专利名称：一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医用胶原组织修复材料，具体涉及一种具有致密层和疏松层 仿生结构的胶原基组织修复材料的制备方法。本发明可应用于各种因组织坏死或肿瘤切除 等造成的局部硬、软组织的缺损的修复。
背景技术：
胶原作为作为一种天然高分子材料，在引导组织修复再生领域越来越多的受到国 内外专家学者的重视。这主要是由于胶原是细胞外基质的主要成分，具有良好的生物相容 性，能促进细胞的粘附、增殖和分化。在某些应用过程中，胶原组织修复材料不仅要能成功 引导细胞生长，更重要的是作为一种物理屏障，提供一个稳定的空间供新生组织生长，同时 阻止周边组织细胞的长入，从而达到促进缺损区组织重建的目的。这就需要胶原组织修复 膜材料具有一种既有疏松表面又有致密表面的仿生结构。通常来讲，动物组织的结构都存 在由表及里的梯度变化，不同的结构具有不同的生理作用。如软组织皮肤由表皮、真皮及皮 下组织三部分组成。表皮薄而致密，构成皮肤的保护层。而皮下组织厚而疏松的结缔组织 等构成，起到储能和缓冲作用。因此，本发明以仿生学为出发点，模仿生物组织的梯度变化 结构制备仿生型胶原材料，此材料将较有利于各种软硬组织的修复，如皮肤，角膜，骨及软 骨等。目前关于胶原膜的制备方法中，多数需要采用两种不同的原材料。这样虽然可以 延长材料的降解时间，但由于非胶原类的材料生物相容性较差，不免会降低整个材料的质 量和修复效果。所以本发明要避免引入第二种材料，通过其他方法改善胶原膜的降解性能， 使胶原膜的降解速度与新生组织的生长速度相匹配，达到良好的修复效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种简单有效的制备仿生型改性胶 原组织修复材料的方法。由于组织缺损之后，缺损组织周边细胞与缺损组织细胞生长速度 不同，所以依靠自身修复能力并不能达到生理性修复。此时，需要一种膜材料作为屏障，隔 离不同生长速度的细胞，防止缺损组织周边细胞优先长入受损组织区域，从而为缺损组织 细胞的生长提供一个良好的空间环境。本发明的膜材料一面相对致密，可以有效阻隔缺损 组织周边细胞优先长入组织受损区域；另一面相对疏松，有利于生长相对较慢的受损组织 细胞生长，最终达到修复受损组织的目的。本发明采用专利号为200510057437. X的一种碱溶胀-酸酶解方法从从牛筋腱中 提取I型胶原，经过冻干、压制、涂覆、交联再冻干等工艺制备出仿生型改性胶原组织修复 材料。其中一面结构致密，具有良好的阻隔受损组织周边细胞的作用；另一面结构疏松，在 组织修复过程有利于缺损组织细胞在材料上的生长。该仿生型改性胶原组织修复材料的 组织相容性好、抗原性低、韧性好、易于操作，降解时间可调控，具有良好的引导组织再生能 力。
一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法，步骤如下(1)配制胶原的乙酸溶液，将胶原的乙酸溶液在_20°C -80°C下预冻24小时以上， 真空冷冻干燥得到胶原海绵；(2)将胶原海绵在100°C 160°C，真空下反应4 24小时，再在交联剂中浸泡4 24小时，洗涤后，-20°C -80°C下预冻24小时以上，冷冻干燥；压制成型，即得到仿生型改 性胶原组织修复材料的疏松层；(3)在疏松层表面涂覆胶原的乙酸溶液或含有交联剂的胶原的乙酸溶液，干燥后， 即在仿生型改性胶原组织修复材料的疏松层上形成致密层；(4)封装后灭菌，得到仿生型改性胶原组织修复材料。步骤(1)所述胶原的乙酸溶液配制好后还可以加入无机粉体。所述无机粉体为无机钙磷粉体、有羟基磷灰石、生物活性玻璃或磷酸三钙。所述无 机粉体与胶原干重的质量比为1 100 1 2。所述胶原的乙酸溶液中胶原的质量体积浓度为5. 0 7. Omg/ml。步骤(2)所述交联剂为1-乙基_3 (3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和N-羟基丁二 酰亚胺的水溶液，所述1-乙基_3 (3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺中与N-羟基丁二酰亚胺 的摩尔比为2. 5 1。步骤(2)所述交联剂为戊二醛溶液，其质量分数为0. 25%。所述胶原为从牛肌腱中提取的I型胶原。步骤⑷所述封装之前还可以再在100°C 120°C真空下反应24小时。步骤(3)所述交联剂为1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺和N-羟基丁 二酰亚胺的混合物，所述1-乙基_3 (3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)与N-羟基丁二 酰亚胺(NHS)的摩尔比为4 1 ；所述含有交联剂的胶原的乙酸溶液中胶原干重与1-乙 基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6 1。与国内外现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明制备了具有仿生型双层结构的胶原组织修复材料。(2)本发明采用涂覆、干燥工艺，保证了致密层的致密结构。(3)本发明的成型工艺简单有效，成本低，利于规模生产。
