专利名称：一种南瓜多糖分离纯化的方法及所得组分的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖类分离纯化的方法及所得组分的用途，具体讲是采用 热水溶解和乙醇分级沉淀的分离技术从南瓜中分离纯化得到南瓜多糖的三种 组分及这三种组分的用途。
背景技术：
南瓜是葫芦科植物，果实无毒，是药食两用植物。据《滇南本草》记载， 南瓜性温，味甘无毒，入脾、胃二经，能润肺益气、化痰排浓、驱虫解毒、 治咳止喘，疗肺痈与便泌，并有利尿美容等作用。科学研究实验证表明南 瓜富含多种氨基酸、多糖、蛋白质、维生素、淀粉、葫芦巴碱、纤维素、植 物油以及部分微量元素。南瓜具有补中益气，排毒，驱虫，降低血压、血脂 和胆固醇等功效，特别是对糖尿病有着非常好的疗效。近年来，国内外专家对南瓜多糖多有研究，人们通过对多糖的分离和纯化使得这一高分子聚合物 在生命科学领域的研究有了重大发展。传统的南瓜多糖的分离纯化技术是将 南瓜热水浸提，水提液用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解后，上清液经透析或 膜分离，然后^^縮干燥，粗多糖采用离子交换纤维素柱层析和葡聚糖凝胶等分子筛柱层析对其进行纯化得到两种多糖组分pp-i和pp-n。该技术的不足之处是分离纯化步骤复杂，所需分离介质成本较高。另外有研究表明南瓜多 糖有降低糖尿病小鼠的血糖的作用，但其降糖机制尚不清楚，因此南瓜多糖 的开发和用途是一个有待于进一步研究的新课题。 发明内容南瓜作为一种药食两用植物，资源丰富，价格低廉；作为普通菜肴，受 到食用者青睐，作为长效、无毒、降血糖、调血脂药物或食疗剂，具有可进 一步开发利用的价值和研究前景。随着南瓜多糖在药理学功效日趋显现，本发明的目的旨在提供一种南瓜多糖分离纯化的方法。即采用热水溶解和乙醇 分级沉淀的分离纯化方法，从南瓜中分离得到南瓜多糖的三种组分50%乙 醇沉淀物，70%乙醇沉淀物和80%乙醇沉淀物。本发明的另一 目的是提供上述分离纯化得到的三种组分50%乙醇沉淀物 和70%乙醇沉淀物在防治糖尿病的用途；80%乙醇沉淀物可作为一种潜在的 白血病化疗药物的用途。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 一种南瓜多糖的分离纯化方法，其步骤是(1) 取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，经0.38%亚硫酸氢钠溶液 浸泡60min后，取出冲洗干净，添加3倍重量的蒸馏水，在75 80'C水浴上， 搅拌提取3次，时间分别为6小时，4小时和4小时，过滤；(2) 将上述所得滤液合并后，离心，取上清液真空浓缩，在浓縮液中加 入3倍体积的95%乙醇搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物；(3) 取沉淀物以去离子水充分溶解，Sevag法除蛋白即水溶液中加入 1/2体积的氯仿和正丁醇混合液，氯仿正丁醇=4:1，振荡使其充分混匀， 然后3000rmin"的转速离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变 性蛋白。水溶液仍按上述方法反复去蛋白，共3次；(4) 水溶液浓縮后，加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量为50 %，，加 入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇， 丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分50%乙醇沉淀物；上 述50%乙醇溶液中再加入95 %乙醇，使溶液中乙醇含量为70%,，加入乙醇 后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇，丙酮 依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分70%乙醇沉淀物；上述70% 乙醇溶液中再加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量为80%，，加入乙醇后静置 过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗 涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分80%乙醇沉淀物。50%乙醇沉淀物白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶 液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.24，多糖含量为11.9%，茚三酮反应颜色无明显变化，紫外光谱分析在260nm， 280nm处略有吸收，说明含有微量 蛋白质和核酸。70%乙醇沉淀物淡黄色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水 溶液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.26，多糖含量为19.7%，茚三酮反应 显紫色，紫外光谱分析在260nm， 280nm处有吸收，说明含有少量蛋白质和 核酸。80%乙醇沉淀物白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，水溶 液为无色透明粘稠状液体，PH值为6.31，多糖含量为22.5%，茚三酮反应显 紫色，紫外光谱分析在260nm， 280nm处有吸收，说明含有少量蛋白质和核 酸。本发明经分离纯化得到的南瓜多糖的三种组分50%乙醇沉淀物，70% 乙醇沉淀物和80%乙醇沉淀物，其用途分述如下本发明得到的南瓜多糖的分离组分50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物对 糖尿病的防治作用的研究主要通过MTT法测定大鼠胰岛P细胞存活率，光学显 微镜观察胰岛P细胞形态等实验，检测了南瓜多糖组分50%乙醇沉淀物和70 %乙醇沉淀物对大鼠胰岛P细胞的作用。