专利名称：一种高活性生物多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及糖科学与糖工程领域，具体的说是一种高活性生物多糖的制备方法。
背景技术：
生物多糖(如真菌、植物、动物、微生物等)由于具有显著的抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗溃疡、抗炎症、抗病毒、对辐射损伤的保护作用等功能而成为现代生物药物和功能保健品的研究热点，并且在临床上也取得明显的疗效，显示了很好的应用效果和广阔的前景。关于生物多糖的制备条件，各种报道不一，传统工艺一般采用在乙醇终浓度为 70% 90%的情况下，经4°C沉淀过夜，4000 lOOOOr/min转速离心收集沉淀，真空冷冻干燥处理后获得多糖，但上述各种因素在不同条件下对制备的多糖产量与活性之间的相关性却鲜有研究报道。不同的乙醇浓度对于制备的多糖的产量和生物活性有多大的影响？乙醇沉淀多糖时的温度是否必须在4°C低温下进行？多糖是否必须经过冷冻干燥处理？它们对于多糖的产量和生物活性的影响是否显著？因为维持一个4°C过夜的低温沉淀条件和冷冻干燥的方式，都需要耗费大量的能源和时间，显然是不适合于产业化低成本快速制备多糖的工艺；而对于沉淀溶液的离心速度，合适最好，较高的离心速度不仅需要耗费更多的能源，仪器设备也更加昂贵，也更易于损坏，更有可能引入更多的杂质，另外，在酸性或碱性条件下，某些多糖因发生降解而难于获取；因此，选择合适的醇沉初始PH对提高多糖的产量和保持其生物活性尤为重要，基于以上几点，我们利用单因素实验和均勻设计的方法研究了上述各种因素在不同条件下对制备多糖的产量和生物活性的影响，获得了高产、低耗、快速、可大规模产业化制备高活性生物多糖的新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种步骤简单，高产、低耗、快速、可产业化的高活性生物多糖的制备方法。本发明解决上述技术问题采用的技术方案是一种高活性生物多糖的制备方法， 其包括如下步骤(1)首先，将含有多糖的提取液或发酵液的酸碱度调整为5. 3-8. 5之间；(2)向上述适宜酸碱度的多糖溶液中缓慢加入食用酒精至乙醇浓度为80-85%， 混合均勻；(3)将上述混合溶液置于12°C温度下，沉淀1-2小时；(4)醇沉结束后，置于离心机中，4500-6000r/min，离心20min，收集多糖沉淀；(5)将收集的多糖置于40°C温度下干燥，获得的干燥粉即为活性生物多糖。本发明方法与传统方法的显著不同在于(1)在80-85%的乙醇浓度和12°C的温度下放置1-2小时即可沉淀析出溶液中的多糖，无需在4°C的低温下放置过夜沉淀溶液中的多糖，避免了为长时间维持4°C低温所需要的大量能源的消耗和必需的设施；(2)醇沉时间仅需1-2小时，与传统方法的醇沉过夜相比，显著缩短了醇沉时间，从而可显著提高了生产效率；C3)多糖的干燥在40°C下进行，无需冷冻干燥，也显著降低了能量的消耗和昂贵设备的购置。本发明制备的活性生物多糖可作为抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂、 抗动脉粥样硬化、抗溃疡、抗炎症、抗病毒、抗辐射损伤等生物药物和功能保健品的有效成分。经过统计学分析，本发明制备的多糖的产量和抗肿瘤生物活性，与传统方法相比差异不显著，因此，本发明是一种适合于产业化、低耗、快速制备高活性的生物多糖的方法。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1 将热水法提取的蟹味菇菌丝体多糖水提液的酸碱度调整为5. 3后，向提取液中加入食用酒精使乙醇的终浓度为80%，然后在12°C温度下沉淀2小时，沉淀结束后，将混合溶液在6000转/分钟离心20分钟，收集多糖沉淀，将收集到的多糖沉淀置于40°C温度下完全干燥，即获得活性生物多糖。