图1是仿生型改性胶原组织修复材料的断面扫描电镜图像(X 100)图2是仿生型改性胶原组织修复材料的致密面扫描电镜图像(X 1000)图3是仿生型改性胶原组织修复材料的疏松面扫描电镜图像(X 1000)
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步地说明，但本发明要求保护的范围并不局限于 提到的实施例表示的范围。本发明实施例I型胶原的制备方法采用专利号为200510057437. X具体实施方式
中记载的一种碱溶胀_酸酶解方法从从牛筋腱中提取I型胶原。实施例1
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具有仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法，步骤如下(1)将I型胶原以3%体积分数的乙酸溶液配制成7mg/ml的胶原-乙酸溶液；(2)将步骤(1)中的胶原-乙酸溶液浇铸于塑料模具中，-60°C预冻一天(24小 时)，_80°C真空冷冻干燥，得到55mmX 15mmX 12mm的胶原海绵；(3)将步骤(2)冻干的胶原海绵置于真空干燥箱，在120°C真空热交联反应24h，停 止加热后保持真空状态冷却至室温再取出样品；(4)热交联后的胶原海绵再在4°C的EDC和NHS的混合溶液中浸泡12小时，以促 进进一步的化学交联。此混合溶液中EDC的浓度为14mM，NHS的浓度为5. 6mM, EDC与NHS 的摩尔比为2. 5 1 ；化学交联后弃去EDC和NHS的混合溶液，去离子冲洗10遍，-60°C预 冻1天，-80°C真空冷冻干燥；(5)用IOMpa的压力将冻干的胶原海绵压制成膜，厚度约为0. 3mm即得仿生型改性 胶原组织修复材料的疏松层；(6)在步骤(5)的疏松层上涂覆预先加入EDC-NHS交联剂的胶原的乙酸溶液lml。 其中胶原干重与EDC质量比为6 1，EDC与NHS摩尔比为4 1 ；胶原的乙酸溶液的浓度为 6mg/ml, -80°C真空冷冻干燥，即在仿生型改性胶原组织修复材料的疏松层上形成致密层。(7)将形成致密层的材料置于真空干燥箱，再在110°C真空下反应24小时，将样品 干燥、裁剪、封装，Y -射线照射灭菌，即得仿生型改性胶原组织修复材料。实施例1制得的胶原膜如图1 3所示。图1是胶原膜的断面图，可以看出胶原膜 两层结构差异较大，疏松层空隙较大，利于细胞生长，致密层十分密实，可以阻隔细胞长入。 图2是胶原膜的致密面，表面平整光滑，结构密实。图3是胶原膜的疏松面，表面粗糙。本 发明的膜材料一面相对致密，可以有效阻隔缺损组织周边细胞优先长入组织受损区域；另 一面相对疏松，有利于生长相对较慢的受损组织细胞生长，最终达到修复受损组织的目的。实施例2具有仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法，步骤如下(1)将I型胶原以3 %的乙酸溶液配制成5mg/ml的胶原溶液；(2)将步骤(1)中的胶原-乙酸溶液浇铸于塑料模具中，在-60°C条件下预冻一 天，_80°C真空冷冻干燥48h，得到规格为55mmX 15mmX 15mm的胶原海绵；(3)将步骤(2)冻干的胶原海绵置于真空干燥箱，在100°C真空热交联反应24h。 停止加热后保持真空状态冷却至室温再取出样品；(4)热交联后的胶原海绵在4°C的EDC和NHS的混合溶液中浸泡12小时。其中EDC 的浓度为12mM，NHS的浓度为4. 8mM。交联后弃去EDC-NHS溶液，去离子冲洗10遍，-60°C 预冻1天，-80°C真空冷冻干燥。(5)用IOMpa的压力将干燥的胶原海绵压制成膜，厚度约为0. 5mm,即得仿生型改 性胶原组织修复材料的疏松层；(6)在步骤(5)的疏松层上均勻涂覆7mg/ml胶原的乙酸溶液1. 5ml，_80°C真空冷 冻干，即在仿生型改性胶原组织修复材料的疏松层上形成致密层；(7)将样品干燥、裁剪成所需形状，封装后用Y-射线照射灭菌。实施例3具有仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法，步骤如下
