专利名称：促进休眠型TGF－β活化的肽以及调节TGF－β活性的化合物的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种新型肽，其能促进休眠型TGF-β(TGF-β普通分泌型)转化为活性型转化生长因子-β(以下简称为活性型TGF-β或者TGF-β)，活性型TGF-β具有抑制细胞增殖、促进细胞分化、免疫抑制、刺激成纤维细胞的趋化性等多种生理活性，此肽还可以作为与缺乏TGF-β活性相关的疾病以及认为施用外源TGF-β可有效治疗的疾病如癌、骨折、心肌梗塞、缺血再灌注后心肌紊乱、脑梗塞和视网膜脱落等疾病的治疗剂。
另外，本发明还涉及调节休眠型转化生长因子-β(此后缩写为LTGF-β)与细胞结合的化合物的筛选方法或者调节自休眠型TGF-β释放出活性型TGF-β的化合物的筛选方法，以及用于治疗或预防TGF-β相关疾病的根据上述方法筛选得到的化合物。
背景技术：
包括人在内的哺乳类中都存在诸如TGF-β1、β2和β3的TGF-β，且都分泌为无活性的LTGF-β[Robert，A.B.和Sporn，M.B.，肽生长因子和它们的受体(Peptide Growth Factors and Thir Receptors)，药学实验手册，第一部(Handbook of Experimental Pharmacology，Part 1)，SPRINGER-VERLAG，柏林，419～472页(1990)]，需要在分泌后被活化以呈现其活性。LTGF-β可被分为两种类型小分子量休眠型TGF-β(以下简称为SLTGF-β)，其中休眠相关肽(以下简称为LAP)以非共价键与TGF-β结合；以及大分子量休眠型TGF-β(以下简称LLTGF-β)，其中休眠型TGF-β结合蛋白质以下简称为LTBP)通过二硫键用LAP与SLTGF-β结合。LTGF-β主要以LLTGF-β形式分泌[EMBO Journal，10，1091(1991)]。TGF-β和LAP作为具有信号肽的相同蛋白质分子(TGF-β前体)被合成，其氨基酸序列已知[(Nature)，316，701(1985)]。
已发现参与休眠型TGF-β活化的一些相关蛋白酶，其中血纤蛋白溶酶研究最透彻。即血纤蛋白溶酶部分降解LAP释放出非共价键结合的TGF-β[细胞生物学杂志(Journal of cell Biology)，110，1361(1990)]。细胞水平上血纤蛋白溶酶对休眠型TGF-β的活化的分析表明通过血纤蛋白溶酶的活化在细胞膜表面进行[细胞生物学杂志，109309(1989)]，休眠型TGF-β与细胞膜结合对于活化是必需的[细胞生物学杂志121 439(1993)，出处同前，120，995(1993)，出处同前，123，1249(1993)]，且休眠型TGF-β通过LAP与细胞膜结合[细胞生物学杂志，123，1249(1993)，Tohoku实验药学杂志(Journal ofExperimental Medicine)，179，23(1996)]。但是，休眠型TGF-β与细胞膜结合的调控与TGF-β的活性调控的相互关系还不清楚。
已知休眠型TGF-β与血管平滑肌细胞结合而不与血管内皮细胞结合[细胞生物学杂志，123，1249(1993)]。
TGF-β具有抑制细胞增殖、促进细胞分化、抑制免疫机能、刺激成纤维细胞的趋化性等多种生理活性。TGF-β与多种疾病相关。例如，已报道TGF-β活性的缺乏与糖尿病性视网膜症[细胞生物学杂志，109，309(1989)，眼科学档案(Archieves of Ophthalmology)，66，366(1961)]、动脉粥样硬化的初期病变[天然药物(Nature Medicine)，1，1067(1995)]有关。另外，期望TGF-β本身对骨折、心肌梗塞、缺血后再灌注性心肌紊乱、脑梗塞、视网膜剥离等有治疗效果[细胞生物学杂志，119，1017(1992)]。此外，已知TGF-β对多种癌细胞的生长有抑制作用[内分泌学(Endocrinology)，128，1981(1991)，临床研究杂志(Jounal of Clinical Investigation)，87，277(1991)，细胞生长与分化(Cell Growth and Differentiation)，1，549(1990)]，期望可成为一种抗肿瘤药物[美国国家科学院院报(Proceedings of the National Aceademy of Science U.S.A)，92，4254(1995)]。
在体内产生、分泌的休眠型TGF-β中，仅有一部分被活化。相应地，通过增加体内休眠型TGF-β的活化效率可增强TGF-β的活性。所以，认为促进休眠型TGF-β活化的化合物是治疗与缺乏TGF-β活性相关的疾病以及认为施用外源性TGF-β可有效治疗的疾病如癌症、糖尿病性视网膜症、动脉粥样硬化、骨折、心肌梗塞、缺血后再灌注性心肌紊乱、脑梗塞、视网膜剥离等疾病的一种有效治疗剂。
另一方面，也已知由于TGF-β活性增加而引起细胞外基质变化所伴随的多种疾病。所以期望得到抑制TGF-β活性的物质用作对治疗例如肾小球肾炎、糖尿病性肾病、肾移植排斥反应、HIV肾炎、突发性肺纤维化症、自身免疫性肺纤维化症、肝硬化、静脉狭窄性肝障碍(常在治疗癌症后引发)、全身性硬化症、瘢痕瘤、嗜酸性粒细胞增加肌肉痛综合症、血管成形术后再狭窄、眼内纤维化症、风湿性关节炎、各种纤维化症如鼻息肉的治疗有效药物[Border W.A.和Noble N.A.，组织纤维化中的转化生长因子-β，(Transforming growth factor-β intissue fibrosis)，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)331，1286，(1994)以及Border W.A.和Rouslanti E.，疾病中的转化生长因子组织修复的暗面(Transforming growth factor-β in diseaseThe dark sideof tissue repair)，临床研究杂志(J.Clin Invest.)，90，1，(1992)]。
发明内容
本发明提供了具有促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β或具有促进休眠型TGF-β与细胞膜结合的活性的一种肽或其药学可接受的盐。在一个实施方案中，本发明提供了具有促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β或具有促进休眠型TGF-β与细胞膜结合的活性的一种肽，其由通式(I)表示R1-A-R2(I)(其中R1为H、取代或未取代的链烷酰基、取代或未取代的芳酰基、取代或未取代的杂芳基羰基、取代或未取代的烷氧羰基、或者取代或未取代的芳氧羰基、取代或未取代的杂芳氧羰基；R2为羟基、取代或未取代的烷氧基、或者取代或未取代的氨基；且A为选自TGF-β前体序列的部分序列的一种氨基酸序列，该序列可以缺失、取代或添加1～5个氨基酸残基；从选自包括序列内N末端及C末端氨基酸残基中的任意二个氨基酸残基之间、N端氨基或侧链的氨基与C端的羧基或侧链羧基之间可以形成用CO-NH表示的一种酰胺键，或用NH-CO表示的一种反酰胺键，或侧链的巯基可形成一种二硫键)，或其药学可接受的盐。
在另一实施方案中，本发明提供具有促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β或具有促进休眠型TGF-β与细胞膜的活性的一种肽或其一种药学可接受的盐，其由通式(I)表示，其中A是一种选自人TGF-β1前体序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的一种氨基酸序列的部分序列的氨基酸序列，以及当与人TGF-β1前体进行序列比较时除去人TGF-β1前体序列之外的TGF-β前体序列中相应于人TGF-β1前体序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的氨基酸序列，且在该部分序列中1-5个氨基酸残基可以被缺失、取代或添加。
在另一实施方案中，本发明提供具有促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β或具有促进休眠型TGF-β与细胞膜结合的活性的一种肽或其一种药学可接受的盐，其由通式(I)表示，其中A为SEQ IDNo.1～16中任一氨基酸序列，该序列中1～5个氨基酸残基可被缺失、取代或添加。
在另一实施方案中，本发明提供了一种筛选用于治疗或预防TGF-β相关疾病的的化合物的方法，其包括在向动物细胞添加休眠型TGF-β后测定与该细胞结合的休眠型TGF-β的量，向该细胞添加休眠型TGF-β与待评价的化合物后测定与该细胞结合的休眠型TGF-β的量，以及从由于添加该化合物引起的与动物细胞结合的休眠型TGF-β的量的改变来评价该化合物对休眠型TGF-β与动物细胞结合的抑制活性或促进活性。
在另一实施方案中，本发明提供了一种筛选用于治疗或预防TGF-β相关疾病的的化合物的方法，其包括在向动物细胞添加一种由通式(I)表示的肽或其药学可接受的盐后测定TGF-β的量，向动物细胞添加待评价的化合物及一种由通式(I)表示的肽或其药学可接受的盐后测定TGF-β的量，以及从由于添加该化合物引起的TGF-β的量的改变来评价该化合物对从休眠型TGF-β向TGF-β转化的抑制活性或促进活性。
在本发明的另一实施方案中，提供了根据本发明中上述二个方法中任一个方法筛选具有对休眠型TGF-β与细胞结合或对从休眠型TGF-β向TGF-β转化有抑制活性或促进活性的化合物，以及用于治疗或预防与TGF-β相关疾病的化合物或其药学可接受的盐。
以下，通式(I)中所表示的肽称为化合物(I)。
通式(I)中的基团定义如下，链烷酰基包括具有1～20个碳原子的链烷酰基，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、庚酰基、月桂酰基、二十烷酰基等。
芳酰基及芳氧羰基的芳基部分的例子为苯基和萘基。
杂芳基羰基及杂芳氧羰基的杂芳基部分的例子为呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基和喹唑啉基等。
烷氧羰基和烷氧基的烷基部分包括具有1～20个碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己烷基、庚烷基、癸烷基、十二烷基、二十烷基等。
取代的链烷酰基、取代的烷氧羰基及取代的烷氧基各自有1-3个相同或不同的取代基。取代基的例子有羟基、羧基、有3-8个碳原子的脂族环烷基(如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、取代或未取代的苯基和芴基等。取代的苯基有1～3个相同或不同的取代基。取代基的例子有烷基、烷氧基、羟基、硝基、磺基、氰基和卤素等。卤素包括氟、氯、溴、碘。作为取代的苯基的取代基的烷基和烷氧基的烷基部份与上述烷氧羰基及烷氧基的烷基部分具有相同含义。
取代的芳酰基、取代的芳氧羰基、取代的杂芳羰基及取代的杂芳氧羰基各自有1-3个相同或不同的取代基。取代基和上述取代的苯基的取代基相同。
取代的氨基有1-2个相同或不同的取代基。取代基的例子为取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基。烷基与前述烷氧基和烷氧羰基(包括其取代基)的烷基部分有相同含义。
