专利名称：蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的蛋白质及多肽胍基或其它含有胍基的化合物的聚乙二醇化试剂及其制备方法和用途。
背景技术：
随着生物技术的快速发展，越来越多具有生物活性的多肽，蛋白质，酶被人们用于临床治疗。然而这些生物大分子在直接应用于人体时存在着一些缺陷。这些缺陷包括1.快速排除，2.生物降解，3.引起免疫反应等等。因此，蛋白质特别是药用蛋白质的化学修饰至今仍然是一个热门的研究领域。许多天然及合成的分子正在被用做化学修饰。
聚乙二醇，这种合成的分子由于其生物相容性，对人体无毒，能够降低被修饰物的抗原性等优点被广泛用于蛋白质，多肽，酶甚至一些小分子药物的修饰。
聚乙二醇(PEG)是一种水溶性的聚合物。当与蛋白质(还有多肽，酶及其他生物活性分子)共价结合时，聚乙二醇能够弥补这些分子本身的不足，扩大其潜在的应用。与未修饰的对照物相比，PEG-蛋白质结合物这种改良了的药理学性质激发了人们开发这种结合物作为制剂的热情。例如，PEG-腺苷脱氨酶已获得FDA的批准；PEG修饰的细胞因子已被制成，并且PEG修饰的GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)显示了两种不相关联的生物学性质。
用于修饰的单甲氧基聚乙二醇mPEG-OH，是一种链状的聚醚化合物，在修饰蛋白质时通过使末端羟基变化而与蛋白质的氨基酸侧链官能团形成共价结合而达到修饰的目的。由于蛋白质和多肽中存在大量的侧链氨基，因此迄今为止人们多把mPEG的末端羟基改变为适合修饰氨基的化学结构，这样的修饰结果往往造成不确定的修饰产物，很难达成药用的目的，这也是迄今只有六种成功修饰药物的原因。为此，人们开始努力开发可以修饰其它侧链基团的PEG试剂，到目前为止，已经开发了修饰蛋白质中巯基的PEG试剂、修饰蛋白质中硫醚基的试剂。然而，目前还没有修饰蛋白质中精氨酸胍基的PEG试剂。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂及其制备方法和用途，以满足有关领域发展的需要。
发明人经考察发现，精氨酸的胍基可与1，3-二羰基化合物在温和的条件下发生如下反应，生成稳定的六元环结构 因此，如果在mPEG-OH中引入1，3-二羰基结构，即可得到一种新型的能够修饰蛋白质多肽中的胍基的PEG试剂。
本发明所述的蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂为mPEG对乙酰丙酮的单取代产物，结构通式如下 其中，m＝CH3-， n＝33～330；本发明的蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂可通过红外图谱进行表征。
本发明的蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂的制备方法包括如下步骤本发明设计的一条路线，可方便的高产率地合成一种新型的蛋白质多肽胍基PEG化试剂，步骤如下(1)将mPEG、叔丁醇钾与溴代丙酮在溶剂中室温反应10～24小时，得到mPEG丙酮；所说的溴代丙酮可采用市售产品，或采用如下的方法进行制备溴代丙酮的制备将定量的溴缓慢滴入含有少量硫酸的超量丙酮中，滴入时需要激烈搅拌。溴滴完后用用碱将反应液调至pH＝6.5～7.5，蒸馏出去过量丙酮，得到溴代丙酮，其化学结构式如下BrCH2COCH3优选的mPEG的分子量为2000～20000；所说的溶剂选自甲苯、苯、二氧六环中的一种，溶剂的用量并非关键，只要能够溶解mPEG即可；各个原料的摩尔比例为mPEG∶叔丁醇钾＝1∶1～2；mPEG∶溴代丙酮＝1∶2～5；(2)将所获得的mPEG丙酮在溶剂中与乙酐在催化剂三氟化硼的存在下，50～80℃反应6～10小时，然后从反应产物中收集终产物mPEG取代的乙酰丙酮，总产率在90％以上。
所说的溶剂选自二氧六环、苯、甲苯中的一种；各个原料的摩尔比例为mPEG丙酮∶乙酐＝1∶2～5；mPEG丙酮∶三氟化硼＝1∶1～5；采用本发明的方法所制备的mPEG取代的乙酰丙酮，能直接使用于蛋白质、多肽、氨基酸胍基的PEG化，并可用于包含胍基的其它化合物的PEG化。
由上述公开的技术方案可见，本发明具有十分显著的优点，合成路线设计合理；2.所用试剂价格低廉3.总产率在90％以上。
图1为中间产物mPEG-CH2-CO-CH3的红外图谱。
图2为终产物mPEG-CH2-CO-CH2-CO-CH3的红外图谱。
图3为使用终产物mPEG取代的乙酰丙酮修饰干扰素alpha-2b的电泳图(SDS-PAGE)图4为使用终产物mPEG取代的乙酰丙酮修饰白介素-2的电泳图(SDS-PAGE)。
具体实施例方式
实施例1以mPEG2000为起始原料的mPEG取代的乙酰丙酮的制备方法，其制备步骤为1)溴代丙酮的制备将2毫升溴缓慢滴入含有少量硫酸的150毫升丙酮中，滴入时需要激烈搅拌。溴滴完后用用饱和碳酸氢钠溶液将反应液调至pH7，用无水硫酸钠干燥后蒸馏出去过量丙酮，得到一溴代丙酮。
2)取mPEG2000(Fluka)10克(5mmol)溶于150毫升甲苯中，蒸馏出50毫升甲苯以除去水分，将温度降至60℃加入7.5毫摩尔的叔丁醇钾反应1小时后加入1中制备的溴代丙酮7.5毫摩尔室温反应10～24小时。将反应液用10倍的乙醚沉淀，再将沉淀用100毫升二氯甲烷溶解，加入适量活性炭和硅藻土过滤，将滤液加入过量乙醚(10倍)沉淀，得到8.5克白色粉末状的mPEG-丙酮。其红外图谱见附图1，附图1中在1600～1800cm-1为该产物的特征吸收。