(1)将I型胶原以3%的乙酸溶液配制成6mg/ml的胶原-乙酸溶液，加入生物活 性玻璃粉体，其中生物活性玻璃与胶原的质量比为1 4;(2)将步骤(1)中的胶原-乙酸溶液浇铸于塑料模具中，-60°C预冻一天，-80°C真 空冷冻干燥，得到55mmX 15mmX 12mm的胶原海绵；(3)将步骤(2)冻干的胶原海绵置于真空干燥箱，在110°C真空热交联反应24h，停 止加热后保持真空状态冷却至室温再取出样品；(4)热交联后的胶原海绵再在4°C条件下0. 25% (质量分数)的戊二醛溶液浸泡 4小时。交联后弃去戊二醛溶液，去离子冲洗10遍左右，_60°C预冻1天，_80°C真空冷冻干 燥； (5)用IOMpa的压力将冻干的胶原海绵压制成膜，厚度约为0. 3mm,即得仿生型改 性胶原组织修复材料的疏松层；(6)在步骤(5)的疏松层上涂覆预先加入EDC-NHS交联剂的胶原的乙酸溶液lml。 其中胶原与EDC质量比为6 1，EDC与NHS摩尔比为4 1 ；胶原的乙酸溶液的浓度为6mg/ ml, _80°C真空冷冻干燥，即在仿生型改性胶原组织修复材料的疏松层上形成致密层；(7)将样品干燥、裁剪、封装，Y -射线照射灭菌，即得仿生型改性胶原组织修复材 料。
权利要求
一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制胶原的乙酸溶液，将胶原的乙酸溶液在 20℃～ 80℃下预冻24小时以上，真空冷冻干燥得到胶原海绵；(2)将胶原海绵在100℃～160℃，真空下反应4～24小时，再在交联剂中浸泡4～24小时，洗涤后， 20℃～ 80℃下预冻24小时以上，冷冻干燥；压制成型，即得到仿生型改性胶原组织修复材料的疏松层；(3)在疏松层表面涂覆胶原的乙酸溶液或含有交联剂的胶原的乙酸溶液，干燥后，即在仿生型改性胶原组织修复材料的疏松层上形成致密层；(4)封装后灭菌，得到仿生型改性胶原组织修复材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胶原的乙酸溶液配制好 后加入无机粉体。
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述无机粉体为无机钙磷粉体、有羟基磷 灰石、生物活性玻璃或磷酸三钙。所述无机粉体与胶原干重的质量比为1 100 1 2。
4.根据权利要求1或2的制备方法，其特征在于，所述胶原的乙酸溶液中胶原的质量体 积浓度为5. 0 7. Omg/ml。
5.根据权利要求1或2的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述交联剂为1-乙 基-3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液，所述1-乙基_3 (3- 二 甲基氨丙基)碳化二亚胺中与N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为2. 5 1。
6.根据权利要求1或2的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述交联剂为戊二醛溶液， 其质量分数为0.25%。
7.根据权利要求1或2的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述交联剂为1-乙 基-3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的混合物，所述1-乙基_3 (3- 二 甲基氨丙基)碳化二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为4 1;所述含有交联剂的胶原 的乙酸溶液中胶原干重与1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺的质量比为6 1。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述胶原为从牛肌腱中提取的I 型胶原。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述封装之前再在 100°C 120°C真空下反应24小时。
全文摘要
本发明公开了一种仿生型改性胶原组织修复材料的制备方法。本发明制备方法以I型胶原为原料，经过冻干、压制、涂覆、交联和干燥等工艺成型，具有仿生型结构，即致密层与疏松层结构梯度分布且无明显的界面层。本发明仿生型改性胶原组织修复材料无其他任何化学成分，生物相容性良好，可被生物体完全吸收。其中致密层起到屏障作用，可以有效地防止缺损组织周边的细胞长入组织受损区；而疏松层能引导缺损组织细胞的粘附、增殖，从而达到组织修复的目的。
文档编号C08L89/00GK101954126SQ201010293050
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者任力, 林绣丹, 王迎军, 田小俊 申请人:华南理工大学