对于TGF-β前体序列，可以采用源自任何动物的任何种类的TGF-β。合适的例子为人TGF-β1(J05114)[Nature，316，701(1985)](SEQ ID No.17)，人TGF-β2(Y00083)[EMBO.J.，6，3673(1987)](SEQ ID No.18)，人TGF-β3(J03241)[美国国家科学院院报，854715(1988)](SEQ ID No.19)，小鼠TGF-β1(M13177)[生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，261，4377(1986)](SEQ ID No.20)，小鼠TGF-β2(X57413)[分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)，3，1108(1989)](SEQ ID No.21)，小鼠TGF-β3(M32745)[分子内分泌学，3，1926(1989)](SEQ ID No.22)，大鼠TGF-β1(X52498)[核酸研究(Nucleic Acids Res.)，18，3059(1990)](SEQ ID No.23)，大鼠TGF-β3(U03491)[生物化学杂志，270，2722(1995)](SEQ IDNo.24)，牛TGF-β1(M36271)[分子内分泌学，1，693(1987)](SEQ IDNo.25)，猪TGF-β1(Y00111)[核酸研究，15，3187(1987)](SEQ IDNo.26)，猪TGF-β3(X14150)[EMBO J.，7，3737，(1988)](SEQ IDNo.27)，犬TGF-β1(L34956)[基因(Gene)，155，307(1995)](SEQID No.28)，绵羊TGF-β1(X76916)[基因，150，371(1994)](SEQ IDNo.29)，鸡TGF-β2(X58071)[分子内分泌学，7，175(1991)](SEQ IDNo.30)，鸡TGF-β3(M31154)[分子内分泌学，2，747(1988)](SEQ IDNo.31)，鸡TGF-β4(M31160)[分子内分泌学，6，989(1992)](SEQ IDNo.32)，猴(非洲绿猴)TGF-β(M16658)[DNA，6，239(1991)](SEQID No.33)，蛙(Xenopus laevis)TGF-β5(J05180)[生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，265，1089(1990)](SEQ ID No.34)等。TGF-β前体序列名称后面括弧内的数字所显示的是GenBank的保藏号。
对于A无特别限定，只要A是选自TGF-β前体序列的部分序列中的一种氨基酸序列，该序列中1～5个氨基酸残基可以被缺失、取代或添加。优选的A是选自人TGF-β1前体序列中的序数30～60的氨基酸序列、序数142～186的氨基酸序列及序数269～297的氨基酸序列部分序列的一种氨基酸序列以及除去人TGF-β1以外的TGF-β前体序列当与人TGF-β1进行序列比较时相应于人TGF-β1前体序列中序数30～60的氨基酸序列、序数142～186的氨基酸序列及序数269～297的氨基酸序列中的部分序列的一种氨基酸序列，而且在该氨基酸序列中，1～5个氨基酸残基可以被缺失、取代、添加。
特别优选的A是选自人TGF-β1前体序列中序数30～60的氨基酸序列、序数142～168的氨基酸序列及序数269～297的氨基酸序列中的部分序列以及除去人TGF-β1以外的TGF-β前体序列当与人TGF-β1序列进行序列比较时相应于人TGF-β1前体序列中序数30～60的氨基酸序列、序数142～186的氨基酸序列及序数269～297的氨基酸序列中的部分序列。
与人TGF-β1前体序列进行序列比较的上面所举例的动物来源的各种TGF-β前体如表1-1～表1-8所示。序列前后的数字表示氨基酸的位置号，氨基酸序列中的“-”表示空位的位置。
表1-1
表1-2
表1-3
>
表1-4
表1-5
表1-6
<p>表1-7
>
表1-8<
<p>相应于人TGF-β1前体中序数30～60、序数142～186、序数269～297的氨基酸序列部分(表1中人TGF-β1前体序列中下加线的氨基酸序列)为例如，人TGF-β2前体上分别为序数21～51、序数137～188、序数291～320的氨基酸序列，人TGF-β3前体上分别为序数24～54、序数139～190、序数288～318的氨基酸序列。这些序列比较使用Barton和Sternberg法进行[分子生物学杂志(Jonrnal ofMolecular Biology)，198，327(1987)]。
优选的化合物(I)是肽及其药学可接受的盐，其中A是选自SEQ IDNo.1～16的氨基酸序列，其序列中1～5氨基酸残基可以缺失、取代、添加。特别优选的A是选自SEQ ID No.1～16序列的氨基酸序列的肽。
“序列中1～5氨基酸残基可以被缺失、取代、添加”的表述此处指序列中可以包含的任意单一或多个所选位置上单一或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，这种缺失、取代或添加的总数为1-5，且缺失、取代和添加可以同时包含在序列中。取代和添加的氨基酸是否为天然型不限。
添加的例子为带有巯基(如半胱氨酸和同型半胱氨酸)或在序列两端有有机基团的氨基酸。取代的例子为序列中存在的半胱氨酸残基被取代为丝氨酸或丙氨酸残基以及丝氨酸或丙氨酸残基被取代为半胱氨酸残基。而且序列中所含二个巯基之间可形成二硫键以发生环化。N末端的氨基或侧链的氨基与C末端的羧基或侧链的羧基之间可以形成由CO-NH表示的一种酰胺键或由NH-CO表示的一种反酰胺键以发生环化。
天然氨基酸的例子，包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸和L-色氨酸。
休眠型TGF-β一词包括含有TGF-β和抑制其活性的LAP的小分子量休眠型TGF-β(SLTGF-β)以及含有TGF-β和抑制其活性的LAP和LTBP的大分子量休眠型TGF-β(LLTGF-β)。
由本发明的方法所筛选的化合物和化合物(I)的药学可接受的盐包括酸加成盐、金属盐、有机碱加成盐等。药学可接受的酸加成盐的例子包括如盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐等无机盐及如醋酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐。药学可接受的金属盐的例子为如钠盐和钾盐等碱性金属盐、如镁盐和钙盐等碱土类金属盐及铝盐、锌盐等。药学可接受的有机碱加成盐的例子包括与如甲胺、乙胺、苯胺等伯胺，与如二甲胺、二乙胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪等仲胺及与如三甲胺、三乙胺、N，N-二甲基苯胺、吡啶等叔胺所形成的盐和铵盐等。
下面对本说明书中所用的氨基酸和其保护基团相关的缩写进行说明。
氨基酸及其保护基团相关的缩写，遵从IUPAC-IUP联合委员会对生物化学命名的规定[欧洲生物化学杂志(European Journal ofBiochemistry)；138，9(1984)]。
除非另有说明，本说明书中使用下面的缩写表示氨基酸和其保护基团。
Gly或G甘氨酸Ala或AL-丙氨酸Thr或TL-苏氨酸Asp或DL-天冬氨酸Asn或NL-天冬酰胺AsxL-天冬氨酸或L-天冬酰胺Glu或EL-谷氨酸Gln或QL-谷氨酰胺GlxL-谷氨酸或L-谷氨酰胺Val或VL-缬氨酸Leu或LL-亮氨酸Ser或SL-丝氨酸Met或ML-蛋氨酸Ile或IL-异亮氨酸Phe或FL-苯丙氨酸Tyr或YL-酪氨酸Lys或KL-赖氨酸Ary或RL-精氨酸His或HL-组氨酸Pro或PL-脯氨酸Cys或CL-半胱氨酸Trp或WL-色氨酸Fmoc9-芴基甲氧羰基t-Bu叔丁基Trt三苯甲游基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基Boc叔丁氧羰基下列缩写表示对应的侧链保护的氨基酸。Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-L-天门冬氨酸β-叔丁酯Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-L-谷氨酸γ-叔丁酯Fmoc-Thr(t-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-o-叔丁基-L-苏氨酸Fmoc-Ser(t-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-o-叔丁基-L-丝氨酸Fmoc-Tyr(t-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-o-叔丁基-L-酪氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸Fmoc-Asn(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nγ-三苯甲游基-L-天冬酰胺Fmoc-Gln(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nδ-三苯甲游基-L-谷氨酸Fmoc-Arg(Pmc)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Ng-2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢呋喃-6-磺酰基-L-精氨酸Fmoc-His(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nim-三苯甲游基-L-谷氨酸Fmoc-Cys(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸Fmoc-Trp(Boc)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nind-叔丁氧羰基-L-色氨酸下面缩写对应反应溶剂和反应试剂等。PyBOP苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯HOBtN-羟基苯并三唑DCC二环己酰碳二亚胺NMMN-甲基吗啉DMFN，N-二甲基甲酰胺NMPN-甲基吡咯烷酮TFA三氟醋酸DTT二硫苏糖醇HBTu2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯DIPCN，N′-二异丙基碳二亚胺DIEAN，N-二异丙基乙胺DCM二氯甲烷化合物(I)的制造过程说明如下。
一般可采用液相或固相肽合成法[肽合成的基础与实验，NobuoIzumiya等，Maruzen(1985年)]或其适宜的组合方法合成化合物(I)。也可使用一种自动肽合成仪合成化合物(I)。即通过使用岛津公司生产的肽合成仪、Applied Biosystems公司(美国，ABI公司)所生产的肽合成仪、Advanced ChemTech公司(美国，ACT公司)所生产的肽合成仪等商业可得的肽合成仪，按各自的合成程序使用适当的侧链保护的Nα-9-芴基甲氧羰基氨基酸或Nα-叔丁氧羰基氨基酸进行合成。
作为化合物(I)合成起始材料的受保护的氨基酸及载体树脂，可购自ABI公司、岛津公司、国产化学(株)、Nova Biochem公司、渡边化学(株)、ACT和肽研究有限公司等。
