专利名称：单一聚合度的古罗糖醛酸的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种有机聚合物，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的单一聚合度的古罗糖醛酸。
在一日本文献(Preparation of two series of oligo-guluronic acids fromsodium alginate by acid hydrolysis and enzymatic degradation；Shimokawa-T；Yoshida-s；Takeuchi-T；Murata-K；Ishii-T；Kusakabe-I BioscienceBiotechnology and Biochemistry 60(9)1532-1534 1996)中公开了一种用鲍鱼丙酮粉提取物制备古罗糖醛酸的方法，该鲍鱼丙酮粉提取物中含有古罗糖醛酸裂合酶。这是一种应用酸水解和酶解制备聚合度2～7的寡聚古罗糖醛酸的方法，其制备分离效果不佳。
本发明的目的是提供一种分离效果好的单一聚合度的古罗糖醛酸的制备方法，并且该产品具有抗肿瘤活性，可用于开发抗肿瘤药物。
一种单一聚合度的古罗糖醛酸的制备方法，包括使褐藻酸钠溶于水，加入褐藻胶裂合酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，将溶液调pH产生沉淀，离心除去上清液，沉淀物用碱溶液溶解并调pH到中性，加入乙醇产生沉淀，干燥后得到各单一聚合度的古罗糖醛酸混合物，再用离子交换色谱柱进行分离，将古罗糖醛酸混合物用洗脱液洗脱，分步收集洗脱液组分，分别加入乙醇进行沉淀，脱盐后冻干，其特征是所述的将溶液调pH的范围为2.5～3.2，所述的洗脱液为醋酸钠的梯度洗脱液，所用的褐藻胶裂合酶是由弧菌产生的。
一种单一聚合度的古罗糖醛酸，其特征是具有抗肿瘤活性，用于开发抗肿瘤药物。
本发明的制备方法分离效率高，制出的各种单一聚合度的古罗糖醛酸具有不同程度的抗肿瘤活性，可用于开发成抗肿瘤药物。
下面通过实施例说明本发明。
取5g褐藻酸钠溶于100ml水，加入5单位(褐藻胶裂合酶的酶活力单位为每min使0.2％的褐藻胶溶液吸光度增加1所需的酶量为一个酶活单位。)由弧菌产生的褐藻胶裂合酶液，该酶的生产方法已在00111178.7号在先申请中叙述过了。在28℃下反应，直到230nm吸光值不再变化，然后沸水浴加热使酶失活，冷却后离心去杂质，将上清液调pH2.85，离心去掉上清液，沉淀用4mol/L的NaOH溶液调pH到7，加入乙醇使产品沉淀，干燥后得到不同聚合度的古罗糖醛酸混合物。用Q-sepharose fast flow阴离子交换色谱柱分离各单一聚合度的古罗糖醛酸。色谱柱先用0.1mol/L pH7.5的醋酸钠缓冲液起始洗脱液平衡好，再将lg上述制备的古罗糖醛酸溶于起始缓冲液上色谱柱，用0.1～1的醋酸钠梯度洗脱液洗脱，用230nm的紫外检测器检测洗脱下来的古罗糖醛酸含量，分步收集各洗脱组分，脱盐后分别加入乙醇沉淀出古罗糖醛酸，干燥后得到2～12不同聚合度的古罗糖醛酸。
采用本方法可以制备出聚合度为2～12的古罗糖醛酸。这些寡糖用高效阴离子交换色谱(high performance anion exchange chromatography HPAEC)检测为单峰，说明为单一聚合度。
用噻唑蓝(TTM)实验方法测定了用本发明的方法制备的单一聚合度的古罗糖醛酸的抗肿瘤活性。实验时将癌细胞以10％小牛血清(FCS)的RPMI1640培养基配成104个/ml悬液，于37℃，5％CO2，100μl/孔(96孔板)抚育24h，各组对应加古罗糖醛酸中的二糖和三糖，使其浓度分别为1，10，100ug/ml，空白组对应加培养基，每组5个平行孔，培养24h后加入5mg/ml的TTM 20ul，培养4h，去上清液加150ul二甲基亚砜(DMSO)，用酶标仪测定570nm，(630nm为设定波长)吸光值。所用的癌细胞株为Ovcar-3人卵巢癌细胞。用此方法测得二聚古罗糖醛酸3个剂量组的抑瘤率分别为27.36％，39.45％，35.55％，三聚古罗糖醛酸3个剂量组的抑瘤率分别为55.34％，58.10％，32.81％。
权利要求
1.一种单一聚合度的古罗糖醛酸的制备方法，包括使褐藻酸钠溶于水，加入褐藻胶裂合酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，将溶液调pH，离心除去上清液，沉淀物用碱液溶解并调到pH值中性，加入乙醇使产品沉淀，干燥后用离子交换色谱分离各单一聚合度的古罗糖醛酸混合物，将古罗糖醛酸混合物用洗脱液洗脱，分步收集洗脱液组分，分别加入乙醇进行沉淀，脱盐后冻干，其特征是所述的将溶液调pH范围为2.5～3.2，所述的洗脱液为醋酸钠的梯度洗脱液，所述的酶是由弧菌产生的专一性褐藻胶裂合酶。
2. 一种单一聚合度的古罗糖醛酸，其特征是具有抗肿瘤活性，用于开发抗肿瘤药物。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征是所述的古罗糖醛酸的单一聚合度分别为2～12。
全文摘要
一种单一聚合度的古罗糖醛酸的制备方法,包括使褐藻酸钠溶于水,加入褐藻胶裂合酶进行反应,用沸水浴加热使酶失活,离心后除去沉淀杂质,将溶液调pH,离心除去上清液,沉淀物用碱液溶解并调到pH值中性,加入乙醇使产品沉淀,干燥后用离子交换色谱分离各单一聚合度的古罗糖醛酸混合物,用醋酸钠的梯洗脱液洗脱,所述的将溶液调pH范围为2.5～3.2,所述的酶是由弧菌产生的专一性褐藻胶裂合酶。本产品具有抗肿瘤活性,用于开发抗肿瘤药物。
文档编号C08B37/00GK1341602SQ0011136
公开日2002年3月27日 申请日期2000年9月7日 优先权日2000年9月7日
发明者管华诗, 刘岩, 江晓路 申请人:青岛海洋大学