该条件下获得的多糖产量为10. 4克/升，与传统方法制备的多糖产量相当，差异均未达到显著水平。实施例2:将蟹味菇的发酵上清液的酸碱度调整为8. 5后，向上清液中加入食用酒精使乙醇的终浓度为85. 00%，然后在12°C温度下沉淀1小时，沉淀结束后，将混合溶液在4500转/ 分钟离心20分钟，收集多糖沉淀，将收集到的多糖沉淀置于40°C温度下完全干燥，即获得活性生物多糖。该条件下获得的多糖产量为9. 9克/升，用MTT法测定的多糖对人胃癌肿瘤细胞的抑制率为80. 2%，与传统方法制备的多糖产量相当，差异均未达到显著水平。上述实施例1和实施例2制备的多糖样品，以及传统方法制备的多糖样品，分别用PBS缓冲液溶解，10000转/分钟离心10分钟后，取上清液，测定多糖浓度，调整使多糖的浓度为10.0毫克/毫升，过滤除菌多糖溶液。以PBS为阴性对照，5-氟尿嘧啶(5-FU) 为阳性对照，采用MTT法检测多糖样品对人胃癌肿瘤细胞SGC-7901的抑制活性。肿瘤细胞的培养条件为在RPMI1640培养基中加10%的牛血清，终浓度为4. 766g/L的HEPES，100 微克/毫升的青霉素，链霉素，PH值为7. 2-7. 4，于37°C，5% CO2的细胞培养箱中培养， SCG7901在对数期时，用浓度为0. 25%的胰蛋白酶将其消化，血细胞计数板计数，稀释至浓度为50000-100000个/毫升，转入96孔板中，每孔100微升，每个实验组设5个平行组。在 25°C恒温培养箱中培养12- 小时，当细胞完全贴壁后，吸净培养基，PBS清洗一遍，加90微升含10%血清的1640培养基，10微升待测的多糖溶液(作用浓度为1. 0毫克/毫升)，阳性对照用5-FU(作用浓度为0. 1毫克/毫升)，阴性对照加10微升PBS。在25°C恒温培养箱中培养至第5天，倒掉培养基，用PBS清洗2遍，加100微升不含血清的1640培养基，20 微升MTT，25°C恒温培养箱中培养4h。倒掉培养基，每孔加150微升DMS0，振荡lOmin，在酶标仪下测OD570值，计算抑制率。上述实施例1和实施例2制备的多糖样品对肿瘤细胞的抑制率分别为81. 6%和80. 2%，与传统方法制备的多糖的抗肿瘤活性相当，差异均未达到显著水平。
权利要求
1. 一种高活性生物多糖的制备方法，其其特征在于包括如下步骤(1)首先，将含有多糖的提取液或发酵液的酸碱度调整为5.3-8. 5之间；(2)向上述适宜酸碱度的多糖溶液中缓慢加入食用酒精至乙醇浓度为80-85%，混合均勻；(3)将上述混合溶液置于12°C温度下，沉淀1-2小时；(4)醇沉结束后，置于离心机中，4500-6000r/min，离心20min，收集多糖沉淀；(5)将收集的多糖置于40°C温度下干燥，获得的干燥粉即为活性生物多糖。
全文摘要
本发明涉及一种高活性生物多糖的制备方法，其首先是将含有多糖的提取液或发酵液的酸碱度调整为5.3-8.5之间，加入食用酒精至浓度为80-85％，混匀后置于12℃下，沉淀1-2小时，醇沉结束后，于4500-6000转/分钟离心20分钟，收集多糖，将收集的多糖置于40℃下干燥，获得的干燥粉即为活性生物多糖，该多糖可作为抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗溃疡、抗炎症、抗病毒、抗辐射损伤等生物药物和功能保健品的有效成分。本发明制备的多糖的产量和抗肿瘤生物活性，与传统方法相比差异不显著，是一种适合于产业化、低耗、快速制备高活性的生物多糖的方法。
文档编号C08B37/00GK102399300SQ20111040371
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者张炳照, 曹立新, 朱国振, 闫培生 申请人:哈尔滨工业大学(威海)