专利名称：一种新的免疫毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由生物工程技术制备的免疫毒素，特别是涉及一种用人源性毒素穿孔素(perforin)的活性片段作为毒素分子，通过基因工程技术将穿孔素的活性片段与载体相结合而制成的免疫毒素。
目前，所用的大多数毒素仍为异源性毒素，细菌或植物来源，如绿脓杆菌外毒素PE，白喉杆菌外毒素DT，蓖麻毒素Ricin等，动物实验和临床使用已证明这类毒素可唤起机体对毒素的免疫反应，体内产生的抗体可中和免疫毒素的细胞毒活性。此外，目前所用毒素均属于细胞内毒素，包括人源毒素RNA酶(血管生成素等)，要发挥作用，首先涉及到毒素的内化(endocytosis/internalization)，毒素能够被载体顺利携带使之内化，并能转运至胞质中才能发挥作用。不能内化或不能适当转运则无活性，不能杀伤靶细胞。应用人源性毒素(如血管生成素)作为毒素分子，由于其作用过程亦需内化，作用机制与经典毒素类似，用这种免疫毒素治疗恶性肿瘤，更有刺激肿瘤血管增生之虑，并未得到广泛接受和应用。
本发明的目的在于提供一种对人体不具有免疫原性，有严格靶向性，可直接激发细胞膜损伤过程，不需内化及细胞内转运过程的免疫毒素。
实现本发明的方法是以PCR技术扩增编码细胞因子或者抗体的基因片段，以及编码穿孔素(Perforin)活性部位的基因片段，与表达载体(Expression Vector)连接，转化大肠杆菌，诱导表达融合蛋白，复性并分离纯化得到免疫毒素。
与已有技术相比，本发明的突出优点是人源性毒素穿孔素的活性片段为人体固有蛋白，又是一种膜损伤性毒素，长期反复应用不会发生过敏或免疫反应，也不需要内化。杀伤靶细胞的过程直接、迅速，与已有技术相比，杀伤时间可缩短3-100倍。本发明可广泛在生物工程领域的各类生产单位实施，可用于治疗某些肿瘤、自身免疫性疾病，特别适合用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。
实施例一、IL2HPN34重组免疫毒素的质粒构建1.扩增不含终止密码的IL2 cDNA片段取冻存的分别含pBV221/IL2原核表达质粒和pBV221原核表达质粒的菌株，划线接种于含氨苄青霉素的LB-琼脂培养板上，30℃培养20小时，挑取单菌落接种于10ml含氨苄青霉素的LB培养基30℃振摇过夜，采用小量快速质粒提取法，提取质粒作为模板。
IL-2上游引物5′GGG AAT TCC ATG GCA CCT ACT TCAA3’，5’端包含有EcoRI酶切位点，ATG起始密码，但不含信号肽序列，IL2下游引物5’-GCC GGA TCC AGT TAG TGT TGA GA-3’不含终止密码，含BamHI酶切位点。
以适度稀释的pBV221/IL2质粒DNA为模板，以特异性引物，经PCR扩增不含终止密码的IL2 cDNA片段，反应条件如下反应体系去离子水30μl25mM MgCl23μl4×dNTP 4μl(每钟200μM)上游引物2.5μl(25pmol)下游引物2.5μl(25pmol)
模板1μl(～100ng)经95℃变性10分钟，加入Taq DNA聚合酶2u表面覆盖液体石蜡以防蒸发，94℃，50秒变性，55℃，50秒退火，72℃，1分钟延伸，30个循环，最终72℃延伸10分钟，循环完毕，取反应产物5μl，2.0％琼脂糖凝胶电泳，以DNA分子量标准物为参照，紫外灯下观察扩增结果。扩增产物为420bp片段。经电泳证实后，以酚氯仿抽提，乙醇沉淀，风干后溶于适量去离子水中备用。
2.人穿孔素(HP)cDNA活性片段的制备HPN34上游引物5’GCC GGA TCC CCG TGC CAC ACA GCCGCA 3’起始于HP第一个氨基酸，含BamHI酶切点，不含起始密码，下游引物5’-CCG CTG CAG TTA GCG GCG GAG GCT GGTCA3’，与nt85 nt102互补，含Pst1酶切位点及终止密码。
取冻存的含PCDM8/HP质粒的菌株，划线接种于含氨苄青霉素和四环素的LB-琼脂板上，37℃培养20小时，挑取单菌落，于10ml含两种抗菌素的LB培养基中37℃的振荡过夜，采用小量快速质粒提取法提取质粒。
以PCDM8/HP质粒为模板，加入特异性HPN34引物，经PCR扩增，反应体系同前。
3. pBV221/IL2 HPN34质粒构建及工程菌建立①取不含终止密码的IL2基因片段，HPN34基因片段，以及质粒pBV221，分别用EcoRI/BamHI，BamHI/PstI，EcoRI/PstI双酶切，酶切体系20μl，37℃ 3小时，取少量酶切产物电泳，证实pBV221已被切开，经低溶点琼脂糖凝胶电泳回收线化的pBV221质粒，及经酶切的IL2，HPN34基因片段，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于适量去离子水中，三者按一定比例混匀，加T4连接酶及连接缓冲液，总量20μl，16℃连接过液。连接产物置4℃备用。
