专利名称：：可降解pcfc－pei聚合物、制备方法及在药物传递系统中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于药用高分子材料领域，具体涉及一种同时传输化疗药物和基因药物的可降解聚乙烯亚胺交联聚合物PCFC—PEI及其制备方法和在药物传递系统中用途。
背景技术：
：在肿瘤治疗过程中，如果能够将化学治疗与基因治疗相联合，其治疗效果将会出现协同或相加的作用，但目前还少有化疗药物和基因药物的同时传输系统，因此开发出新型传输系统非常重要。有关聚乙烯亚胺(PEI)作为基因治疗载体方面的文献比较多。其中对PEI的聚乙二醇接枝共聚物(PEI-g-PEG)、水溶性脂聚体、可降解PEI、结合靶向单元的PEI进行了综述；文献中也透明质酸接枝聚乙烯亚胺共聚物、聚乙二醇-聚乙烯亚胺、壳聚糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸甲酯-聚乙烯亚胺、可生物降解的交联聚乙烯亚胺等共聚物的制备，这些聚乙烯亚胺共聚物可作基因传递载体，或者药物传递载体，但都未能作为化疗药和基因药的同时传输载体。PEI25KD是转染效率高的非病毒基因治疗载体，但存在毒副作用大、且不可降解的缺点，因此至今未能进入临床实验。PCFC为可降解高分子材料，用PCFC自组装制成的胶束能够装载紫杉醇、姜黄素、和厚朴酚等化疗药物，但难以装载基因药物。通常聚合物只能通过包裹的方式将DNA装载到纳米粒子的内部，但这一过程需要采用有机溶剂才能完成，通常这会导致基因药物失活。目前对肿瘤的临床治疗的趋势是采用两种方案的协同治疗，如果能将化疗药和基因药同时装载于一种载体内部，那么这将会非常大地提高肿瘤治疗的疗效。本领域目前需要得到的可同时传递化疗药和基因治疗药物的载体材料。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时传递化疗药和基因治疗药物的可降解载体材料。解决该技术问题的技术方案是提供一种聚乙烯亚胺交联聚合物。本发明可降解聚乙烯亚胺交联聚合物是由聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯(PCL—Pluronic—PCL，简称为PCFC)偶联聚乙烯亚胺(PEI)而得到的交联共聚物。其中，上述可降解PCFC—PEI聚合物中聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯共聚物部分的分子量为3000-IOOOOO道尔顿。其中，上述可降解PCFC—PEI聚合物中聚乙烯亚胺部分的分子量范围为600-25000道尔顿其中，上述聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯共聚物中泊洛沙姆嵌段的分子量为1100-12500道尔顿。其中，上述可降解PCFC—PEI聚合物中聚乙烯亚胺部分的分子量范围优选为1800-25000道尔顿。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种药物释放纳米载体。该药物释放纳米载体是由上述的PCFC—PEI交联聚合物所制备而成。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述可降解PCFC—PEI聚合物的制备方法。该方法包括以下步骤a、准备聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯；b、称量PCFC溶于溶剂中，转移到惰性气氛下，然后取甲基丙烯酸縮水甘油酯加入反应体系中，混合均匀，取二甲氨基吡啶溶于溶剂后，转移到上述反应体系中，反应得GMA-PCFC-GMA;c、取GMA-PCFC-GMA溶于溶剂，转移到惰性气氛中，称取PEI溶于溶剂中，转移到反应系统中，惰性气氛下在37。C6(TC下反应得PCFC—PEI交联聚合物。进一步的，上述方法包括以下步骤a、加入一定量的Pluronic和己内酯，以辛酸亚锡为催化剂，在130。C氮气保护下反应5h，然后将反应体系抽至真空，1h后，终止反应，待反应体系温度降至室温，得PCFC;b、称量PCFC溶于无水二氯甲烷中，转移到氮气环境下，然后取GMA加入反应体系中，混合均匀，取DMAP溶于无水二氯甲烷后，转移到上述反应体系中，室温反应得GMA-PCFC-GMA;c、取GMA-PCFC-GMA溶于无水二氯甲烷，转移到充满氮气的三颈瓶中，准取PEI溶于一定量的无水甲醇中，转移到反应系统中，氮气保护下在37'C6(TC下反应572小时，最后将产物冻干，密封保存，即得。