3)将上步得到的mPEG丙酮4克溶于干燥过的50毫升二氧六环中，加入4毫摩尔乙酐，在加入适量的催化剂三氟化硼，在50～80度反应6～10小时后将反应体系温度降至室温，用过量的乙醚沉淀得到分子量为2000的终产物mPEG取代的乙酰丙酮。其红外图谱见附图2，附图2中在1600～1800cm-1为该产物的特征吸收。
实施例2以mPEG5000为起始原料的mPEG取代的乙酰丙酮的制备方法，其制备步骤为1)溴代丙酮的制备将2毫升溴缓慢滴入含有少量硫酸的150毫升丙酮中，滴入时需要激烈搅拌。溴滴完后用用饱和碳酸氢钠溶液将反应液调至pH7，用无水硫酸钠干燥后蒸馏出去过量丙酮，得到一溴代丙酮。
2)取mPEG5000(Fluka)10克(2mmol)溶于150毫升甲苯中，蒸馏出50毫升甲苯以出去水分，将温度降至60。C加入3毫摩尔的叔丁醇钾反应1小时后加入1中制备的溴代丙酮3毫摩尔室温反应10～24小时。将反应液用10倍的乙醚沉淀，再将沉淀用100毫升二氯甲烷溶解，加入适量活性炭和硅藻土过滤，将滤液加入过量乙醚(10倍)沉淀，得到8.9克白色粉末状的mPEG-丙酮。其红外图谱见附图1，附图1中在1600～1800cm-1为该产物的特征吸收。经羰基测定产率为99％。
3)将上步得到的mPEG丙酮5克溶于干燥过的50毫升二氧六环中，加入2毫摩尔乙酐，再加入适量的催化剂三氟化硼，在50～80度反应6～10小时后将反应体系温度降至室温，用过量的乙醚沉淀得到分子量为5000的终产物mPEG取代的乙酰丙酮。其红外图谱见附图2，附图2中在1600～1800cm-1为该产物的特征吸收。经羰基测定产率为90％实施例3mPEG取代的乙酰丙酮(胍基PEG化试剂)的修饰应用干扰素alpha-2b与新合成的试剂mPEG取代的乙酰丙酮在pH8.0，室温下反应。产物的SDS-PAGE电泳图谱(附图3)表明，有一条或多条修饰带。附图3中，M为分子量标准，1～3为修饰样品。可以看出，在不同的修饰条件下，胍基PEG化试剂mPEG取代的乙酰丙酮对干扰素alpha-2b呈现单修饰及多修饰带。
实施例4mPEG取代的乙酰丙酮(胍基PEG化试剂)的修饰应用白介素-2与新合成的试剂mPEG取代的乙酰丙酮在pH7.5，室温下反应。产物的SDS-PAGE电泳图谱见附图4，图4表明，有一条或多条修饰带。图中，M为分子量标准，0为未修饰的白介素-2对照，1～4为修饰样品。可以看出，在不同的修饰条件下，胍基PEG化试剂mPEG取代的乙酰丙酮对白介素-2呈现单修饰及多修饰带。
权利要求
1.蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂，其特征在于，为mPEG对乙酰丙酮的单取代产物，结构通式如下 其中，m＝CH3-， n＝33～330。
2.制备权利要求1所述的白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将mPEG、叔丁醇钾与溴代丙酮在溶剂中室温反应10～24小时，得到mPEG丙酮；(2)将所获得的mPEG丙酮与乙酐在催化剂三氟化硼的存在下，50～80℃反应6～10小时，然后从反应产物中收集终产物mPEG取代的乙酰丙酮。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，mPEG的分子量为2000～20000。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的溶剂选自甲苯、苯、二氧六环中的一种。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中各个原料的摩尔比例为mPEG∶叔丁醇钾＝1∶1～2；mPEG∶溴代丙酮＝1∶2～5。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)各个原料的摩尔比例为mPEG丙酮∶乙酐＝1∶2～5；mPEG丙酮∶三氟化硼＝1∶1～5。
7.根据权利要求1所述的白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂的应用，其特征在于，用于包含胍基的化合物的PEG化。
8.根据权利要求1所述的白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂的应用，其特征在于，直接使用于蛋白质、多肽或氨基酸胍基的PEG化。
全文摘要
本发明公开了蛋白质及多肽胍基的聚乙二醇化试剂及其制备方法和用途。将mPEG、叔丁醇钾与溴代丙酮在溶剂中室温反应10～24小时，得到mPEG丙酮；将所获得的mPEG丙酮和乙酐在催化剂三氟化硼的存在下，50～80℃反应6～10小时，然后从反应产物中收集终产物mPEG取代的乙酰丙酮，可用于包含胍基的化合物的PEG化。本发明合成路线设计合理，所用试剂价格低廉，总产率在90％以上。所获得的产品的化学通式如上。
文档编号C08G65/00GK1629193SQ20041005414
公开日2005年6月22日 申请日期2004年8月31日 优先权日2004年8月31日
发明者魏东芝, 何明磊, 熊玉春 申请人:华东理工大学