在通过固相法、液相法或其组合或者在肽链延伸过程中结合了全部组分的氨基酸残基和有机基团后进行环化反应。后一种情况下，所得的环化产物再与氨基酸残基或有机基团缩合后以制备化合物(I)。环状结构可通过在反应的最后一步形成一种构成通式(T)中的环状结构的二硫键、酰胺键或反酰胺键，或者在上述键形成后在普通序列中作为构成环状结构组分的氨基酸残基与相邻的氨基酸残基之间形成一种酰胺键。下面描述环化过程。1.通过形成二硫键的环化首先，通过固相法、液相法或其组合制备在序列中两个位点上带有适当保护的巯基的氨基酸残基的一种肽。再将巯基保护基团以外的其它保护基团除去，随后除去巯基保护基团。再将所得前体肽进行氧化反应，通过普通有机化学反应中的纯化步骤纯化产物以得到期望的含有二硫键的环状结构的肽。1-1按照液相法通过形成二硫键的环化通过将上述前体肽在空气中进行氧化或在隋性溶剂中与一种氧化剂反应可制备带有二硫键的环状结构的肽。在肽浓度为0.5～5000μmol/l，优选在50～500μmol/l下进行反应。对于溶剂，缓冲液如50mM-1M三(羟甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)调整至pH4-9(优选地pH6-8)、5～50％酸水溶液、水以及如DMF、DMSO、乙腈、四氢呋喃、甲醇和乙醇等有机溶剂可单独或组合使用。氧化剂的例子为铁氰化钾和碘，使用与前体肽重量比分别为0.1～1倍的量和0.5～5倍量(优选是等量)。浓度为10～50％的DMSO也可用作氧化剂。反应通常在0～40℃进行1小时至一周。有时，通过加入谷胱甘肽可提高氧化产物的产率，且反应在与该前体肽重量比0.5～5倍量的氧化型谷胱甘肽和1/2氧化型谷胱甘肽量的还原型谷胱甘肽的存在下进行[美国化学会杂志(Journal of American Chemical Society)，103，5867(1981)；医药品的开发，第二集，第14卷，肽合成，239页，天岛治明监修，广川书店(1991)]。当用碘作为氧化剂时，在反应结束后加入锌粉末至反应混合液中碘的颜色消失，就这样或通过减压浓缩后采用各种层析法纯化混合物。当用铁氰化钾作氧化剂时，通过加入醋酸使反应混合物呈弱酸性，然后就这样或通过减压浓缩后采用各种层析法纯化。此外，可加入如Dowex 1×2(AcO-)(Dow化学公司)等阴离子交换树脂以通过吸附除去过剩的铁氰化钾(铁氰酸离子和亚铁氰酸离子)后混合物就这样或减压浓缩后采用各种层析法进行纯化。
另外，可以将一个巯基进行吡啶基亚磺酰化或2-硝基吡啶基亚磺酰化，再在选择性除去其它巯基的同时完成环化反应[国际肽及蛋白质研究杂志(International Journal of Peptide and Protein Research)，29，162(1987)]。环化反应所用的溶剂、反应温度及反应时间等与上述基本相同。另外，在二个巯基的保护基团除去后，加入等量用于吡啶基亚磺酰化或2-硝基吡啶基亚磺酰化试剂。吡啶基亚磺酰化反应中通过加入1-3倍等量的试剂如2，2′-的二硫代联吡啶到含有肽的溶剂中，随后搅拌。2-硝基吡啶基亚磺酰化也以相似方式进行。反应所用溶剂、反应温度及反应时间等均与前述基本相同[肽化学(PeptideChemistry)，1991，125(1992)]。l-2按照固相法通过形成二硫键的环化带有在序列中的二个位置有用适宜的保护基团保护的巯基氨基酸残基的肽，采用固相法延伸。在从树脂上切除肽之前，选择性除去巯基保护基团，将该肽进行氧化反应以制备带有环状结构的肽组分。在此之后再从树脂上切除肽并除去残留的保护基团，于是可得到所期望的带有环状结构的肽。
巯基保护基团的例子包括如乙酰胺基甲基(Acm)及三苯甲游基(Trt)。树脂上被保护的肽通过在如DMF或DCM等适当的溶剂中与碘反应除去Acm基团和Trt基团，形成分子内二硫键。对于50mg树脂，使用0.5～2ml溶剂与用树脂上肽的计算重量的重量比0.5～5倍量(优选为等量)的碘反应。反应通常在0～40℃进行1小时至1周。反应结束后，树脂经过固相法中通常的处理，即用少量如DMF或DCM等溶剂清洗，再经过后续反应。
如前1-1中所述一个巯基的吡啶基亚磺酰化或2-硝基吡啶基亚磺酰化可用固相法进行。环化反应所用溶剂、反应温度及反应时间等基本与前述相同。与前述液相法相似，二个巯基的保护基团除去后，加入等量吡啶基亚磺酰化试剂或2-硝基吡啶基亚磺酰化试剂。通过加入1-3当量的反应试剂(如2，2′-二硫代联吡啶)到用溶剂溶胀过的树脂，随后搅拌，进行吡啶基亚磺酰化反应。2-硝基吡啶基亚磺酰化也以相似方式进行。反应所用溶剂、反应温度及反应时间等与前述采用固相法环化反应基本相同。2、通过形成酰胺键或反酰胺键的环化通过固相法、液相法或其组合制备一种肽，该肽在序列中的两个位点上带有一种有合适的保护的氨基基团的氨基酸残基和一种有合适的保护的羧基基团的氨基酸残基，且其中的侧链、N-端和C-端均被保护。选择性除去氨基及羧基的保护基团之后，该肽经过分子间缩合反应后再经过有机化学反应普通纯化步骤以产生带有环状结构及侧链、N端及C端被保护的肽。再除去残留的保护基团，获得期望的肽。也可通过首先制备一种带有一环状结构的肽组分再将其延伸以制备所期望的肽。2-1按照液相法通过形成酰胺键和反酰胺键的环化通过液相法制备一种肽，该肽在序列中的两个位点上带有一种有合适的保护的氨基基团的氨基酸残基和一种有合适的保护的羧基基团的氨基酸残基。在从树脂上切除肽之前，选择性除去氨基和羧基的保护基团，将所得具有游离氨基和羧基的肽进行缩合反应以产生带有环状结构的肽组分。之后从树脂上切除该肽，除去残留的侧链保护基团，于是得到带有一环状结构的所期望的肽。
当使用4-甲基三苯甲游基作氨基保护基团时，该保护基团可通过使用醋酸/三氟乙醇/DCM(1/2/7)反应去除。反应通常在0～40℃进行0.5～6小时。反应结束后，加入乙醚等沉淀肽，(如需要在减压下)除去溶剂。必要时可使用有机化学反应中普通纯化步骤包括上述步骤。
当使用烯丙基氧羰基作为氨基保护基团且使用烯丙基酯基作为羧基保护基团时，在钯催化剂的存在下，通过与一种还原剂反应可以同时去除这些保护基团。也可仅用烯丙基酯基作为羧基保护基团。对于相同体系在反应中可使用任何0价的钯催化剂。合适的催化剂包括四(三苯膦)钯(0)及醋酸三苯磷钯(II)等。相对上述保护基团所用催化剂的量为0.0l～1当量，优选为0.1～0.5当量。以过量于上述保护基1倍的量加入添加剂，如甲酸、甲酸三乙铵、氢化三丁基锡、氢化三苯基锡、三甲基氢化硅烷、硼氢化钠、醋酸、醋酸-NMM等。对于溶剂，可单独或混合使用如乙醚、四氢呋喃、乙腈、DMF、氯仿等。对1mM烯丙氧羰基及烯丙基酯基中加入上述试剂和3～10ml溶剂。反应在-20～80℃(优选在0-30℃)进行10分钟至6小时。反应结束后，应用有机化学反应中的一般纯化步骤。
所得到的肽经过反应以形成游离氨基与游离羧基之间的分子间酰胺键。下面描述用于环化的典型的酰胺化反应。常见反应条件如下。对于溶剂，单独或混合使用如DMF、NMP、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃等。所用肽的浓度为0.5～5000μmol/l，优选为50～500μmol/l。反应通常在0～40℃、优选在4～25℃下带搅拌进行3小时至一周。反应完成后，应用有机化学反应程序中一般纯化方法。
用如相对于羧基1～10当量的二环己基碳二亚胺(DCC)或水溶性碳二亚胺(WSC)等碳二亚胺进行酰胺化反应。加入相对碳二亚胺1.5～2当量的NMM、DIEA或碳酸氢钠。必要时可加入相对碳二亚胺等摩尔量的HOBt或HONSu。
也可使用相对于羧基1～10当量的联苯磷酰基叠氮(DPPA)或氰基磷酸二乙酯(diethyl phosphorocyanidate，DEPC)进行酰胺化反应。加入相对于碳二亚胺的1.5-2当量的NMM、DIEA或碳酸氢钠。
此外，可使用相对于羧基1～10当量、优选为2～5当量的PyBOP或HBTU以及相对于PyBOP或HBTU的等摩尔的HOBt进行酰胺化反应。加入相当于PyBOP或HBTU的1.5～2当量的NMM、DIEA或碳酸氢钠。
也可以转化羧基成为一种活泼酯后，选择性去除氨基的保护基团，再形成酰胺键。活泼酯的例子为对硝基苯酯、五氟苯酯和N-氧琥珀酰亚胺酯等。形成活泼酯的方法有多种。例如加入相对羧基1～10当量的DCC与等摩尔量的对硝基苯酚、五氟苯酚或HONSu后，混合物在0～5℃下搅拌1小时～1天，过滤除去所生成的二环己基尿(Dcurea)。再用有机化学反应中一般纯化步骤纯化。形成活泼酯反应中所用溶剂、反应温度、反应时间等与上述酰胺化反应基本相同。2-2按照固相法形成酰胺键或反酰胺键的环化通过固相法制备一种肽，该肽在序列中的两个位点上带有一种有合适的保护的氨基基团的氨基酸残基或有机基团和一种有合适的保护的羧基基团的氨基酸残基或有机基团。在从树脂上切除肽之前，选择性除去氨基和羧基的保护基团，所得具有游离氨基和羧基的肽进行缩合反应以产生带有环状结构的肽组分。之后从树脂上切除该肽，除去残留的侧链保护基团，于是得到带有一环状结构的所期望的肽。
当使用4-甲基三苯甲游基作为氨基保护基团时，对于50mg树脂，该保护基可通过使用0.5-2ml醋酸/三氟乙醇/DCM(1/2/7)反应去除。反应通常在0～40℃进行0.5～6小时。反应结束后，用固相法用的常用方法处理，即用少量如DMF的溶剂清洗树脂，再用于后续反应。
当使用烯丙氧羰基作为氨基保护基团且使用烯丙基酯基作为羧基保护基团时，可使用如含0.1～0.2M的四(三苯膦)钯(O)、5％醋酸和2.5％NMM的氯仿等溶液进行反应以除去这些保护基团。对于1mM烯丙基氧羰基和烯丙基酯基加入上述氯仿溶液3～10ml。反应通常在0～40℃下进行0.5～6小时。反应结束后，用固相法通常的处理即用少量如DMF等溶剂清洗树脂，再用于后续反应。
对于50mg树脂，使用含有相对树脂上羧基计算量1～10当量(优选为2～5当量)的PyBOP或HBTU、以相对PyBOP或HBTU等摩尔的HOBt及以相对PyBOP或HBTU的1.5～2当量的NMM或DIEA的1ml DMF、DCM或NMP等有机溶剂进行后续反应。反应通常在0～40℃(优选在4～25℃)带搅拌进行3小时至一周。反应结束后，用固相法通常的处理即用少量如DMF等溶剂清洗树脂，再用于后续反应。
由上述方法所得的化合物(I)可用C-4、C-8及C-18等反相硅胶柱进行高效液相层析(HPLC)或使用分配树脂、吸附树脂、离子交换树脂、硅胶、化学修饰硅胶、反相硅胶、氧化铝、硅薄土或硅酸镁等通过如凝胶过滤的柱层析或薄层层析进行纯化。
化合物(I)的药学可接受的盐按普通方法得到。即通过在相应的酸或有机碱的水溶液中溶解化合物(I)后冷冻干燥得到化合物(I)的酸加成盐及有机碱加成盐。通过用含相应的金属离子水溶液将化合物(I)溶解后经凝胶过滤纯化或HPLC纯化后得到化合物(I)的金属盐。
下面，在表2中表示化合物(I)的具体例子。
表2
下面描述筛选治疗或者预防TGF-β相关疾病的化合物的方法，其包括把休眠型TGF-β加到动物细胞中后测定该细胞所结合的休眠型TGF-β的量，把休眠型TGF-β与待评价的化合物加入动物细胞后测定该细胞所结合的休眠型TGF-β的量，且根据由于添加该化合物引起结合于动物细胞的休眠型TGF-β的量的变化评价该化合物对休眠型TGF-β与细胞结合的抑制活性或者促进活性。
作为本发明的筛选对象，可以是合成化合物也可以是天然物质。例如天然或者合成的肽或者向天然蛋白质中加入酶分解得到的肽均可被评价。
休眠型TGF-β可以用例如Okata等的方法[生物化学杂志，106，304(1987)]从动物细胞中提取并纯化，或者用重组DNA技术[生物化学杂志，271，29891(1996)]所得。本发明所使用的动物细胞是可以被休眠型TGF-β结合的细胞。例如血小板，血管平滑肌细胞、毛细血管内皮细胞、颈动脉内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞等。细胞是从如人、牛、猪、大鼠等动物中分离纯化得到的，或者由上述细胞培养得到。细胞的分离纯化方法可以用例如Okada等方法[生物化学杂志，106，304(1989)]。休眠型TGF-β与细胞的结合可以如此进行，例如首先用培养基培养细胞，向其加入休眠型TGF-β，培养后清洗该细胞，测定结合于细胞的休眠型TGF-β。