本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述可降解PCFC—PEI聚合物在制备药物组合物中的用途。本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种药物组合物。该药物组合物是由上述的可降解PCFC—PEI聚合物作为载体材料包封药物有效成分所制备而成。其中，上述药物组合物中同时包封有肿瘤化疗药物和基因治疗药物。进一步的，上述药物组合物的剂型为纳米粒、毫微球或胶束。本发明可降解PCFC—PEI聚合物能够将和厚朴酚、姜黄素或紫杉醇等化疗药物与装载有EGFR、FAK等基因的表达载体同时传输，并且由于有PCFC的引入，带来了好的可降解性具有很好的具有可控的可降解性、合格的安全性、好的机体适应性。形成的纳米粒子的粒径均一，穿透性好；装载了药物的本发明可降解PCFC—PEI聚合物纳米胶束疗效更强，节约药物的用量；也更能保护基因治疗药物的的活性不致失去，更为稳定；比现有技术的安全性更好，克服了现有技术的种种弊端。本发明可降解PCFC—PEI聚合物制备方法步骤简单，成本低廉，条件可控，适用于大规模生产。图1为GMA-PCFC-GMA(GCFCG)的合成产物的4-NMR核磁图谱。图2为PCFC-PEI25000交联共聚物的4-NMR核磁图谱。图3为PCFC合成产物的4-NMR核磁图谱。图4为PCFC-PEI1800交联共聚物的111-NMR核磁图谱。图5为直观表示PCFC-PEI交联共聚物具有装载小分子化疗药物姜黄素curcumine的能力。图e为用凝胶阻滞分析证明PCFC-PEI交联共聚物同时装载小分子化疗药物和基因治疗药物的能力。图7表示装载有pcDNA3.1的PCFC-PEI1800交联共聚物胶束将pcDNA3.l转入HEK293细胞(a):HEK293细胞在转染24小时后的绿色荧光显色图，胶束与DNA的w/w为80;(b):表示对照组24小时后的绿色荧光显色图，少见有绿色荧光蛋白表达。图8为PCFC—PEI1800与pcDNA3.l形成的胶束纳米粒子的粒径，(本申请中PCFC—PEI常简写为PEAs)。图9为PCFC—PEI1800与pcDNA3.1形成的胶束纳米粒子的ZETA电位。图10为PCFC—PEI25000与pcDNA3.1按不同N/P值制成的胶束纳米粒子在琼脂糖凝胶电泳中的表现。图12-a表明随PCFC—PEI25000用量的增加，pcDNA3.l得到更好的包封；图12-b，为将制得的胶束纳米粒子用足量DNasel处理后，再用lmg/ml的肝素处理使纳米粒子中装载的pcDNA3.l释放后再进行电泳，DNA+泳道为经DNasel处理后的pcDNA3.1。图11为PCFC—PEI1800与pcDNA3.1按不同N/P值制成的胶束纳米粒子在琼脂糖凝胶电泳中的表现。图12为经不同浓度PCFC-PEI交联共聚物(PEAs，由数均分子量25000的PEI制得)和数均分子量25000的PEI处理后的293细胞生存率。细胞生存率为570nm下试验组的吸收值/对照组吸收值X100。/。.。图13为经不同浓度PCFC-PEI交联共聚物(PEAs，由数均分子量1800的PEI制得)和数均分子量1800的PEI处理后的293细胞生存率。具体实施方式主要仪器及试剂MALVERN粒径仪(MALVERNNanoZS，英国)、GMA(甲基丙烯縮7K甘油酯，Aldrich，美国)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP，Aldrich，美国)，辛酸亚锡(Stannousoctoate，Sigma，美国)，姜黄素(curcumine，Aldrich，美国)，e-己内酉g(Sigma，美国)，DMSO(dimethylsulfoxide,Sigma，美国)，泊洛沙姆(平均分子量1100-12500的多种，Sigma，美国)，聚乙烯亚胺(平均分子量范围1800—25000的多种，Sigma，美国)，旋转蒸发仪(BUchi，2升，瑞士)，水为双蒸水，其余试剂为常规市售AR级(分析纯)试剂。实施例一本发明PCFC—PEI的制备泊洛沙姆(Pluronic105)Mn=1900g/mole-己内酉g(e-CL)Mn=114g/mol甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)Mn=142g/mold=l.04g/ml二甲氨基吡啶DMAPMn=122g/mol分枝PEI(Sigma，美国)Mn=25000g/mol1、PCFC合成在装有搅拌器的三口烧瓶中按反应式加入的Pluronic105(Mn=1900)和己内酯(e-CL)，以辛酸亚锡为催化剂，在130。