本发明发现50%乙醇沉淀物和70%乙 醇沉淀物对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛I3细胞有一定的保护作用(见图l)，并能 抑制体外培养的大鼠胰岛I3细胞的凋亡(见图2)，由此说明南瓜多糖50%乙醇 沉淀物和70X乙醇沉淀物可能通过保护和修复损伤的胰岛p细胞对糖尿病有 一定的防治作用。本发明的南瓜多糖80%乙醇沉淀物对白血病潜在的治疗作用的研究主要 应用生长曲线测定法，检测不同浓度的80%乙醇沉淀物对人红白血病细胞株 K562细胞增殖的影响；用流式细胞仪检测药物对K562细胞凋亡的影响；根据 细胞形态、硝基蓝四氮唑(NBT)还原能力来测定K562细胞分化。本发明发现 80X乙醇沉淀物能明显抑制K562细胞的增殖(见图3)，抑制作用呈时间和浓 度依赖性；并能诱导K562细胞凋亡和分化(见图4)，由此说明南瓜多糖80% 乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物。本发明的优点和产生的有益效果本发明的特点是分离纯化的操作步骤相对简单，所需分离介质成本低，适宜大规模工业化生产；南瓜多糖50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物对糖尿 病有一定的防治作用，80%乙醇沉淀物可作为一种潜在的白血病化疗药物， 具备极高的药用前景。
图1.南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对四氧嘧啶损伤 的大鼠胰岛P细胞的保护作用。图2.不同浓度的南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对大 鼠胰岛P细胞凋亡的保护作用。图3.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的抑制作用。图4.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞分化的作用。
具体实施方式
实施例1取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切成厚度为0.2—0.5,的南瓜片，放 入烧杯中，加入0.38。/。亚硫酸氢钠溶液浸泡60min后，取出南瓜片，冲洗干 净，放入三角瓶中，添加3倍重量的蒸馏水，在75 80 。C水浴上，用玻璃 棒搅拌提取3次，时间分别为6小时,4小时和4小时。提取后滤液用滤纸过 滤。将所得滤液合并后，倒入烧杯中。离心，取上清液用旋转蒸发仪真空浓 縮。滤液真空浓縮后，将浓縮液倒入烧杯中，在浓縮液中加入3倍体积的95 %乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物。取沉淀物以去 离子水充分溶解得到水溶液，倒入烧杯中。Sevag法除蛋白即在水溶液中 加入1/2体积的氯仿和正丁醇混合液，氯仿正丁醇=4: 1,振荡使其充分 混匀，然后3000rmin 1离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色 变性蛋白。水溶液仍按此法反复去蛋白，共3次。除去蛋白后的水溶液用旋 转蒸发仪真空浓縮，浓缩液倒入烧杯中，加入95 %乙醇，用乙醇比重计测 定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇含量为50%，，加入乙醇后静置过夜，溶 液离心，得到沉淀物，把沉淀物收集到烧杯中，沉淀物用95°/。乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分50%乙醇沉淀物。上述50%乙醇溶液中再加入95 %乙醇，用乙醇比重计测定溶液中的乙醇含 量，使溶液中乙醇含量为70%,，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀 物，把沉淀物收集到烧杯中，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤， 冷冻干燥。得到分离后的南瓜多糖组分70%乙醇沉淀物。上述70%乙醇溶液 中再加入95 %乙醇，用乙醇比重计测定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇 含量为80%，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，把沉淀物收集 到烧杯中，沉淀物用95%乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻千燥。得到 分离后的南瓜多糖组分80%乙醇沉淀物。 实验l南瓜多糖(PP-l和PP-2)的生物活性实验 (一)胰岛细胞分离、纯化和培养参照Gotoh等方法，取Wistar大鼠，6%水合氯醛按0.75mL/100g大腿肌 肉注射麻醉，75%乙醇浸泡5min，无菌间超净工作台常规皮肤消毒，沿腹正 中线剪开皮肤，充分暴露腹腔，寻找胆总管，并结扎其十二指肠入口处，逆 行胆总管插管，注入胶原酶V (lg/L)约8-10mL，可见胰腺膨胀，顺序分离 胰腺，置预冷的D-Hank，s液(5mL)中，用D-Hank，s液洗两遍，并用眼科镊 剪碎胰腺组织。37。C水浴静置消化20min后，加入4°CD-Hank，s液终止消化， 吹散后过80目网筛，将滤过物800r/min离心5min，弃上清后，沉淀物中加 入Fico11400梯度离心液(25%、 23%、 20%、 11°/。)， 1000r/min离心10min， 对光亮，用裸眼在11%与20%， 20%与23%层面提取白色粒状悬浮物，用含 血清的培养液离心洗两遍，弃去上清夜，双硫腙染色后倒置显微镜下细胞计 数，台盼蓝染色观察细胞活性。