优选地使用如氯胺T方法等由125I标记的休眠型TGF-β[分子与细胞生物学，(Molecular&Cellular Biology)，2，599(1992)]。通过测定放射活性可以测定与细胞结合的休眠型TGF-β的量。
另外，因为休眠型TGF-β与细胞结合之后被活化，所以要测定与细胞结合的休眠型TGF-β的量，可以通过测定活性型TGF-β量来进行。活性型TGF-β的定量可以用任何一种方法进行。例如可以直接用一种抗TGF-β抗体的酶免疫测定法[酶学方法(Methods inEnzymology)，198，303(1991)]，或者用安部等的[分析生物化学(Analytical Biochemistry)，216，276(1994)]荧光素酶鉴定，或者用血管内皮细胞的迁移度[细胞生物学杂志，123，1249(1993)]、血管平滑肌细胞的增殖[实验药物杂志(Tohoku Journal of ExperimentalMediaine)，179，23(1996)]、各种癌细胞的增殖抑制[临床研究杂志，277(1991)，内分泌学，128，1981(1991)]、水貂肺上皮细胞的增殖抑制[酶学方法，198，317(1991)]等方法测定。
比较加入和不加待评价活性的化合物时与细胞结合的休眠型TGF-β的量或者活性型TGF-β的量的差异，从而判断此化合作为预防或者治疗TGF-β相关疾病的药物的可行性。目的化合物的选择优选地通过例如筛选当添加浓度为1mM时比不加化合物时活性型TGF-β的量变化幅度在10％以上的化合物。
下面再描述一种筛选治疗或预防TGF-β相关疾病的化合物的方法向动物细胞加入用化合物(I)来表示的肽或其药学可接受的盐后测定TGF-β的量；向动物细胞中加入待评价化合物和用化合物(I)表示的肽或其药学可接受的盐后测定TGF-β的量；且根据由于加入该化合物引起TGF-β量的变化，评价该化合物对休眠型TGF-β向TGF-β转化的促进活性或抑制活性。
本发明选择的化合物，可以是合成物也可以是天然化合物。例如可以评价天然或合成的肽以及天然蛋白质加酶分解所得的肽。
适于本方法的细胞是自身可分泌TGF-β的细胞。优选这种细胞系，因为不用向实验体系中加入休眠型TGF-β即可选择期望的化合物。分泌休眠型TGF-β的细胞有血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞及其来自这些细胞的培养细胞。
可用任何方法测定活性型TGF-β的量，例如使用前述的方法。
如本发明筛选的化合物，不仅有上述的肽，还包括全部具有能促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β的活性或具有能促进休眠型TGF-β与细胞膜结合的活性的化合物。
由本发明的筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐，可用以治疗或预防多种疾病。这些疾病包括癌症、糖尿病性视网膜症、动脉粥样硬化、骨折、心肌梗塞、缺血再灌注后心肌紊乱、脑梗塞、视网膜剥离、肾小球肾炎、糖尿病性肾病、移植性肾排斥、HIV肾病、突发性肺纤维化症、自身免疫性肺纤维化症、肝硬化、静脉狭窄性肝障碍(治疗癌症后容易发生)、全身性硬化症、瘢痕疙瘩、嗜酸性粒细胞增多—肌肉痛综合症、血管成形术后再狭窄、眼内纤维化症、风湿性关节炎和鼻息肉等，并且，特别地优选用作各种抗纤维化症药剂、抗癌药剂及抗动脉硬化药剂。本化合物可以原样使用或制成各种给药剂型。例如，把由本发明筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐溶于生理盐水、葡萄糖、乳糖、甘露糖等的水溶液就可制成适于作为注射液的药物组合物。另外，例如可以把由本发明的筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐冷冻干燥，加入NaCl制成用于注射的粉末组合物。这些药物组合物可以根据需要含有制剂领域内众所周知的添加剂，例如药学可接受的盐。
另外，由本发明的筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐与适当的赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂等混合制成片剂、颗粒剂、粉剂、糖浆剂等可以用作经口给药的剂型。而且更进一步地，将由本发明的筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐与常用载体混合制成栓剂可以进行直接给药。
有效剂量随给药方法、由本发明筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐的种类、患者的年龄、症状等不同而不同。另外给药方法也可以随症状及给药量而改变。例如由本发明的筛选方法得到的化合物及化合物(I)或其药学可接受的盐一日可服0.00001～100mmg/kg，优选为0.01～10mg/kg。
图1是通过放射活性测定的猪血管平滑肌细胞(PSMC)内活性型TGF-β的结合度。“溶剂”行是添加不含试验化合物的溶液的放射活性，其他的行分别表示把各试验化合物以100μg/ml的浓度加入时的放射活性。
图2是通过放射活性测定的牛血管平滑肌细胞(BSMC)内活性型TGF-β的结合度。“溶剂”行是添加不含试验化合物的溶液的放射活性，“无细胞”行是向不存在细胞的培养皿上仅加入125I-LL TGF-β时的放射活性。其他的行分别表示把所示各试验化合物以100μg/ml的浓度加入时的放射活性。
图3是根据迁移入显微镜视野中的细胞数计数确定对活性型TGF-β在牛毛细血管内皮细胞(BCEC)上的迁移抑制度。“溶剂”行是添加不含试验化合物的溶液时的细胞数，其他的各行分别表示添加各试验化合物(浓度为50μg/ml)时视野中的细胞数。
图4是根据迁移入显微镜视野中的细胞数计数确定活性型TGF-β在牛毛细血管内皮细胞(BCEC)上的迁移抑制度。“溶剂”行是添加不含试验化合物的溶液时的细胞数，其它的各行分别表示添加各试验化合物(浓度为100μg/ml)时视野中的细胞数。
图5是根据迁移入显微镜视野中的细胞数计数确定活性型TGF-β对牛毛细血管内皮细胞(BCEC)上的迁移抑制度。“溶剂”行是添加不含试验化合物的溶液时的细胞数，其他的各行分别表示添加各试验化合物(浓度为所示)时视野中的细胞数。
图6是通过荧光酶鉴定系统测定活性型TGF-β量时的所测发光强度。“STD”行是恒定状态的发光强度，“溶剂”行是添加不含试验化合物的溶液的发光强度，其它的行分别表示添加各行内所示化合物(浓度为所示)时各自的发光强度。
图7是由图6表示的发光强度换算过来的活性型TGF-β的量。各行的意义与图6相同。
实施此发明的最佳模式以下的实施例中，化合物的理化性质由以下方法测定。质谱分析是用日本电子JEOL JMS-SX102A按TAB法进行。氨基酸分析以Bidlingmeyer B.A.等的方法[色谱杂志(Journal ofChromatograply)，336，93(1984)]进行。水解在盐酸蒸汽中110℃下进行22小时；所得水解物的氨基酸组成以Pico Tag氨基酸分析仪(Waters公司产品)进行分析。实施例1化合物1(SEQ ID No.1)(H-Leu-Gln-Ser-Ser-Arg-His-Arg-Arg-Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Phe-Ser-Ser-Thr-Glu-Lys-Asn-Cys-OH)的合成将结合了62.5μmmol的Fmoc-Cys(Trt)的载体树脂(Wang树脂，123mg)装入一种自动合成仪(ABI，430A型)按照ABI公司的合成程序以Fmoc法进行以下操作(a)向载体树脂加入20％哌啶-NMP溶液，搅拌混合物20分钟，排出该溶液。
(b)载体树脂用NMP清洗5分钟，排出该漂洗液。由此得到结合Cys(Trt)而无Fmoc基团的载体树脂。
(c)250μmol(相当于树脂上氨基酸的4当量)Fmoc-Asn(Trt)-OH与DCC、HOBt的NMP溶液搅拌50分钟的预先制备溶液，加于树脂，搅拌所得混合物60分钟，排出溶液。
(d)载体树脂用NMP洗3分钟。这样，就在载体树脂上合成Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)。
下面，进行(a)、(b)的脱保护和清洗步骤后在步骤(c)中使用Fmoc-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，接着经过(d)的清洗步骤，合成了加在载体树脂上的Fmoc-lys(Boc)-Asn(Trt)-Cys(Trt)。再重复步骤(a)-(d)以获得结合了被保护的肽的载体树脂。以下，重复过程中的步骤(c)中顺次使用Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH，Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-His(irt)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH等。更加进一步地，进行了(a)～(b)的脱保护、清洗步骤之后，把载体树脂用甲醇、丁醚按顺序清洗后，减压下干燥12小时，得到结合侧链保护的肽的载体树脂310.3mg。向得到的载体树脂中加入10ml TFA(82.5％)、苯硫基甲烷(5％)、水(5％)、甲基-乙基硫胺(3％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)以及苯硫酚(2％)组成的混合溶液，所得混合物在室温放置8小时以除去侧链保护基团，并从树脂上切除肽链。通过过滤分离树脂后，得到的滤液在减压下浓缩至2ml，加入约10ml乙醚。离心分离、干燥后回收生成的沉淀，获得145mg粗肽。将所得粗提物的一部分(70mg)溶于2M醋酸，再用反相柱(资生堂有限公司、CAPCELL PAKC18 30mmI.D.X25mm)以HPLC进行纯化。向1％TFA水溶液中加入含0.1％TFA的90％的乙腈水溶液，以1％线性梯度进行洗脱，在220nm检测以得到含化合物1的流分。把所得流分冷冻干燥得到25.5mg化合物1。质谱分析[FABMS]m/z＝270.1(M＋H+)氢基酸分析Asx 3.1(3)，Glx 2.1(2)，Ser 5.0(5)，His 1.0(1)，Arg 2.9(3)，Thr 2.0(2)，Ala 1.0(1)，Tyr 1.0(1)，Leu 1.9(2)，Phe 1.0(1)，Lys 1.1(1)，Cys 1.1(1)实施例2化合物2(SEQ ID No.2)(H-Pro-Val-leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Cys-OH)的合成用结合100μmol Fmoc-Cys(Trt)181.8mg的载体树脂(Wang树脂)作为起始物质，用如实施例1相同的方法，将Fmoc-Val-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH按顺序进行缩合。将缩合产物清洗干燥，得到568.4mg结合侧链保护的肽的载体树脂。用如实施例1相同的方法，切除肽的侧链保护基并将肽从树脂上切除，取得320mg粗肽。所得粗肽用反相柱(资生堂公司，CAPCELLPAKC18 30mmI.D.X250mm)以HPLC进行纯化，得到265.4mg化合物2。质谱分析[FABMS]m/z＝2870.4(M＋H+)氨基酸分析Glx 3.0(3)，Ser 1.1(1)，His 1.0(1)，Arg 3.8(4)，Ala 1.1(1)，Pro 0.9(1)，Val 2.6(3)，Leu 7.3(7)，Lys 2.1(2)，Cys 1.2(1)实施例3化合物3(SEQ ID No.3)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys-OH)的合成将结合33μmol Fmoc-Cys(Trt)的载体树脂(Wang树脂，60mg)加入岛津制作所制自动合成仪PSSM-8的反应器中，按合成步骤进行以下操作(a)载体树脂用500μl的DMF洗3分钟，排出该漂洗液。(b)向载体树脂加入30％哌啶-DMF溶液500μl，搅拌混合物4分钟，排出该漂洗液，重复此操作一次。(c)将载体树脂用500μl的DMF洗一分钟，排出该漂洗液，重复此操作5次。由此得到结合Cys(Trt)而不带有Fmoc的载体树脂。(d)含330μmol Fmoc-Gly-OH、330μmol PyBOP、330μl HOBt一水合物、及495μmol NMM的1155μl DMF搅拌3分钟。将得到的溶液加入载体树脂中，混合物搅拌30分钟，再排出溶液。(e)将载体树脂用500μl的DMF洗1分钟，重复此操作5次。由此，在载体树脂上合成了Fmoc-Gly-Cys(Trt)。