C氮气保护下反应5h，然后将反应体系抽至真空。1h后，终止反应，待反应体系温度降至室温，用三氯甲烷溶解聚合物，然后将其倒入冷石油醚中沉淀，如此溶解沉淀处理3次，最后将纯化的聚合物真空干燥后备用，理论数均分子量PCFC二2900g/mo1。反应方程式如下，式中X、Y、Z均为正整数准确称量合成的PCFC，溶于无水二氯甲烷中，搅拌使其充分溶解。溶解完全后，迅速转移到充满氮气的三颈瓶中。然后准确量取GMA加入上述反应体系中，继续搅拌使其充分混合均匀。准确称取DMAP溶于少许无水二氯甲烷中，搅拌使其充分溶解。溶解完全后，迅速转移到上述反应体系中。氮气环境、室温下反应、48小时后反应结束。实验完毕后，除去部分溶剂，用冷的石油醚洗涤产品，反复数次，以除去过量的GMA。最后真空、室温，干燥l-2天，产品留以备用。理论数均分子量二3100-3200g/mo1，产物的核磁图谱如图l所示。反应方程式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>称取GMA-PCFC-GMA溶于一定量的无水二氯甲烷，搅拌使其充分溶解，溶解完全后，转移到充满氮气的三颈瓶中。准确称取branchPEI(Mn=600-25000)溶于一定量的无水甲醇中，搅拌使其充分溶解，溶解完全后，转移到上述反应系统中。4(TC氮气保护反应48小时，进行迈克尔氏加成反应。反应验结束，除去部分溶剂，用冷的石油醚洗涤产品，反复数次。常温，真空干燥数小时。所得产品溶于水，用Mw5000的透析袋透析3-4天。最后冷冻干燥，得产品。反应方程式如下，X、Y均为大于l的正整数<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>上述制备得到的PCFC和PCFC-PEI共聚物的核磁图谱如图2所示，结果表明其均已成功合成。用凝胶排阻色谱(SEC)-多角度激光散射(multipleanglelaserlightscattering，MALLS)联用测得其数均分子量为4.3X104，重均分子量为l.0X105。实施例二本发明PCFC—PEI的制备泊洛沙姆(Pluronic105)Mn=1900g/mol己内酉g(e—CL)Mn=114g/mol甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)Mn=142g/mold=l.04g/ml二甲氨基吡啶DMAPMn=122g/mol分枝PEI(Sigma，美国)Mn=1800g/mol使用M『1800的PEI合成本发明PCFC-PEI交联共聚物具体反应条件见实施例一。主要步骤为1、PCFC合成；2、GMA-PCFC-GMA(GCFCG)的合成，产物的核磁图谱如图3所示；3、迈克尔氏加成反应合成PCFC—PEI，产物的核磁图谱如图4所示，结果表明产物成功合成。实施例三PCFC—PEI纳米胶束的制备和装载化疗药物称取1OmgPCFC—PEI共聚物加入到50°C的1毫升的蒸馏水中，5分钟后由于温度引起的PCFC—PEI胶束形成。将PCFC—PEI胶束冷却到37'C保存备用。用马尔文粒度仪检测其粒径大小，发现本随着PCFC—PEI胶束的粒径、Zeta电位随着温度有所变化。结果表明可通过温度来控制PCFC—PEI纳米胶束的尺寸。化疗药物姜黄素、和厚朴酚、紫杉醇等容易装载于本发明PCFC—PEI共聚物纳米胶束中，方法为将上述小分子化疗药物加入到制备好的PCFC—PEI胶束中，采用超声分散器(JY92一2D，宁波新芝)进行超声分散，30分钟后，化疗药物一胶束的混合物采用高速离心的方法进行分离，将没有装载到纳米胶束内部的化疗药物沉淀分离出来，所得的澄清胶束溶液即为载有化疗药物的PCFC—PEI胶束溶液。通过本发明所制备的载有化疗药物的PCFC—PEI纳米胶束，经Malvern粒径仪检测平均粒径小于200nm，且均一性好。使用本发明PCFC—PEI载体装载基因药物。过程如下在37。C下，将不同重量比例的pDNA加入到上述制备的PCFC—PEI胶束溶液中，10分钟后，即可得到载有基因治疗药物的复合药物。使用本发明PCFC—PEI载体同时装载化疗药物和基因药物。过程如下在37。C下，将不同重量比例的pDNA(质粒pcDNA3.1，含有绿色荧光蛋白基因作为报告基因，Invitrogen，USA)加入到上述制备的载有化疗药物的PCFC—PEI胶束溶液中，10分钟后，即可得到同时载有化疗药和基因治疗药物的复合药物。