②DH5α感受态细胞的制备-70℃冻存的DH5α菌株，划线接种于LB琼脂培养板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接种于50mlLB培养液中，37℃剧烈振摇培养，至OD600，达0.3～0.4时，将菌液转移至50ml无菌离心管，冰浴10分钟，4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，加入预冷的0.1M无菌CaCl2溶液10ml，重悬细菌，冰浴10分钟，4℃，4000rpm，离心沉淀细菌，再以2ml预冷的0.1M CaCl2溶液重悬，分装至1.5mlEppendorf管备用(200μl/支)。
③重组质粒的转化取制备的感受态细胞200μl，加入连接产物5μl(50ng)，混匀后冰浴30分钟，42℃循环水浴2分钟后，迅速置冰浴中2分钟，加800μl LB培养基，30℃振荡培养1小时，取100μl菌液用无菌玻棒涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养板，30℃培养20小时，观察菌落生长情况。
二、重组体IL2HPN34融合蛋白的表达和初步纯化(一)证实pBV221/IL2HPN34表达融合蛋白①待测样品准备，取经证实含有pBV221/HPN34质粒的菌株，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃扩增细菌至OD6000.5，升温至42℃，诱导表达3小时(对照不升温诱导)。4℃，4000rpm离心，沉淀细菌，加1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃水浴变性5分钟备用。
②SDS-PAGE电泳检测IL2HPN34融合蛋白表达。照仪器说明书安装电泳装置，按《分子克隆实验指南》配制15％，Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶及5％的积层胶，并灌制胶板。等凝胶聚合后，取上述制好的样品，依次加样，每孔15μl，电泳(积层胶70V，分离胶140V)，至溴酚兰到达分离胶下缘，停止电泳，取下凝胶，考马氏亮兰染色4小时，甲醇醋酸脱色至条带清晰，背景透明。可见诱导株出现一条约18-20KD的蛋白条带，与预期的蛋白分子量相符。
(二)IL2HPN34大量表达及初步纯化选择表达阳性菌株，接种于100ml含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃振摇培养至OD6000.5，升温42℃诱导表达3小时，4℃，4000rpm离心收菌，重悬于适量细菌破碎缓冲液(20mM Tris 50mMEDTA.pH7.5)，加入溶菌酶(1mg/1ml)，室温下放置30分钟，冰浴下超声粉碎，在含1％ Triton-X100的洗涤液及含2％脱氧胆酸钠的洗涤液中反复多次离心，(1％ Triton-X100，30mM Tris，50mMEDTA，2％脱氧胆酸20mM Tris，50mM EPTA，pH7.5)，获得包涵体。6M盐酸胍裂解包涵体，以0.1M Tris(pH8.0)复性缓冲液，室温下稀释复性，复性产物对生理盐水透析，除去盐酸胍等杂质。然后经硫酸铵分段沉淀(30％及80％饱和硫酸铵)，沉淀产物透析除盐，过滤除菌，即得到粗制IL2HPN34。
还可根据上述原理制备出以穿孔素其它活性片段作为毒素分子的免疫毒素。
权利要求
1.一种由载体分子与毒素分子经基因工程技术制备的免疫毒素，其特征在于所述的免疫毒素的毒素分子是穿孔素(Perforin)的活性片段。
全文摘要
本发明涉及一种新的免疫毒素,其特征在于利用人源性毒素穿孔素(Perforin)的活性片段作为毒素分子,通过基因工程技术将毒素分子与载体分子的基因重组在大肠杆菌中表达出的免疫毒素,其优点是对人体不具有免疫原性,有严格靶向性,可直接激发细胞损伤过程,杀灭靶细胞,不需要内化及细胞内转运过程,可用于治疗某些肿瘤和自身免疫性疾病。特别是适合用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。
文档编号C07K2/00GK1254717SQ9811302
公开日2000年5月31日 申请日期1998年11月24日 优先权日1998年11月24日
发明者王一理, 司履生 申请人:西安医科大学