接着，进行(a)～(c)的清洗、脱保护步骤后，通过在步骤(d)中使用Fmoc-Arg(Pmc)-OH进行缩合反应，经过其后(e)的清洗步骤，在载体树脂上合成了Fmoc-Arg(Pmc)-Gly-Cys(Trt)。反复进行(a)～(e)，得到结合保护的肽的载体树脂。以下，通过重复步骤在步骤(d)中顺次使用Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OHb。随后，(a)～(c)的清洗、脱保护步骤进行之后，用500μl的DMF将载体树脂洗1分钟，反复进行此操作五次，用甲醇、丁醚顺次清洗载体树脂，减压下干燥12小时，得到结合侧链保护的肽的载体树脂。如实施例1一样切除侧链保护基团并将肽从树脂上切下，获得103.2mg粗肽。使用反相柱(YMC，YMC-Pack ODS-AM30mmI.D.X 250mm)以HPLC纯化所得的粗肽，得到25.4mg化合物3。质谱分析[FABMS]m/z＝2648.1(M＋H+)氨基酸分析Asx 1.1(1)，Glx 2.1(2)，Ser 1.9(2)Gly 1.1(1)，Arg 2.5(3)，Thr 1.8(2)，Ala 1.1(1)，Val 0.9(11)，Met 1.0(1)，Ile 3.0(3)，Leu 2.1(2)，Lys 3.1(3)，Cys 1.2(1)实施例4化合物4(SEQ ID No.4)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)的合成以结合33μmol Fmoc-Gly的60mg载体树脂(Wang树脂)为起始材料，以如实施例1相同的方法，依次用Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-BU)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr-(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合。清洗、干燥缩合产物得到结合侧链保护的肽的载体树脂。以如实施例1相同的方法，切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，获得115.3mg粗肽，使用反相柱(YMC、YMC-Pack ODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC纯化所得的粗肽，得63.3mg化合物4。质谱分析[FABMS]m/z＝2545.1(M＋H+)氨基酸分析Asx 1.1(1)，Glx 2.1(2)，Ser 1.9(2)，Gly 1.1(1)，Arg 2.6(3)，Thr 1.9(2)，Ala 1.1(1)，Val 0.9(1)，Met 0.9(1)，Ile 3.0(3)，Leu 2.1(2)，Lys 3.0(3)实施例5化合物5(SEQ ID No.5)(H-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)的合成用结合25μmol Fmoc-Gly的51.0mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，用ACT公司的肽合成仪ACT357进行以下操作(a)载体树脂以1ml DMF洗30秒，排出该漂洗液。(b)向载体树脂加入1ml 25％哌啶-DMF溶液，将混合物搅拌2分钟，排出该漂洗液，再向载体树脂加入1m125％哌啶-DMF溶液，将混合物搅拌10分钟，排出该漂洗液。(c)将载体树脂以DMF洗12秒钟，排出该漂洗液。重复此操作7次，由此得到结合Gly而不带Fmoc的载体树脂。(d)向载体中加入125μl DMF，500μl含有0.25M Fmoc-Arg(Pmc)-OH和0.25M HOBt一水合物的NMP溶液，500μl含浓度为0.25M的PyBOP的DMF溶液及125μl含2.0M NMM的DMF溶液。搅拌60分钟后，排出漂洗溶液。(e)将反应容器用500μl DMF清洗后，以1ml的DMF带搅拌洗30秒钟，再次用500μl的DMF清洗，由此在载体树脂上合成了Fmoc-Arg(Pmc)-Gly。
然后，进行(a)～(c)的清洗、脱保护步骤之后，在步骤(d)中用含Fmoc-Ile-OH的溶液取代Fmoc-Arg(Pmc)-OH进行缩合反应，然后经过清洗步骤(e)在载体树脂上合成Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Gly。以下，在步骤(d)中，顺次用Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH进行缩合。缩合产物经过清洗干燥，得到132.5mg结合侧链保护的肽的载体树脂(Wang树脂)。以如实施例1的方法，切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，获得58.3mg粗肽。将所得粗肽以如实施例1的方法，使用反相柱(YMC，YMC-Pack ODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC纯化，得到22.6mg化合物5。质谱分析[FAB MS]m/z＝2029.2(M＋H+)氨基酸分析Asx 1.0(1)，Glx 2.0(2)，Gly 1.0(1)，Arg 3.0(3)，Thr 1.0(1)，Ala 1.1(1)，Val 0.9(1)，Met 1.1(1)，Ile 2.9(3)，Leu 1.1(1)，Lys 2.0(2)实施例6化合物6(SEQ ID No.6)(H-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)的合成将结合25.0μmol Fmoc-Gly的51.0mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，用如实施例5的方法，依次用Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合，缩合产物经过清洗、干燥得到结合侧链保护的肽的载体树脂112.2mg。用如实施例1的方法，切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，得到48.7mg粗肽。所得的粗肽再用1ml的TFA溶解，将其滴入50ml乙醚中，通过过滤分离生成的沉淀并干燥，得到35.5mg化合物6。质谱分析[FAB MS]m/z＝1439.0(M＋H+)氨基酸分析Glx 1.1(1)，Gly 1.0(1)，Arg 3.0(3)，Ala 1.1(1)，Val 0.8(1)，Ile 1.9(2)，Leu 1.0(1)，Lys 2.0(2)实施例7化合物7(SEQ ID No.7)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-OH)的合成以结合25.0μmol Fmoc-Ile的56.8mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例5的方法依次用Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合。缩合产物经过清洗、干燥后得到结合侧链保护的肽的载体树脂280.9mg。以如实施例1的方法切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，获得粗肽123.1mg。将所得粗肽使用反相柱(YMC，YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到26.7mg化合物7。质谱分析[FAB MS]m/z＝20/9.2(M＋H+)氨基酸分析Asx 1.1(1)，Glx 1.1(1)，Ser 1.7(2)，Arg 2.2(2)，Thr 1.7(2)，Val1.0(1)，Met 1.0(1)，Ile 2.1(2)，Leu 2.1(2)，Lys 3.1(3)实施例8化合物8(SEQ ID No.8)(H-Lea-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Len-Val-Lys-Arg-OH)的合成将结合25.0μmol Fmoc-Arg(Pmc)的48.1mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例5的方法依次用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmnoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合，缩合产物经过清洗干燥得到结合侧链保护的肽的载体树脂79.3mg。以如实施例1的方法切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，得到粗肽18.3mg。将所得粗肽，以如实施例1的方法使用反相柱(YMC、YMC-Pack ODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到4.7mg化合物8。质谱分析[FAB MS]m/z＝1621.0(N＋H+)氨基酸分析Asx 1.0(1)，Glx 1.1(1)，Ser 1.8(2)，Arg 1.1(1)，Thr 1.9(2)，Val 0.9(1)，Met 1.0(1)，Ile 1.0(1)，Leu 2.1(2)，Lys 2.0(2)实施例9化合物9(SEQ ID No.9)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-OH)的合成将结合125.0μmol Fmoc-Val的48.1mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例5的方法，依次用Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合，缩合产物经清洗干燥，得到结合侧链保护的肽的载体树脂120.3mg。以如实施例1的方法，切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下来，得到粗肽49.0mg。但是，此次切开所用的混合液是90％的TFA、5％1，2-乙二硫醇、5％苯硫基甲烷，加入后放置时间为2小时。