专利名称：一种活性肽的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种活性肽，特别涉及一种具有促进血小板生成功能的活性肽。
血小板生成素，简称TPO，是一种作用于巨核细胞——血小板系统的细胞因子，它能够诱导巨核细胞分化，最终使血循环中的血小板数量升高。血小板生成素对于提高血循环中血小板数量是相当有效的，做为一个含332氨基酸残基的蛋白质，它也存在着免疫原性强，制做成本高，不能口服等方面的不足。近年来，国外有单位报道得到了分别具有促进血小板生成活性和促进红细胞生成作用的活性肽，如1997年美国的Steven E等人报道从肽库中筛选出一种具有与TPO促血小板生成功能相似的活性肽，其结构式为IEGPTLRQWLAARA，其单体作用于Ba/F3-mpl依赖株细胞的EC50为400nmol/L，二聚体为100pmol/L，用药量为250μg/Kg/天时，能刺激小鼠血循环中血小板数升高；但这种结构的活性肽的不足是活性偏低，难以满足实际需要。
本发明的目的在于提供一种活性提高的具有促进血小板生成功能的活性肽。
本发明的目的是这样实现的采用多肽固相合成法设计合成的活性肽单体的序列为IEGPTLRQWLAARAC，在该活性肽的C端进行酰胺化修饰后形成的肽链结构为IEGPTLRQWLAARAC-NH2，利用单体肽链羧基端的半胱氨酸进行分子间氧化形成的二聚体结构为
采用了上述结构的活性肽，具有以下优点1.本活性肽单体与公知活性肽链IEGPTLRQWLAARA相比，由于在公知肽链单体结构中加入了一个半胱氨酸，以支持Ba/F3-mpl细胞生长的EC50值表示，活性提高了20倍，即EC50≤20nmol/L。
2.在本活性肽单体的C端进行酰胺化修饰后形成的酰胺化肽链IEGPTLRQWLAARAC-NH2的活性比单体肽链提高了10倍，即EC50≤2nmol/L。
3.利用单体肽链羧基端的半胱氨酸进行分子间氧化形成二聚体
其活性比单体提高了100倍，即EC50≤200pmol/L。
4.分别用本活性肽单体和酰胺化肽链进行小鼠体内试验，当给药量分别为≤230μg/Kg/天和≤140μg/Kg/天时，可以显著提高小鼠血循环中的血小板数，活性较公知活性肽有所提高。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
A.合成肽链(1)使用Perkin-Elmer公司的ABI 433A型多肽合成仪、选用Fmoc/HOBt/DCC0.10mmol模式，采用多肽固相合成法进行活性肽单体和酰胺化肽链的合成，合成中所用氨基酸用Fmoc保护，合成用树脂为HMP树脂。合成结束后用含0.75g结晶酚，0.25ml二巯基乙醇，0.5ml硫代苯甲醚，0.5ml去离子水，10mlTFA三氟乙酸的切割试剂将肽从树脂上切割下来。用反相高效液相色谱，在C18柱上进行肽的纯化。
(2)制备活性肽二聚体在合成的活性肽序列中有一个半胱氨酸(Cys)，利用两条肽链中Cys上的-SH氧化形成二硫键-S-S-，从而得到活性肽的二聚体形式。
B.活性测定(1)四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测多肽支持TPO依赖株Ba/F3-mpl细胞生长的活性
先将需要测活的多肽样品用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基溶解后，进行系列稀释。取生长旺盛的对数期Ba/F3-mpl细胞，用不含TPO和血清的RPMI1640培养基洗涤2次，再用不含TPO的上述传代培养用培养基将细胞配成1.2×106细胞/ml的悬液。按每孔80μl的量将上述单细胞悬液加到96孔培养板中，然后每孔中加入20μl待测样品，每个稀释度3个平行，以无TPO、含10％胎牛血清的培养基为对照。96孔培养板置37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养48小时后，每孔加入10μL5mg/ml的MTT溶液(溶于PBS中)，继续置培养箱中。4小时后取出培养板，从每孔中吸出80μL上清液并弃去，然后加入100μL二甲亚砜，振荡均匀后以630nm处吸光值作对照，检测492nm处的吸光值。
(2)体内活性测定将多肽样品溶于2mg/ml人白蛋白/PBS中，进行系列稀释。根据体重将小鼠随机分组，以2mg/ml人白蛋白/PBS为对照组，每种肽浓度作为一组，各组小鼠数均为8只，雌雄各半。采用皮下注射方式，每日上午830～930给药一次，每次0.1ml/只，连续给药5天。分别在给药前、给药3、5、7、9天由尾静脉取血，检测外周血白细胞、红细胞、血小板计数、血红蛋白含量及平均血小板体积。将原始数据按组别输入Microsoft Excel中，各组结果以算术平均数(x)±标准差(s)表示，用Student t检验进行各用药组均数与对照组之间差异显著性检验。
权利要求
1.一种活性肽，其特征在于肽序列为IEGPTLRQWLAARAC。
2.一种如权利要求1所述的活性肽，其特征在于酰胺化肽链结构为IEGPTLRQWLAARAC-NH2。
3.一种如权利要求1所述的活性肽，其特征在于二聚体结构为
全文摘要
本发明公开了一种活性肽,特别涉及一种具有促进血小板生成功能的活性肽。解决了目前公知的活性肽中存在的活性偏低的不足。本发明采用多肽固相合成法设计合成了活性肽单体的序列为IEGPTLRQWLAARAC,酰胺化肽链结构为IEGPTLRQWLAARAC－NH
文档编号C07K14/49GK1254718SQ9812501
公开日2000年5月31日 申请日期1998年11月20日 优先权日1998年11月20日
发明者程度胜, 李朝, 黄培堂, 周艳荣, 陈添弥 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所