专利名称：一种微图案化温敏壳聚糖膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及膜材料及技术，特别涉及一种细胞培养和脱附用的图案化温度敏感膜及其制备方法。
背景技术：
生物材料表面拓扑结构对细胞行为的影响是组织工程研究中的一个重要课题Stevens MM, George J H. Exploring and engineering the cell surface interface.Science，2005，310 (5751) : 1135-1138。研究表明，微/纳米尺度的拓扑结构与机体内细胞生长的自然环境极为相似，材料表面微观形态对于细胞的黏附、增殖、移动、分化都起着非常重要的作用Recknor J B, Sakaguchi D S, Mallapragada S K. Directed growthand selective differentiation of neuralprogenitor cells on micropatternedpolymer substrate. Biomaterials, 2006, 27 (22) :4098_4108。随着这一研究课题的持续·升温，关于微/纳米拓扑结构的构建方法更是得到快速发展，如国内如许海燕等采用高压静电纺丝技术构建了聚氨酯(PU)取向纳米纤维聚合物膜，研究了其引导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的作用韩昭昭，孔桦，许海燕等.取向纳米纤维聚合物膜引导内皮细胞生长的作用.高等学校化学学报，2008，29 (5) :1070 1073。路庆华等通过激光刻蚀技术，制备了柱状、三角形、矩形等沟槽结构，研究了不同基质表面形貌对细胞行为的影响朱邦尚，路庆华等.不同的基质表面形貌对细胞生长行为的影响.细胞生物学杂志，2003，25(4) :228-230。国外如Dalby等利用聚合物微相分离技术，制备了表面分布有纳米级岛结构的聚合物材料Dalby MJ, Riehle MO, Johnstone H, et al. In vitro reaction ofendothelial cells to polymerdemixed nanotopography. Biomaterials, 2002, 23(14)2945。Dusseiller MR等在聚苯乙烯膜表面通过表面摹拓方法，构建了 3D微结构，进行单细胞培养的研究Dusseiller MR, Schlaepfer D, Koch M, Kroschewski R, Textor Μ. Aninverted microcontact printing method on topographicallystructured polystyrenechips for arrayed micro-3—D culturing of single cells. Biomaterials2005,26 5917-5925。Curtis等通过电子刻蚀技术在聚乙酸内酯或聚甲基丙烯酸甲酯表面制备有序排列的直角或六边形的纳米点，检测该拓扑结构对人类纤维母细胞的影响Curtis AS，Gadegaard N,Dalby MJ,et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in theirsurroundings. IEEE Trans Nanobioscience, 2004, 3 (I) :61_66。这些方法都各有其优缺点，如激光刻蚀、电子刻蚀等方法需要超纯净以及昂贵设备，表面摹拓方法转移图形不精确等，因此需要开发简便易行，成本低廉的制备拓扑微结构的方法，本发明则提供一种操作简单，不需要特殊设备的制备微/纳米级球状突起微结构的方法。壳聚糖是甲壳素的脱乙酸化广物，是2_氨基_2_脱氧-13-D-匍萄糖单体以13(1-4)苷键连接的均聚物，在结构上与人体内存在的糖胺聚糖类似，具有优良的生物相容性和生物可降解性，是理想的细胞外基质材料，被广泛应用于生物医学、组织工程等领域。壳聚糖具有良好的成膜性，如Mi等通过干/湿相分离方法制备了非对称壳聚糖膜，作为一种新型伤口敷料，可以控释抗生素Fwu-Long Mi, Yu-Bey Wu, et al. Asymmetricchitosan membranes prepared by dry/wetphase separation a new type of wounddressing for controlled antibacterial release. Journal ofMembrane Science,2003,212(1/2) Tang RP等制备了双醛淀粉交联的壳聚糖膜，并研究了它的抗菌性Tang RP, DuYM, Fan LH. Dialdehyde starch-crosslinked chitosan films and theirantimicrobialeffects. Journal ofPolymer Science Part B, Polymer Physics, 2003,41 (9)。敷敏等制备了季铵化壳聚糖和聚苯乙烯共混膜，研究了膜的温度、pH响应性和力学强度敖敏，王吉林等.季铵化壳聚糖-聚苯乙烯共混膜的制备及表征.化工科技，2011，19(3)。本发明利用壳聚糖的成膜性，在其表面构建微/纳米级球状突起微结构，应用于细胞培养研究，为能使细胞在回收过程中功能不受损伤，将壳聚糖以温敏性物质聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)改性，制备微图案化壳聚糖温敏膜。PNIPAAm的化学结构中具有亲水部分和疏水部分，其水溶液的最低临界温度(Lower critical solution temperature, LCST)为32°C。当温度低于32°C时，PNIPAAm高分子链伸展，与水发生水合作用而溶于水；当温度高于32°C时，PNIPAAm高分子链收缩，进行脱水。当温度高于32°C时(常采用37°C，人的正常体温)，材料表面表
现疏水性，可以使各种细胞在其上吸附、铺展和分化，但当温度低于32°C时，PNIPAAm构型转变，表现亲水性。低温下，PNIPPAm的亲水性不利于细胞在材料表面的吸附，并且温度降低，PNIPAAm分子链有收缩状态变为伸展状态，削弱了细胞与材料之间的作用力，从而使细胞从材料表面自动脱附，避免了酶解法对细胞功能造成的损伤。Okano研究小组利用电子束辐照法将温敏性聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)接枝到组织培养用聚苯乙烯表面，利用温度改变调控细胞吸附/脱附，进行了一系列的研究工作Elloumi-Hannachi I，Yamato M，Okano T. Cell sheet engineering a unique nanotechnology for scaffold-free tissuereconstruction with clinical applications inregenerative medicine. Journal ofInternal Medicine, 2010, 267 :54_70，取得了有意义的实验结果。综上分析，本发明制备应用于细胞培养的微图案化壳聚糖温敏膜，通过微图案调控细胞行为，通过温度响应性，无损伤回收培养细胞，为构建具有特定结构和功能的组织或器官提供理论基础和实验依据。
发明内容
本发明拟解决的技术问题是提供一种微图案化智能膜，该膜一方面通过微纳米拓扑结构的建立，模拟细胞体内生长微环境；另一方面通过温敏性PNIPAAm的修饰，使本发明的微图案化智能膜的温度响应范围为25V _37°C，可实现细胞脱附智能化。本发明微纳米拓扑智能膜可由以下方法制得(I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡制成成膜液；将丙三醇和正丙醇或丙三醇和1，2-丙二醇和按一定体积比充分混合，静止脱泡成凝固浴；取成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. O X IO4,脱乙酰度为85 %的CS溶于I % HCl溶液中，待CS全部溶解后，加入EDC和TEMED，在搅拌均匀后，滴加AAc，磁力搅拌下反应，停止反应，将反应液过滤，去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按一定质量比溶于1%的HCl溶液中，再加入过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。