然后以如实施例1的方式，使用反相柱(YMC，YMC-PackODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到20.2mg化合物9。质谱分析[FAB MS]m/z＝1336.7(M＋H+)氨基酸分析Asx(1)，Glx 1.1(1)Ser 1.8(2)，Thr(2)Val1.0(1)Met1.0(1)，Ile 1.0(1)，Leu 2.1(2)，Lys 1.0(1)实施例10化合物10(SEQ ID No.10)[H-环(Cys-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys)-OH]的合成将结合16.5μmol Fmoc-Cys(Trt)的30mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例3的方法依次用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(PmC)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH进行缩合。缩合产物经清洗干燥，得到结合侧链保护的肽的载体树脂。每个氨基酸缩合反应的时间为60分钟。以如实施例1的方法，切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，得到粗肽54.5mg。所得粗肽以如实施例1的方法，使用反相柱(资生堂有限公司，CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X250mm)以HPLC进行纯化，得到14.0mg未环化形式的化合物10。质谱分析[FAB MS]m/z＝2751.7(M＋H+)将所得化合物溶于10ml的DMSO，加氨水调溶液pH为7.1，在室温搅拌29小时。将所得溶液冷冻干燥后，再次溶于2M醋酸水溶液，冷冻干燥，得到13.5mg化合物10。质谱分析(FAB MS]m/z＝2749.5(M＋H+)氨基酸分析Asx 1.2(1)，Glx 2.2(2)，Ser 2.0(2)，Gly 1.1(1)，Arg 3.0(3)，Thr 2.0(2)，Ala 1.1(1)，Val 1.0(1)，Met 1.1(1)，Ile 3.1(3)，Leu 2.2(2)，Lys 3.1(3)，Cys 1.8(2)实施例11化合物11(SEQ ID No.11)[H-Leu-Ser-Thr-环(Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys)-OH]的合成将结合16.5μmol Fmoc-Cys(Trt)的30mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例3的方法依次用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合。缩合产物经过清洗、干燥，得到结合侧链保护的肽的载体树脂。每个氨基酸缩合反应的时间是60分钟。以如实施例1的方法切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，获得粗肽55.2mg。将所得粗肽以如实施例1的方法，使用反相柱(资生堂制，CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到9.7mg未环化形式的化合物11。质谱分析[FABMS]m/z＝2664.5(M＋H+)将所得化合物溶于10ml的DMSO，加氨水调节溶液pH为7.3，在室温下搅拌20小时。将所得溶液冷冻干燥后再次溶于2M醋酸水溶液，进行冷冻干燥，得到9.7mg化合物11。质谱分析[FAB MS]m/z＝2662.5(M＋H+)氨基酸分析Asx 0.9(1)，Glx 2.0(2)，Ser 0.9(1)，Gly 1.1(1)，Arg 3.0(3)，Thr 1.9(2)，Ala 1.1(1)，Val 0.9(1)，Met 1.0(1)，Ile 3.2(3)，Leu 2.1(2)，Lys 2.9(3)，Cys 1.5(2)实施例12化合物12(SEQ ID No.12)[H-环(Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys)-OH]的合成以结合140μmol H-Cys(Trt)的250mg载体树脂(Cl-Trt树脂)作为起始材料，使用ACT公司的肽合成仪ACT357进行以下操作。(a)将载体树脂用2.5ml DMF洗3分钟，排出该漂洗液。重复此操作两次。(b)向载体树脂加入250μl DMF、含0.5M Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.5M HO-Bt一水合物的1.4ml NMP溶液及含0.5M DIPC的1.4mlNMP溶液。搅拌40分钟，排出溶液。(c)载体树脂用2.5ml DMF洗1分钟，排出该漂洗液，重复此操作2次。(d)向载体树脂加入250μl DMF、含0.5M Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.5M HOBt一水合物的1.4ml NMP溶液、含0.5M HBTU的1.4ml DMF溶液及含2.0M DIEA的0.7ml NMP溶液。搅拌20分钟，排出该漂洗液。(e)进行如(c)的处理。由此在载体树脂上合成Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)。(f)向载体树脂加入含25％哌啶的2.5ml DMF溶液，搅拌所得混合物2分钟，排出该溶液。再次加入相同溶液搅拌混合物10分钟，排出该溶液。(g)以2.5ml DMF洗载体树脂1分钟，排出该漂洗液，重复此操作7次。由此，得到结合Lys(Boc)-Cys(Trt)而不带Fmoc的载体树脂。
然后，通过在(a)～(e)步骤中，使用含以Fmoc-Leu-OH替代Fmoc-Lys(Boc)-OH的溶液进行缩合反应，经过(f)和(g)的脱保护、清洗步骤，在载体树脂上合成Leu-Lys(Boc)-Cys(Trt)。以下，重复步骤(a)～(e)依次使用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH。缩合产物经过清洗、干燥，得到结合侧链保护的肽的载体树脂。用得到的树脂的4/5量，以如实施例1的方法切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，获得粗肽137.2mg。所得的粗肽与100mg DTT溶于2ml的DMF，在50℃放置1小时后。所得溶液用如实施例1的方法，使用反相柱(资生堂CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到12.2mg带有2个游离SH基的肽。
质谱分析(FABMS)m/z＝2284.3(M＋H+)将所得的肽溶于5ml的2M醋酸水溶液，所得溶液用水稀释至50ml后，加入稀氨水调溶液pH为5.7。向所得混合物加入0.1M K3Fe(CN)6水溶液0.5ml，在室温搅拌2.5小时。向反应溶液中加入1ml醋酸后，以如实施例1的方法使用反相柱(资生堂CAPCELL PAK C18 30mmI.D.X250mm)以HPLC进行纯化，得到7.3mg化合物12。
质谱分析(FABMS)m/z＝2282.5(M＋H+)氨基酸分析Glx 1.0(1)，Ser 1.0(1)，Arg 3.9(4)，Ala 1.1(1)，Val0.7(1)，Leu 7.2(7)，Lys 2.1(2)，Cys 2.7(2)实施例13化合物13(SEQ ID No.13)[生物素酰-环-(Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys)-OH]的合成用1ml的DMF洗涤由实施例12得到的1/5量的带有侧链保护的肽的载体树脂，洗后加入含68.4mg D-生物素(Nakalai Tesqne公司)的440μl DMF悬浊液及含0.5M DIPC的NMP溶液，室温下搅拌2天。排出溶液后，载体树脂经清洗干燥，得到结合侧链保护的肽的树脂，该肽的N-末端被生物素酰化。以如实施例1的方法，切断侧链保护基团并将肽从树脂上切下，取得粗肽47.3mg。所得粗肽同50mg DDT一起溶于1ml DMF，溶液在50℃放置1小时后，所得溶液以如实施例1的方法使用反相柱(资生堂CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到11.8mg带有2个游离SH基的肽。质谱分析(FABMS)m/z＝2510.8(M＋H+)将所得肽溶于5ml 2M的醋酸水溶液。所得溶液用水稀释至50ml后，加稀氨水调节溶液至pH5.5。向所得混合物中加入0.1M的K3Fe(CN)6水溶液0.5ml，室温下搅拌3小时。向反应溶液中加入1ml醋酸后以如实施例1的方法使用反相柱(资生堂CAPCELL PAK C1830mm I.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到3.8mg化合物13。质谱分析(FABMS)m/z＝2508.8(M＋H+)氨基酸分析Glx 1.1(1)，Ser 1.0(1)，Arg 3.8(4)，Ala 1.1(1)，Val 0.8(1)，Leu 6.8(7)，Lys 2.0(2)，Cys 2.1(2)实施例14化合物14(SEQ ID No.14)[H-Leu-Ser-Thr-Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Gln-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-OH]的合成将结合23μmol Fmoc-Arg(Pmc)的50mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例3的方法依次用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合。缩合产物经清洗、干燥，得到结合侧链保护的肽的载体树脂。每个氨基酸缩合的反应时间是60分钟。以如实施例1的方法切断侧链保护基团并将肽从树脂切下，得到59.8mg粗肽。将所得粗肽以如实施例1的方法使用反相柱(资生堂CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 150mm)以HPLC进行纯化，得7.7mg化合物14。
