽序列Lactoferricin B4_9(RRWQWR)的基础上，结合虚拟组合库设计技术，设计一组含有5个氨基酸的多肽序列，序列 为：SKI :FRffffR-NH2((Phe-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)。
2. -种如权利要求1所述阳离子抗菌肽的制备方法，其特征在于，采用固相化学合成 法从N末端到C末端合成；具体包括如下步骤： (1) 抗菌肽的制备： 制备从N端到C端逐个进行，由多肽合成仪自动控制；首先称量0. 1 mmol的结合了第 一个氨基酸即Phe的树脂，装柱，再用20%(v/v)哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，然后用二甲 基甲酰胺清洗，将用9-笏甲氧羰基（Fmoc)保护的氨基酸Arg溶解于碳二亚胺（DCC)，并加 入羟基苯并三唑（HOBt)/二异丙基乙基胺（DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30 min后，用三氟乙酸（TFA)清洗，并重复以上脱保护到偶合反应步骤直到SK1序列中所有氨 基酸均被接入，制备结束，以乙醚将三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固体粗品抗菌肽； (2) 抗菌肽的纯化： 称量10mg干燥后的固体粗品抗菌肽SK1，溶于10mL 0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超 纯水溶液中，样品处理后用反相液相色谱（Vydac 218TP1022柱，2. 2X25cm)进行纯化，洗 脱液：流动相A为0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超纯水溶液，流动相B为0. 1% (v/v)的乙 腈（ACN)超纯水溶液；洗脱梯度为：A相：5%?30% (v/v);流速15 mL/min，检测波长220nm， 进样体积为4 mL，收集洗脱峰；并将反相液相色谱（RP-HPLC)纯化出来的目标峰放置冻干 机中，在_50°C冻干后，再用质谱确认正确与否，HPLC检测纯度。
3. 如权利要求1所述阳离子抗菌肽在制备治疗细菌感染疾病药物中的应用。
4. 如权利要求1所述阳离子抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌疾病 药物中的应用。
【文档编号】C07K1/06GK104356202SQ201410615808
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】王远强, 周朋朋, 夏庆友, 赵萍, 林治华, 丁元, 钟晓武 申请人:西南大学