图5为直观表示PCFC-PEI交联共聚物具有装载小分子化疗药物姜黄素curcumine的能力'l'瓶是非常浑浊的姜黄素水混悬液；'2'瓶为装载姜黄素的PluronicF127胶束；'3'瓶是装载姜黄素的PCFC-PEI交联共聚物.图e为用凝胶阻滞分析证明PCFC-PEI交联共聚物同时装载小分子化疗药物和基因治疗药物的能力。第l道是单独的DNA(质粒pcDNA3.1)，第12道为maker.第2道到第6道分别为装载有姜黄素的PCFC-PEI交联共聚物胶束与DNA(质粒pcDNA3.l)形成的复合物，胶束与DNA的重量比分别为1:4，1:2，1:1，2:1and4:1;第7道到第11道分别为装载有和厚朴酚的PCFC-PEI交联共聚物胶束与DNA(质粒pcDNA3.l)形成的复合物，胶束与DNA的重量比分别为1:4，1:2，1:1，2:1and4:1。图7表示装载有pcDNA3.1的PCFC-PEI1800交联共聚物胶束将pcDNA3.l转入HEK293细胞(a):HEK293细胞在转染24小时后的绿色荧光显色图，胶束与DNA的质量比为80:1;经流式细胞仪检测转染效率为17%;(b):表示对照组(同样质量比的PEI1800)24小时后的绿色荧光显色图，少见有绿色荧光蛋白表达，转染效率为0.5%。从上可见，在超声波的帮助下，和厚朴酚和姜黄素都容易被装载入PCFC-PEI交联共聚物胶束，这表明本发明PCFC-PEI交联共聚物具有同时传输至少两种不同的化疗药物的能力。另夕卜，包埋了小分子药物的PCFC-PEI胶束的zeta电位并没有受到明显的影响，同时还具有装载DNA的能力。凝胶阻滞实验表明PCFC—PEI可以保护DNA，而防止DNA的降解。同时PCFC—PEI装载小分子药物和基因药物具有可降解和缓释效果在载药转染HEK293细胞(PCFC-PEI/DNA质量比是3:1)的转染24小时后还能检测到所携带的质粒子上的基因的表达。同时，所装载的和厚朴酚也从PCFC—PEI胶束中逐渐缓慢。表明至少24小时内，该载体所装载的小分子药物和基因治疗药物都能缓慢释放并持续发挥作用。试验例一本发明PCFC—PEI交联共聚物的包封试验本试验是对PCFC—PEI交联共聚物的包封方法，尤其是对质粒DNA的包封条件进行探讨。由于本发明PCFC—PEI交联共聚物易于与小分子药物和DNA形成胶束，而小分子化疗药物一般用量较少，这里主要对PCFC—PEI交联共聚物与DNA的配比进行试验(PCFC—PEI交联共聚物与质粒DNA的重量比用N/P表示)。分别使用上述制备的PCFC—PEI25000和PCFC—PEI1800与pcDNA3.1按不同的质量比制成胶束纳米粒子进行试验。PCFC—PEI25000和PEI25000分别按不同的质量比与pcDNA3.l形成的胶束纳米粒子的粒径见表l，ZETA电位见表2。结果表明PCFC—PEI25000形成的粒子粒径更大，ZETA电位明显更低<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCFC—PEI1800与pcDNA3.l形成的胶束纳米粒子的粒径见图8，ZETA电位见图9。结果表明随PCFC—PEI1800用量的增加，包封形成的胶束纳米粒子的粒径变/、ZETA电位变大。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>图1O为PCFC—PEI25000与pcDNA3.1按不同N/P值制成的胶束纳米粒子在琼脂糖凝胶电泳中的表现。图10-a表明随PCFC—PEI25000用量的增加，pcDNA3.l得到更好的包封，N/P值l以上就包封得较好；图10-b，为将制得的胶束纳米粒子用足量DNasel处理后，再用lmg/ml的肝素处理使纳米粒子中装载的pcDNA3.l释放后再进行电泳，结果表明N/P值2及以上，均能很好的抵抗DNasel的降解作用。图11为PCFC—PEI1800与pcDNA3.1按不同N/P值制成的胶束纳米粒子在用琼脂糖凝胶电泳中的表现。结果表明N/P值0.5时能较好的包封。试验例二本发明PCFC—PEI交联共聚物的细胞毒性实验采用MTT法评价本发明PCFC—PEI交联共聚物对293细胞毒性作用。293的培养基为DMEM，细胞在5%C02和37。C条件下培养待用。以104细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板。