质谱分析(FABMS)m/z＝1921.7(M＋H+)氨基酸分析Asx 1.0(1)，Glx 1.1(1)，Ser 0.9(1)，Arg 2.2(2)，Thr1.6(2)，Val 0.9(1)，Met 1.1(1)，Ile 1.0(1)，Leu 2.1(2)，Lys 3.1(3)，Cys1.3(1)实施例15化合物15(SEQ ID No.15)[H-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH]的合成将结合23μmol Fmoc-Arg(Pmc)的50mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料以如实施例3的方法依次用Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH进行缩合，缩合产物经过清洗干燥，得到结合侧链保护的肽的载体树脂。每个氨基酸缩合的反应时间是60分钟。以如实施例1的方法将侧链保护基切除并将肽从树脂切下，除了如实施例1的混合液额外加入5mg/ml的2-甲基吲哚。另外放置时间为6小时，由此获得粗肽20.9mg。将所得粗肽使用反相柱(资生堂CAPCELL PAK C18 30mmI.D.X 250mm)以HPLC进行纯化，得到7.8mg化合物15。质谱分析(FABMS)m/z＝2663.5(M＋H+)氨基酸分析Asx 2.0(2)，Glx 3.9(4)，Ser 2.0(2)，His 1.1(1)，Arg 1.1(1)，Tyr 2.2(2)，Val 1.8(2)，Leu 3.0(3)，Lys 3.0(3)实施例16化合物16(SEQ ID No.16)[生物素-Gly-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH]的合成将结合13.8μmol Fmoc-Arg(Pmc)的30mg载体树脂(Wang树脂)作为起始材料，以如实施例3的方式依次用Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Gly-OH进行缩合。预先制备的由61.9mg D-生物素、562μl含0.5M HBTU和0.5M HOBt一水合物的DMF溶液、562μl含1MDIEA的DMF组成的溶液，在室温下搅拌5分钟后将该溶液加入缩合产物，所得混合物搅拌4小时。排出溶液后产物经过清洗、干燥，得到结合N-末端被生物素酰化的侧链保护的肽的载体树脂。在氨基酸的缩合反应步骤(d)中，以HBTU代替PyBOP，以DIEA代替NMM。以如实施例1的方法切断侧链保护基并从树脂上切除肽除使用的混合液中与实施例1相比额外加入了5mg/ml的2-甲基吲哚，且放置时间为6小时，由此得到粗肽44.2mg。将其使用反相柱(资生堂CAPCELL PAKC18 30mm I.D.X 250mm)用HPLC进行纯化，得到10.3mg化合物16。质谱分析(FABMS)m/z＝3260.0(M＋H+)氨基酸分析Asx 2.1(2)，Glx 4.1(4)，Ser 2.0(2)，Gly 1.0(1)，His 1.0(1)，Arg 2.8(3)，Tyr 2.1(2)，Val 1.9(2)，Leu 3.0(3)，Lys 2.9(3)实施例17将化合物10转化为醋酸盐如实施例10方法得到的22.1mg化合物10，将其溶于5ml％醋酸水溶液，通过一种阴离子交换柱(旭化成化学工业有限公司，AsahiPack ES-502N 21.5mm I.D.X 100mm)除去TFA，将化合物转化为醋酸盐。用1％醋酸水溶液洗脱肽，在220nm处检出。洗脱液冷冻干燥，得到20.0mg化合物10的醋酸盐。实施例18将化合物12转化为醋酸盐如实施例12方法得到的12.5mg化合物12溶于5ml 1％醋酸溶液，将溶液通过阴离子交换柱(旭化成化学工业有限公司，Asahi Pack ES-502N 21.5mm I.D.X 100mm)除去TFA，将化合物转化为醋酸盐。用1％醋酸水溶液洗脱肽，在220nm处检出。将洗脱液冷冻干燥，得到13.0mg化合物12的醋酸盐。关于化合物(I)的生物活性及筛选方法描述于下面的实施例。实施例19通过测定TGF-β对牛血管平滑肌细胞、猪血管平滑肌细胞、牛毛细血管内皮细胞及牛颈动脉内皮细胞的结合度测定从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β的活性(1-1)125I-标记LLTGF-β使用Okada等的方法[生物化学杂志，106，304(1989)]，从人血小板分离纯化的LLTGF-β通过氯胺T方法进行125I标记[分子与细胞生物学，2，599(1982)]。具体操作如下
向2μg的LLTGF-β中加入25μl 1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)，37MBq Na-125I(DuPont NEW)和10μl氯胺T(0.05M磷酸钾缓冲液中含0.5mg/100μl，光纯化学工业有限公司)，室温下搅拌40秒。加入15μl Na2S2O3(0.05M磷酸钾缓冲液中含1mg/100μl)，混合物室温下搅拌5秒钟后，添加100μl酪氨酸水溶液(1mg/ml)。反应混合液通过Sephadex G25柱，每500μl洗脱液作为一个流分，用γ-计数器(ARC-2000，Alok有限公司)检测其放射活性。选择含有标记蛋白的流分以供实验之用。(1-2)细胞的准备实验所用细胞用如Sato等的方法[细胞生物学杂志，123，1249(1993)]获得。牛血管平滑肌细胞(BSMC)和猪血管平滑肌细胞(PSMC)分别从牛大动脉和猪大动脉分离且通过外植体法[细胞生物学杂志，55，172(1971)]培养。牛毛细血管内皮细胞(BCEC)是从牛肾上腺毛细血管分离并培养的。牛颈动脉内皮细胞(BAEC)是从牛颈动脉分离、培养得到的。(1-3)TGF-β结合度的测定按照Sato等的方法[细胞生物学杂志，123，1249(1993)]进行以下操作。
如上述方法分离培养的BSMC、PSMC和BCEC分别以4×104细胞/培养皿的量培养于35mm培养皿中。第二天将培养基换为含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培养基(Dulbecco′s改良Eagle′s培养基，DMEM，Nissui制药公司)，孵育5小时。用2ml含0.1g/LMgCl2·6H2O和0.1g/L CaCl2的磷酸盐缓冲盐水(以下以PBS(+)表示；不含MgCl2·6H2O或CaCl2的磷酸盐缓冲盐水记为PBS(-))将细胞清洗后，将培养基换为含0.1％BSA、2ng/ml125I-LLTGF-β及试验化合物的1ml冰冷的DMEM，在4℃孵育3小时。将试验化合物以二甲基亚砜(DMSO)溶液的形式加入，使体系中DMSO的最终浓度为0.1％。用2ml冰冷的PBS(+)洗细胞3次后，以900μl 0.5％TritonX-100裂解细胞(室温，0.5～1小时)。取800μl裂解液，用γ-计数器测定其放射活性。
结果以图1、2及表3、表6显示。表3
表3显示根据放射活性测定的活性型TGF-β对牛毛细血管内皮细胞(BCEC)的结合度。“溶剂”行是指添加不含试验化合物的溶液的放射活性，“无细胞”行指向不存在细胞的培养板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性，其他各行分别表示将各行所示化合物以30μg/ml的浓度加入时的放射活性。表4
表4显示根据放射活性测定的活性型TGF-β对牛毛细血管内皮细胞(BCEC)的结合度。“溶剂”行是指添加不含试验化合物的溶液的放射活性，“无细胞”行是向不存在细胞的培养板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性，其他各行分别表示各行所示化合物以100μg/ml的浓度加入时的放射活性。表5
表5显示根据放射活性测定的活性型TGF-β对牛颈动脉内皮细胞(BAEC)的结合度。“溶剂行”是添加不含试验化合物的溶液的放射活性。“无细胞”行是向不存在细胞的培养板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性，其他的行分别表示各行所示化合物以100μg/ml的浓度加入时的放射活性。表6
表6显示根据放射活性测定的活性型TGF-β对牛颈动脉内皮细胞(BAEC)的结合度。“溶剂”行是加入不含试验化合物的溶液的放射活性。“无细胞”行是向不存在细胞的培养板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性，其他的行分别表示各行所示化合物以100μg/ml的浓度加入时的放射活性。
如图1、2及表3～表6所示，100μg/ml浓度的化合物1～3、5～9及13～16和30μg/ml浓度的化合物12可增加TGF-β对细胞的结合度，促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β。
用本发明方法可以筛选促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β并使TGF-β对细胞结合度增大的化合物。实施例20通过测定牛血管内皮细胞的迁移度确定从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β的活性。
按Sato等的方法[细胞生物学杂志，123，1249(1993)]，进行以下操作。将BCEC培养于35mm培养皿中至细胞生长铺满，将培养基换为含0.1％BSA的DMEM，孵育5小时。用刮刀刮下一部分细胞，剩余细胞用PBS(-)清洗后用含试验化合物和0.1％BSA的DMEM孵育。24小时后，在显微镜(IX70，Olympus)下在4个视野中对各板上迁移细胞进行计数。试验化合物以如实施例1的方式添加。结果如图3～5所示。化合物3、5～9在50μg/ml的浓度下抑制细胞迁移，且促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β，化合物4在100μg/ml的浓度抑制细胞迁移，化合物10即使在10μg/ml的浓度下也可抑制细胞迁移。
用本发明方法可以筛选促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β、增大TGF-β对细胞的结合度的化合物。实施例21通过荧光酶分析测定活性型TGF-β的量依Abe等的方法[分析生物化学(Analytial Biochemitry)，216，276(1994)]，以荧光酶分析系统(Promega)测定带有在PAI-1启动子下游导入荧光酶基因的水貂肺上皮细胞(MLEC)的发光确定活性型TGF-β的量。具体操作如下将BCEC培养于24孔培养板使之生长至铺满，将培养基换为含0.1％BSA的DMEM。6小时后，用梳子将细胞成网状刮下，剩余的细胞用PBS(-)清洗后，用含0.1％BSA和试验化合物的DMEM孵育24小时。取所得培养上清液作为样品。取此培养上清液6小时之前向96孔培养板中以每孔2.8×104个细胞的量加入上述MLEC。用含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养细胞6小时后，用上述培养上清液样品取代培养基，培养16小时。用PBS(-)洗涤细胞2次后，用荧光酶分析系统测定活性型TGF-β浓度。结果如图6所示。通过加入化合物3以及10释放活性型TGF-β。特别是，化合物10即使在浓度为10μg/ml时也有明显效果。
根据本发明的方法可以筛选促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β以及增加TGF-β细胞的结合度。
工业实用性本发明提供了具有通过增加休眠型TGF-β与细胞的结合促进休眠型TGF-β活性化的活性的新肽或者其药学可接受的盐。
另外，根据本发明的化合物的筛选方法，可以筛选具有促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β的活性，或者具有促进休眠型TGF-β与细胞膜结合的活性的化合物。
根据本发明的筛选方法得到的化合物或者化合物(I)或者药学可接受的上述化合物的盐，具有抑制或者促进休眠型TGF-β与细胞结合的活性，或者抑制或者促进休眠型TGF-β向TGF-β转化的活性。这些化合物可用作预防或者治疗以下疾病的药物癌症、糖尿病性视网膜症、动脉粥样硬化、骨折、心肌梗塞、缺血再灌注后心肌紊乱、脑梗塞、视网膜脱离、肾小球肾炎、糖尿病性肾症、肾移植排斥、HIV肾症、突发性肺纤维化症、自身免疫性肺纤维化症、肝硬化、静脉狭窄性肝障碍(癌症治疗以后多发)、全身性硬化症、瘢痕疙瘩、嗜酸性粒细胞增多—肌肉痛综合症、血管成形术后再狭窄、眼内纤维化症、风湿性关节炎、鼻息肉等。