将纯化的胰岛细胞置于RPMI1640完全培养 基(含15^胎牛血清，100IU/mL青霉素，10(Hig/mL链霉素，10mmol/LHEPES): 37"C，含5%C02的饱和湿度培养箱中培养，并根据细胞贴壁时间差分离纯化胰 岛细胞，即培养24小时后观察细胞生长状态，确认细胞生长良好后，将细胞从瓶底轻轻吹下，收集培养液并离心，加入新的培养液，以5X10V孔细胞数 接种于24孔培养板，每2天换液1次，继续培养7-21天，作为实验用细胞。(二) 南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)能够抑制四氧嘧啶 诱导的胰岛3细胞的损伤作用观察对南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对由四氧嘧啶诱 导胰岛e细胞损伤的保护作用在96孔细胞培养板中，接种胰岛P细胞(细 胞密度lX106/mL)，分别加入lOpl南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉 淀物)，浓度为0.1—0.6mg/mL，培养2小时，然后加入四氧嘧啶(浓度为 2mmol/L )。培养24小时后，每孔加入lOpl MTT (5mg/mL)，继续培养4 小时后，吸取培养液，加入与培养液相同量的异丙醇溶液，设置只加培养液 孔为对照组，37。C饱和湿度放置过夜后，在酶联免疫测定仪(Bio-Rad550， USA) 570nm测定光密度(OD)，细胞存活率按下面公式计算存活率(％) =药物组00/空白对照OD xioo。MTT比色试验表明，南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)与 胰岛P细胞共同孵育2小时后，加入四氧嘧啶共同培养24小时，在50%乙 醇沉淀物浓度为0.6mg/mL和70%乙醇沉淀物浓度为0.1mg/mL时，吸光值与 四氧嘧啶诱导损伤对照组的吸光值相比具有显著性差异(PO.Ol )，说明胰岛p 细胞存活率高于诱导损伤对照组，表现出南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙 醇沉淀物)对胰岛P细胞损伤的保护作用(如图l)。图1柱形图说明了南瓜多糖对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛e细胞的保护作 用。胰岛P细胞中加入南瓜多糖孵育2小时，再加入四氧嘧啶(2mmol/L)作用 24小时。MTT比色法检测细胞存活率。x±s,n=6。 *P<0.01相比于四氧嘧啶 损伤组。光学显微镜观察结果原代分离纯化的大鼠胰岛细胞，培养7天后，以 胰岛细胞团的形式贴壁，折光度强，生长有发育良好的突起，细胞均贴壁， 形态完整。加入四氧嘧啶后，可见大部分细胞形态肿胀，聚集成团，贴壁细 胞縮短或消失，有些细胞轮廓不清，细胞膜的连续性消失。加入南瓜多糖(50 %乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)处理后，具有完整形态的细胞数目增多，细 胞折光度^显恢复，染色质浓縮明显减少，形态接近正常。(三) 南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)抑制胰岛3细胞的凋亡原代分离纯化的大鼠胰岛细胞，在体外培养的时候容易出现细胞凋亡现象，所以观察南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对胰岛^细胞自 身凋亡的保护作用在96孔细胞培养板中，接种胰岛P细胞(细胞密度1X 106/mL)，分别加入南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)，浓 度为0.1—0.6mg/mL，培养24小时后，利用MTT法检测细胞存活率。MTT比色试验表明，南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)与 胰岛P细胞共同培养24小时后，在50 %乙醇沉淀物浓度为0.6mg/mL (PO.01) 和70X乙醇沉淀物浓度为0.1mg/mL和0.3mg/ml(PO.05 )时，吸光值与对照 组的吸光值相比出现显著性差异，说明胰岛P细胞存活率高于对照组，表现 出南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)对胰岛p细胞生长的保护作 用，能够抑制胰岛e细胞的凋亡(如图2)。图2柱形图说明了不同浓度的南瓜多糖对大鼠胰岛e细胞凋亡的保护作 用。胰岛P细胞中加入南瓜多糖孵育24小时，MTT比色法检测细胞存活率。 ;c土s，n-6。 *P<0.01相比于对照组，**P<0.05相比于对照组。 实验2南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)的生物活性实验 (—)南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的影响采用台盼蓝染色计数法，绘制K562细胞生长曲线，观察80%乙醇沉淀 物对K562细胞增殖的影响。取对数生长期的K562细胞置于RPM1640完全 培养基(含15%小牛血清，100IU/mL青霉素，10(Hig/mL链霉素，1Ommol/L HEPES)中，37°C，含5%<302的饱和湿度培养箱中培养。在24孔细胞培养 板中，接种K562细胞(细胞密度3X10VmL)，分别加入100nl南瓜多糖(80 %乙醇沉淀物)，浓度为0.15—0.4mg/mL，培养96小时。分别在培养第72和 96小时取样，然后进行台盼蓝染色,计数活细胞数(如图3)。图3折线图说明了南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞增殖的抑 制作用。K562细胞(细胞密度3X10VmL)，分别加入南瓜多糖(80%乙醇沉 淀物)，浓度为0.15—0.4mg/mL，培养96小时。