本发明的目的也在于提供一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，制备方法包括以下步骤(I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡制成成膜 液；将丙三醇和正丙醇或丙三醇和1，2-丙二醇和按一定体积比充分混合，静止脱泡成凝固浴；取成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. O X 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于I % HCl溶液中，待CS全部溶解后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDOHCl)和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加丙烯酸(AAc)，磁力搅拌下反应，停止反应，将反应液过滤，去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按一定质量比溶于I %的HCl溶液中，再加入过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。所述步骤⑴中聚苯乙烯溶液浓度为O. I O. 5g/mL ；所述步骤(I)中丙三醇和正丙醇体积比为3 : I 10 : I ；所述步骤(I)中丙三醇和1，2_丙二醇体积比为3 : I 10 : I ；所述步骤⑵中壳聚糖溶液浓度为O. 05 O. lg/mL ；所述步骤⑵中加入丙烯酸量为10 20mL ；所述步骤(2)中CSA与NIPAAm质量比为I : I 5 : I所述步骤(2)中CSA与NIPAAm溶于I % HCl所得溶液的浓度为O. 05 O. lg/mL ；所述步骤(2)中反应时间为10 30h。有益效果本发明所设计的微图案化壳聚糖温敏膜具有良好的综合性能，PNIPAAm在水中的LCST为32°C，本发明所制备的微图案化壳聚糖温敏膜由于聚合了 NIPAAm，因此在32°C附近发生亲/疏水性的转变，当环境温度高于32°C时，膜表面表现较强疏水性，有利于细胞的吸附与增殖；当环境温度低于32°C时，膜表面表现较强亲水性，有利于细胞的自动脱附，从而实现细胞脱附智能化。另一方面，通过膜表面微图案的构建，可以模拟细胞体内生长微环境，使细胞保持正确的接触方式，为细胞提供特殊的生长和分化信号，使细胞能表达正确的基因并进行分化，从而形成具有特定功能的新生组织；可以从分子和细胞水平调控生物材料与细胞间的相互作用，从而引发特异性细胞反应，对于组织再生与修复存在潜在的应用前景，可促进组织工程向第三代生物材料——细胞和基因活化仿生材料的发展。由于所述的良好综合特性，本发明微图案化壳聚糖在组织工程支架材料、细胞培养基质材料等方面可以得到广泛应用。本发明所述制备方法工艺方法简单，反应易于控制，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低，操作快捷，适用范围广、安全，便于工业化实施。
具体实施例方式以下给出本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。实施例I :(I)微图案化聚苯乙烯模板的制备·室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. lg/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和正丙醇按体积比为3 I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应30h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为I : 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应10h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例2 (I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. 3g/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和正丙醇按体积比为5 I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加IOmL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应20h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为3 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应15h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例3
(I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. lg/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和正丙醇按体积比为10 I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应15h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为3 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应15h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例4 (I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. lg/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和正丙醇按体积比为10 O充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加20mL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应30h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水 水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为5 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应20h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例5 (I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. lg/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和I，2-丙二醇按体积比为3 I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应30h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为I : 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应10h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例6 (I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. 3g/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和I，2-丙二醇按体积比为5 I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备