序列表(1)一般信息(i)申请人协和发酵工业株式会社(ii)发明名称促进休眠型TGF-β活化的肽以及调节TGF-β活性的化合物的筛选方法整理序号1060申请日1998年5月12日优先权号平成9年专利申请号第120683号优先权日平成9年5月12日(iii)序列数目34(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO1的序列描述Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Ser Phe1 5 10 15Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度24(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO2的序列描述Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Val Glu Gln His Val Cys2025(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO3的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile Glu Ala Ile Arg Gly Cys20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO4的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile Glu Ala Ile Arg Gly20(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度17(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO5的序列描述Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度12(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO6的序列描述Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly1 5 10(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度17(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO7的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度14
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO8的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg1 5 1015(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度12(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO9的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val1 5 10(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度24(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词二硫键
(B)位置1与24(xi)SEQ ID NO10的序列描述Cys Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys1 5 10 15Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Cys20 25(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词二硫键(B)位置4与23(xi)SEQ ID NO11的序列描述Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile Glu Ala Ila Arg Gly Cys20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度19(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词二硫键(B)位置1与19(xi)SEQ ID NO12的序列描述Cys Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Cys20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度19(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词二硫键(B)位置1与19(A)名称/关键词修饰过的位点(B)位置1(C)其它信息Xaa表示Nα-生物素酰-L-Cys(xi)SEQ ID NO13的序列描述Xaa Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Cys20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度16(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO14的序列描述Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度21(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO15的序列描述Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser1 5 10 15Asn Asn Sar Trp Arg20(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征
(A)长度24(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词修饰过的位点(B)位置1(C)其它信息Xaa表示Nα-生物素酰-Gly(xi)SEQ ID NO16的序列描述Xaa Arg Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln1 5 10 15Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg20 25(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度391(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ ID NO17的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
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权利要求
1.具有促进从休眠型TGF-β中释放活性型TGF-β或具有促进休眠型TGF-β与细胞膜结合的活性的一种肽或其药学可接受的盐。
2.如权利要求1的一种肽或者其药学可接受的盐，其中该肽由通式(I)表示R1-A-R2(I)(其中R1为H、取代或未取代的链烷酰基、取代或未取代的芳酰基、取代或未取代的杂芳羰基、取代或未取代的烷氧羰基、或者取代或未取代的芳氧羰基、取代或未取代的杂芳氧羰基；R2为羟基、取代或未取代的烷氧基、或者取代或未取代的氨基；且A为选自TGF-β前体序列的部分序列的一种氨基酸序列，其中该序列中1-5个氨基酸可以被缺失、取代或添加；且选自序列内包括N末端及C末端氨基酸残基中的任意二个氨基酸残基之间、N端氨基或侧链氨基与C端羧基或侧链羧基之间可以形成一种用CO-NH表示的酰胺键，或一种由NH-CO表示的反酰胺键，或侧链的巯基可形成一种二硫键)。
3.如权利要求2的一种肽或其药学可接受的盐，其中A是一种选自人TGF-β1前体序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的一种氨基酸序列的部分序列的氨基酸序列，以及当与人TGF-β1前体序列进行序列比较时除去人TGF-β1序列之外的TGF-β前体序列中相应于人TGF-β1前体序列的氨基酸序列30-60、142-186及269-297的氨基酸序列，且在该部分序列中1-5个氨基酸可以被缺失、取代或添加。
4.如权利要求2的一种肽或其药学可接受的盐，其中A是一种选自人TGF-β1前体序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的一种氨基酸序列的部分序列的氨基酸序列，以及当与人TGF-β1序列进行比较时除去人TGF-β1序列之外的TGF-β前体序列中相应于人TGF-β1前体序列的氨基酸序列30-60、142-186及269-297的氨基酸序列。
5.如权利要求2的一种肽或其药学可接受的盐，其中A为选自SEQ ID No.1～16中的一种氨基酸序列，该序列的1～5个氨基酸残基可以被缺失、取代或添加。
6.如权利要求2的一种肽或其药学可接受的盐，其中A为选自SEQ ID No.1～16中的一种氨基酸序列。
7.筛选用于治疗或预防TGF-β相关疾病的化合物的一种方法，其包括向动物细胞添加休眠型TGF-β后测定与该细胞结合的休眠型TGF-β的量；向该细胞添加休眠型TGF-β和待评价的化合物后测定与该细胞结合的休眠型TGF-β的量；以及从由于添加该化合物引起的与动物细胞结合的休眠型TGF-β的量的改变来评价该化合物对休眠型TGF-β与细胞接合的抑制活性或促进活性。
8.如权利要求7的一种方法，其中所述的动物细胞为血管内皮细胞。
9.如权利要求7或8的一种方法，其中评价了所述化合物对休眠型TGF-β与动物细胞结合的促进活性。
10.筛选用于治疗或预防TGF-β相关疾病的化合物的一种方法，其包括向动物细胞添加如权利要求1-6中任一项的一种肽或其药学可接受的盐后测定TGF-β的量；向动物细胞添加待评价的化合物及如权利要求1-6中任一项的一种肽或其药学可接受的盐后测定TGF-β的量；以及从由于添加该化合物引起的TGF-β的量的改变来评价该化合物对休眠型TGF-β向TGF-β转化的抑制活性或促进活性。
11.如权利要求10的一种方法，其中所述的动物细胞为血管内皮细胞。
12.如权利要求10或11的一种方法，其中评价了所述化合物对休眠型TGF-β向TGF-β转化的抑制活性。
13.用于治疗或预防TGF-β相关疾病的一种化合物或其药学可接受的盐，其通过如权利要求7-12中任一项的方法筛选。
全文摘要
本发明提供了由下面的通式(Ⅰ)表示的肽,其具有促进从休眠型TGF－β中释放活性型TGF－β或具有促进休眠型TGF－β与细胞膜结合的活性;本发明也提供了通过鉴定上述活性筛选用于治疗或预防TGF－β相关疾病的化合物的方法;以及由这种方法获得的化合物。上述这些化合物和肽可用于治疗或预防诸如癌症、糖尿病性视网膜症、动脉粥样硬化等疾病。通式(Ⅰ):R
文档编号C07K14/435GK1226898SQ9880062
公开日1999年8月25日 申请日期1998年5月12日 优先权日1997年5月12日
发明者山崎基生, 柴田健志, 佐藤靖史 申请人:协和发酵工业株式会社