专利名称：制备寡肽－醛的方法
技术领域：
本发明涉及一个可运用于清洁剂的寡肽醛的制造方法寡肽醛及其在液状清洁剂中的运用已被普遍熟知。如WO 94/04651所说明的寡肽醛的优点在于能够以极小的浓度加入使用却又能够作为敏感的蛋白酶抑制剂发挥很大的效应。这一特性又附加另一优点，即在清洁剂中还可加入本身对蛋白分解敏感的酶。
根据US-A-4,339,065(DE-A-32 00 812)可以制备寡肽醛，这里以三肽为例按标准步骤由内酰胺与氢化锂铝在四氢呋喃(THF)中还原生成醛。该方法也应用于EP-A-0 185 390中。
根据WO 94/04651制备四肽醛分二个阶段首先由四肽的酯借助于NaBH4在乙醇和四氢呋喃中获得相应的醇，该醇紧接着在CH2Cl2内″Dess-Martin″的作用下在NaHCO3/Na2S2O3内进一步反应后完全氧化成醛。
最后所述的方法有某些亟待于改进的缺点。总之，二个阶段方法较之可能的一个阶段方法有较小的空间/时间收率。此外所使用的化学剂本身有其缺点，一方面是因其自身另一方面是在方法实施时其效应中利用CH2Cl2的指定方法毫不具备优点。因为基于安全的角度，NaBH4和″Dess-Martin″的利用根本不可能套用这样的一个反应作为技术尺度标准(较小的利用率，价格，放热反应，反应进行的可靠性)。因其在水中的溶解度小，NaHCO3的应用也具有缺点。在应用保护基丁氧羰基(BOC)的情况下在寡肽的氨基终末端进行所说的反应步骤(还原/氧化)。这里所希望的是创造较易释放保护基的条件。
所以本发明的目的是研究出一种新的方法将寡肽在C-终末端转化成寡肽醛。该方法应不再有以上所述现有技术下的缺点。本发明的方法应该在技术标准下也能施用。
通过制备可逆性被保护的寡肽醛的方法而达到了上述目的，其特征为，在N-终末端可逆性被保护的寡肽醇在缓冲过的溶剂混合剂(它含有不可氧化的，极性的和不与水相混的溶剂和溶解少量的水)中与一个化学量的溴化钠相混合，其醇在冷却下用一个催化量的2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)或者其衍生物氧化，反应混悬液与次氯酸钠的水溶液混合，然后加入还原剂结束反应。
反应混合物按照如下方法处理，即分隔开这二个相，水相用一个不可氧化的、极性的和不与水相混的溶剂萃取，最后由合并的有机相获得N-终末端被保护的寡肽醛。
醋酸乙酯作为不可氧化的、极性的和不与水相混的溶剂尤为适合。
按照本发明，溶剂混合剂中的水含量必须尽可能地少，尤其是≤10％，优选≤5％。
尤其是使用碳酸氢钠或者碳酸氢钾作为溶剂混合剂的缓冲剂。特别优选1-10％、特别是3-5％的碳酸氢钠溶液。
利用2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)或者其衍生物之一作为生成醛的氧化反应的催化剂。作为该衍生物的可考虑4-羟基-衍生物或更值得推荐的是4-乙酰胺-衍生物。特别优选的当然是未被取代的TEMPO(未衍生的)。
次氯酸钾溶液的浓度为10-20％，优选12-15％。
按照本发明，相分离前在混悬液中加入还原剂而结束反应。还原剂优选是能溶于水者。特别优选的是连二亚硫酸盐，亚硫酸盐和/或硫代硫酸盐，尤其是碱金属硫代硫酸盐，特别是硫代硫酸钠-(五水合)。
作为N-终末端的保护基团可以用所有专业人员熟知的可再解离(可逆性的)的保护基团。例如苄氧羰基，叔丁氧羰基(BOC)，甲氧羰基(MOC)，乙氧羰基(EtOC)；尤其优选甲氧羰基(MOC)和/或乙氧羰基(EtOC)。
形成的反应混合液(混悬液)的二个相被分离，并且其水相尤其用醋酸乙酯萃取。合并的有机相用水再萃取。
通过将水/醋酸乙酯混合液蒸馏挥发而离析生成物。紧接着可以由非极化溶剂尤其是由正丙烷或正己烷沉淀(醛)生成物而额外提纯之。
加入溴化钾后应必须将反应混合物冷却到-5至+5℃，最好是0℃，并且置于此温度下直至加入还原剂后结束反应为止。
根据本发明的方法，能够以高到令人惊异的90-100％的收率、优选为90-96％的收率制备出寡肽醛。
施用本发明方法还有一个优点，即明显降低了副产物的生成。基本上完全抑制了醛的过度氧化。