分别在培养第72和96小时取样，然后进行台盼蓝染色，计数活细胞数。x±s,n=3。(二) 南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞凋亡的影响 取对数生长期的K562细胞置于RPMI1640完全培养基(含15%小牛血清，100IU/mL青霉素，100pg/mL链霉素，1Ommol/LHEPES)中，37°C，含 5%0:02的饱和湿度培养箱中培养。接种K562细胞(细胞密度3X104 /mL) 于细胞培养瓶中，分别加入南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)，浓度为0.2 — 0.4mg/mL，培养72小时。收集细胞，FITC/PI双染，流式细胞仪测定细胞凋 亡率。数据表明，南瓜多糖(80X乙醇沉淀物)能诱导K562细胞凋亡(如表1)。表1.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)作用K562细胞72小时对细胞凋亡率的影响_南瓜多糖(80% 正常早期凋亡晚期凋亡总凋亡率乙醇沉淀物)浓(％) (%) (%) (%)度(mg/mL)0 99.5 0.28 0.11 0.390.2 89.2 1 4.45 5.450.4 76.5 1.43 15.1 16.53(三) 南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞分化的影响 取对数生长期的K562细胞置于RPMI1640完全培养基中，37°C，含5%032的饱和湿度培养箱中培养。接种K562细胞(细胞密度3X10VmL)于 细胞培养瓶中，分别加入南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)，浓度为0.2—0.4mg/mL， 培养72小时。收集细胞，NBT染色，检测K562细胞的分化。南瓜多糖(80 %乙醇沉淀物)作用72小时后，K562细胞的NBT还原能力增加，有分化的 趋势(如图4)。图4柱形图说明了南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)对K562细胞分化的作用。 K562细胞(细胞密度3X10VmL)，分别加入南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)，浓 度为0.15—0.4mg/mL，培养72小时，进行NBT染色，观察细胞分化程度。jc± ■s, n=3 。
权利要求
1. 一种南瓜多糖的分离纯化方法，其特征在于(1).取新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，经0.38％亚硫酸氢钠溶液浸泡60min后，取出冲洗干净，添加3倍重量的蒸馏水在75～80℃水浴上，搅拌提取3次，时间分别为6小时，4小时和4小时，过滤；(2).将所得滤液合并后，离心，取上清液真空浓缩，在浓缩液中加入3倍体积95％乙醇搅拌均匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物；(3).取沉淀物用去离子水充分溶解得到水溶液，Sevag法除蛋白即在水溶液中加入1/2体积的氯仿和正丁醇混合溶液，氯仿∶正丁醇＝4∶1，振荡使其充分混匀，然后3000rmin-1离心15min，除去水溶液与有机溶液交界处的灰白色变性蛋白；水溶液仍按此法反复去蛋白，共3次；(4).水溶液浓缩后，加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为50％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分50％乙醇沉淀物；上述50％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为70％，，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分70％乙醇沉淀物；上述70％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量为80％，加入乙醇后静置过夜，溶液离心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，无水乙醇，丙酮依次洗涤，冷冻干燥，得到分离后的南瓜多糖组分80％乙醇沉淀物。
2. —种南瓜多糖分离纯化得到的三种组分50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉 淀物在防治糖尿病方面和80%乙醇沉淀物作为一种潜在的白血病化疗药物的 用途。
全文摘要
本发明涉及采用热水溶解和乙醇分级沉淀的分离技术从南瓜中分离得到南瓜多糖的三种组分50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。其步骤是采用热水浸提获得南瓜水提液，有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液浓缩，除蛋白，经乙醇分级沉淀获得南瓜多糖的三种组分50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。本发明方法工艺简单，适宜工业化生产。经生物活性试验表明，三种多糖组分无毒副作用，多糖组分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物能抑制大鼠胰岛β细胞的凋亡和保护损伤的大鼠胰岛β细胞，80％乙醇沉淀物能抑制白血病细胞增殖，诱导其凋亡和分化。
文档编号C08B37/00GK101220100SQ20071001728
公开日2008年7月16日 申请日期2007年1月10日 优先权日2007年1月10日
发明者烨 于, 静 刘, 樊瀛哲, 锐 王 申请人:兰州大学