培养24小时后，用无血清培养基置换，分别加入PCFC—PEI纳米胶束，使之终浓度为l、2、5、7、10和20yg/ml。生理盐水和PEI25000(1、2、5、7、10和20yg/ml)为对照组。48小时后，去除含纳米胶束培养基，每孔加入100ul新鲜培养基和10ulMTT溶液(5mg/ml)在37。C下孵育4小时，吸弃培养基，用无血清培养基洗1次，然后每孔加入200ul盐酸-异丙醇(0.lmol/L)，混匀，使紫色结晶完全溶解。以570nm波长测定光密度值。结果PCFC—PEI(PEI25000)纳米胶束的体外细胞毒性研究结果见图ll。总的来说，PCFC—PEI纳米胶束对人293细胞等毒性作用均较低。与对照组相比，PCFC—PEI纳米胶束在5、7、10和20yg/ml的中高处理浓度下，毒性作用显著低于相同浓度的PEI25000。本发明还评价了PCFC—PEI(其中PEI分子量1800)与的PEI1800(数均分子量为1800)的细胞毒性，试验方法同上，结果表明PCFC—PEI(其中PEI分子量1800)对293T细胞的毒性仍然小于相同浓度的PEI1800，结果见图12。结果表明本发明所制备的PCFC—PEI胶束等纳米粒子细胞毒性小，且PCFC—PEI纳米粒子细胞毒性与PEI胶束相比明显的小。总之，本发明载体材料具有良好的生物相容性。上述实例表明，本发明提供了一种能够同时装载化疗药物和基因治疗药物的新型PCFC—PEI交联共聚物载体材料。由于PCFC—PEI具有良好的生物相容性，能够同时装载化疗药物和基因药物，并且可以生物降解。因此，该新型载体在抗肿瘤药物的制备领域具有广阔的应用前景。权利要求1.可降解PCFC-PEI聚合物，其特征在于由聚己内酯-泊洛沙姆-聚己内酯偶联聚乙烯亚胺而得到的交联共聚物。2根据权利要求1所述的可降解PCFC—PEI聚合物，其特征在于其中聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯共聚物的分子量为3000-100000道尔顿。3根据权利要求1所述的可降解PCFC—PEI聚合物，其特征在于聚乙烯亚胺的分子量范围为600-25000道尔顿。4根据权利要求2任一项所述的可降解PCFC—PEI聚合物，其特征在于所述的聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯共聚物中泊洛沙姆嵌段的分子量为1100-12500道尔顿。5一种药物释放纳米载体，其特征在于由权利要求14任一项所述的可降解PCFC—PEI聚合物所制备而成。6一种制备权利要求14任一项所述的可降解PCFC—PEI聚合物的方法，其特征在于包括以下步骤a、准备聚己内酯-泊洛沙姆一聚己内酯；b、称量PCFC溶于溶剂中，转移到惰性气氛下，然后取甲基丙烯酸縮水甘油酯加入反应体系中，混合均匀，取二甲氨基吡啶溶于溶剂后，转移到上述反应体系中，反应得GMA-PCFC-GMA;c、取GMA-PCFC-GMA溶于溶剂，转移到惰性气氛中，称取PEI溶于溶剂中，转移到反应系统中，惰性气氛下在37。C6(TC下反应得PCFC—PEI交联聚合物。7权利要求14任一项所述的可降解PCFC—PEI聚合物在制备药物组合物中的用途。8药物组合物，其特征在于由权利要求14任一项所述的可降解PCFC—PEI聚合物作为载体包封药物有效成分所制备而成。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于同时包封有肿瘤化疗药物和基因治疗药物。10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物的剂型为纳米粒、毫微球或胶束。全文摘要本发明属于药用高分子材料领域，具体涉及一种能同时传输化疗药物和基因药物的可降解聚乙烯亚胺(PCFC-PEI)交联聚合物及其制备方法和用途。本发明PCFC-PEI载体是由聚己内酯泊洛沙姆-聚己内酯偶联聚乙烯亚胺而得到的一种新型载体材料，其中泊洛沙姆为聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物，其分子量为1100-12500，聚乙烯亚胺段的分子量为600-25000。该可降解聚乙烯亚胺交联聚合物可以作为新型药物释放载体使用，能够将小分子化疗药物与基因治疗药物同时传输，这在抗肿瘤药物的制备中具有广阔的应用前景。文档编号C08G81/00GK101665574SQ200910308100公开日2010年3月10日申请日期2009年10月9日优先权日2008年10月9日发明者霞赵,邓洪新,钱志勇,魏于全申请人:四川大学