根据四面体简讯(Tetrahedron Letters)，33卷，35期，5029-5032页，TEMPO常常只是作为氧化催化剂用于由α-氨基醇和α-烷氧基醇制备相应的醛类。此时，反应在甲苯/水的混合液中利用碳酸氢钠缓冲剂进行。相分离后还原剂加入进到有机相中。这个反应过程只有较小的收率。尤其是不能有效地控制反应产物的过度氧化。所描述的快速混合反应混合物似乎对过度氧化没有大的影响(5030页，第二段，第2和3句)。
若将用TEMPO氧化低分子α-氨基醇和α-烷氧基醇的氧化条件套用在高分子而非极性的寡肽醇，则尤其要面临的是以下所述，即按照这些文献的实施例，分子链越长，收率越低，并且N终末端只是简单地被保护。因此专业人员一般都不会考虑用仅仅简单被保护的N终末端寡肽来氧化长链。所以如果套用则应将收率比利用低分子化合物时的收率估计得更低一些。令人惊异的是按照本发明方法在本发明的条件下用TEMPO作为氧化催化剂就可获得很高的收率。
同如上所述用TEMPO氧化α-氨基醇和α-烷氧基醇相比，本发明方法除有较高的收率外还有以下惊人的优点加入还原剂后，这里是用硫代硫酸钠，可以省却加入磷酸盐以调节pH值至7这一步骤。同时也省去了用饱和NaCl溶液额外萃取这一步骤。最后只是描述了粗产物的制备，但不是怎样获得纯净的寡肽。在本发明方法中由非极化溶剂例如正庚烷或正己烷沉淀可获得高度纯净的产物，该沉淀方法具有优点。
本发明方法所指的可应用的寡肽醛为具有2至50个氨基酸的寡肽或者其混合物。本发明方法的起点为加入肽链，其C-终末端具有醇功能(-OH)，它们在本方法的实施中自动转换成相应的醛功能(-H)。寡肽醛的这些特点及其制备方法由US-A-5 015 627，EP-A-0 185 930和DE-A-32 00 812已被熟知。
本发明方法优选由2-10个氨基酸、尤其是2-6个特别、是3-4个氨基酸所组成的寡肽醛。
根据使用范围和清洁剂中存在的蛋白酶，可有下列各种带有3个氨基酸的寡肽醛Lys-Ala-LysH，Ile-Phe-LysH，Phe-Pro-ArgH，Phe-Val-ArgH，Lys-Ala-AlaH，Ala-Ala-ProH，Gly-Ala-LeuH，Gly-Ala-LeuH，Gly-Ala-PheH，Leu-Leu-PheH，Ala-Ala-PheH，Leu-Leu-TyrH，Val-Pro-ValH，Ala-Val-LeuH，Lys-Ala-AlaH，Ala-Ala-ProH，Gly-Ala-LeuH和Gly-Ala-PheH.
此外还有以下带有4个氨基酸的寡肽醛Phe-Gly-Ala-PheH，Phe-Gly-Ala-LeuH。
特别优选的是带有4个氨基酸的寡肽醛，尤其是由Phe，Gly，Ala和LeuH组成的氨基酸。特别是Phe-Gly-Ala-LeuH。
在本发明方法中寡肽醛的N-终末端被专业人员所熟知的保护基所保护。优选的保护基为BOC和EtOC，特别是EtOC。(BOC＝丁氧羰基；EtOC＝乙氧羰基)。
制备本发明方法所需的寡肽醇是专业人员所熟知的。在此值得一提的是专利文献(US-A-5 015 627，EP-A-185 930，DE-A-32 00812)以及教科书著者Houben-Weyl《有机化学方法》(Methoden der organischenChemie)，斯图加特市(Stuttgart)，1994年，15/1卷和15/2卷；著者Ullmann的《工业化学百科全书》(Encyclo Pdie der technischen Chemie)，魏因海姆市(Weinheim)，1980年，第4版，19卷，542-551页；还有其它的文献如著者J.Johanes《氨基酸和肽合成》(Amino Acid and PeptidSynthesis)，牛津科学研究出版杂志(Oxford Science Publications)，牛津(Oxford)，1992年。
经过在溶剂中极好的结合过程而制备目标化合物，即N-终端被保护的寡肽醇。一种方法是通过系列合成步骤即通过结合各个氨基酸组成部分而逐步组成肽；另一种方法是通过聚合合成步骤逐步组成肽而优选组合成二个二肽，在接着的下一步(聚合)中将它们互相结合。
合成时可以再将所熟知的保护基团用于N-末端和C-末端。
N-末端苄氧羰基，叔丁氧羰基，甲氧羰基，乙氧羰基。
C-末端甲基酯，乙基酯，苄基酯，硝基苄酯。
肽组成部分(Peptidbinding)的自身结合也是专业人员所熟知的。为使明确化，需提及以下方法-经由混合酐而结合，酐例如通过与氯甲酸异丁酯或者丙烷磷酸酐转换而制备，-经由O-酰基异脲而结合，O-酰基异脲通过与双环己基碳化二亚胺转化形成(DCC-方法)，-经由活化酯而结合，或-经由羧酸叠氮而结合。
以下的实施例详细说明按本发明方法制备寡肽醛，这里是EtOC-Phe-Gly-Ala-Leu-H。
3,8g EtOC-Phe-Gly-Ala-亮氨醇(Leu-OH)搅拌下加入到100ml醋酸乙酯，加入10ml水和0,9g溴化钠后的混合物冷却至0℃。接着加入4,8g碳酸氢钾以及0,01g TEMPO(2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基)。在冷却下和剧烈搅拌下将5g次氯酸钠(13％)与10ml水的混合液在15分钟内滴入生成的混悬液中。0℃下继续搅拌10分钟后通过加入3g五水硫代硫酸钠将混悬液在27ml水中浸冷。
将反应混合物的二个相相互分离，水相用总共20ml的醋酸乙酯萃取。接着将合并的有机相用水再萃取。溶剂在真空中浓缩后用正庚烷沉淀便可获得3,7g纯净醛(96％d.Th.)。
图1和图2所示的1H-NMR谱和MS谱显示了EtOC-Phe-Gly-Ala-Leu-H的特征。
权利要求
1.可逆性被保护的寡肽醛的制备方法，其特征为在一个缓冲过的溶剂混合液中(该混合液包含一个不可氧化的，极性的和不与水相混的溶剂与少量水相溶解)在N-终末端可逆性被保护的一个寡肽醇与一个化学量的溴化钠相混合，在冷却下该醇与一个催化量的2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)和/或一个其衍生物氧化，反应混悬液与次氯酸钾的水溶液混合，最后加入还原剂结束反应。
2.按照权利要求1的方法，其特征为利用苄氧羰基，叔丁氧羰基，甲氧羰基或乙氧羰基作为N-终末端的保护基。
3.按照权利要求1或2的方法，其特征为将醋酸乙酯作为不可氧化的，极性的和不与水相混的溶剂加入使用在溶剂混合液中。
4.按照权利要求1或3的方法，其特征为该溶剂混合液的水含量可达10％，优选5％以下。
5.按照权利要求1，3或4的方法，其特征为利用碳酸氢钠和/或碳酸氢钾，优选碳酸氢钾，作为溶剂混合液的缓冲剂。
6.按照权利要求1的方法，其特征为利用2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)和/或其衍生物之一，例如4-羟基-或4-乙酰胺-衍生物，作为催化剂。
7.按照权利要求1至6的方法，其特征为利用连二亚硫酸盐，亚硫酸盐和/或硫代硫酸盐，尤其硫代硫酸钠，作为还原剂。
8.按照权利要求1至7的方法，其特征为所利用的寡肽醇带有2-10个氨基酸，优选2-6个，尤其是3-4个氨基酸。
9.按照权利要求1至8的方法，其特征为所利用的寡肽醇带有的氨基酸为Phe，Gly，Ala和Leu，或者Phe，Gly，Ala和Pe，尤其是Phe-Gly-Ala-LeuOH。
10.按照权利要求1至9的方法，其特征为寡肽醛通过从正庚烷和/或正己烷结晶而得。
11.按照权利要求1至10的方法，其特征为寡肽醇由系列合成或聚合合成方法制备，优选聚合合成。
12.寡肽醛，它们可以用权利要求1至11中的一项或多项的方法制备。
全文摘要
本发明涉及制备寡肽醛的一种方法,其特征为:N－终末端可逆性被保护的寡肽醇于缓冲过的溶剂混合液中与一个化学量的溴化钠相混合,该溶剂混合液含有不可氧化的,极性的和不与水相混的溶剂并与少量水相溶解,冷却下醇与一个催化量的2,2,6,6－四甲基－哌啶－N－氧基(TEMPO)或者其衍生物氧化,反应混悬液与次氯酸钠的水溶液相混合,最后加入还原剂后结束反应。这样制备的寡肽醛可以运用在清洁剂中。
文档编号C07K1/107GK1169999SQ9710242
公开日1998年1月14日 申请日期1997年2月3日 优先权日1996年2月12日
发明者W·里伯茨因斯基, K·克塞勒 申请人:赫彻斯特股份公司