室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加IOmL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应20h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤 出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为3 1，溶于1%的HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应15h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例7 (I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. lg/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和I，2-丙二醇按体积比为10 I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. 05g/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC ·HCl和lml2%N，N，f ,Ni _四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加15mL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应15h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后,将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为3 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液浓度为0.05g/mL，再加入0.02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应15h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。实施例8 (I)微图案化聚苯乙烯模板的制备室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. lg/mL静置过夜，置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液；将丙三醇和1，2_丙二醇按体积比为10 O充分混合，静止5h脱泡成凝固浴；取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板。
(2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加20mL丙烯酸(AAc),磁力搅拌下反应30h,停止反应,将反应液过滤,去掉反应液中未溶解的杂质；搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出；将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末；将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为5 I，溶于I %的HCl溶液中，溶液浓度为O. lg/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应20h，得到粘稠的溶液；将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量·分数为10% NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。
权利要求
1.一种微图案化壳聚糖温敏膜，其特征在于所述微图案化壳聚糖温敏膜温度响应范围为25V 37°C，表面具有微米级球状突起微结构，所述微图案化壳聚糖温敏膜可由下述方法制得 (1)微图案化聚苯乙烯模板的制备 室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. I O. 5g/mL静置过夜,置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液，将丙三醇和正丙醇按体积比为3 : I 10 : I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴，取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板； (2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备 室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. 05 O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加10 20mL丙烯酸(AAc)，磁力搅拌下反应10 30h，停止反应，将反应液过滤，去掉反应液中未溶解的杂质，搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出，将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末，将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为I : I 5 : 1，溶于I %的HCl溶液中，溶液浓度为O. 05 O. lg/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应10 30h，得到粘稠的溶液，将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10%NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。
2.根据权利要求I所述的微图案化壳聚糖温敏膜，其特征在于响应温度为25V 37 V，表面具有微米级球状突起微结构。
3.一种微图案化壳聚糖温敏膜的制备方法，包括以下步骤 (1)微图案化聚苯乙烯模板的制备 室温下，将聚苯乙烯溶于四氢呋喃，溶液浓度为O. I O. 5g/mL静置过夜,置于培养皿中，真空脱泡5h制成成膜液，将丙三醇和正丙醇按体积比为3 : I 10 : I充分混合，静止5h脱泡成凝固浴，取2mL成膜液快速滴于凝固浴表面，室温下静置成膜，得微图案化聚苯乙烯模板； (2)微图案化壳聚糖温敏膜的制备 室温下，将分子量为5. OX 104，脱乙酰度为85%的壳聚糖(CS)溶于1% HCl溶液中，溶液浓度为O. 05 O. lg/mL,待CS全部溶解后，加入O. 5gl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)和lml2% N, N, N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，在搅拌均匀后，滴加10 20mL丙烯酸(AAc)，磁力搅拌下反应10 30h，停止反应，将反应液过滤，去掉反应液中未溶解的杂质，搅拌下在过滤后的反应液中加入氢氧化钠(NaOH)，中和反应液中残留的AAc以及溶液中的HC1，反应液逐渐由酸性转为中性或碱性，此时乙烯基壳聚糖单体(CSA)也逐渐析出，将析出的CSA重新过滤，以蒸馏水水洗三遍，当过滤液呈中性时用无水乙醇洗涤CSA，以溶解AAc自聚产生的自聚物，无水乙醇洗两遍后，将过滤出的CSA抽真空干燥，得CSA单体粉末，将CSA和异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)按质量比为I : I 5 1，溶于I %的HCl溶液中，溶液浓度为O. 05 O. lg/mL，再加入O. 02g过硫酸胺(APS)作引发剂，充分溶解后充氮气30min，迅速加入适量的TEMED作促进剂，密封，室温下反应10 30h，得到粘稠的溶液，将溶液倾倒于已经制备好的微图案化聚苯乙烯模板上，放入质量分数为10%NaOH中浸泡，蒸馏水冲洗至中性，再以THF溶解聚苯乙烯模板，得微图案化温敏壳聚糖膜。
4.根据权利要求1，3所述一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，其特征在于所述步骤(I)中聚苯乙烯溶液浓度为O. I O. 5g/mL。
5.根据权利要求1，3所述一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，其特征在于所述步骤(I)中丙三醇和正丙醇体积比为3 I 10 : I。
6.根据权利要求1，3所述一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，其特征在于所述步骤(1)中丙三醇和I,2-丙二醇体积比为3 : I 10 : I。
7.根据权利要求1，3所述一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，其特征在于所述步骤(2)中壳聚糖溶液浓度为O.05 O. lg/mL。
8.根据权利要求1，3所述一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，其特征在于所述步骤(2)中CSA与NIPAAm质量比为I : I 5 : I。
9.根据权利要求1，3所述一种微图案化壳聚糖温敏膜制备方法，其特征在于所述步骤(2)中CSA与NIPAAm溶于1% HCl所得溶液的浓度为O. 05 O. lg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种微图案化壳聚糖温敏膜及其制备方法，属于膜材料及技术领域，特别涉及一种细胞培养和脱附用的图案化温度敏感膜及其制备方法，该膜温度响应范围为25℃-37℃，可由下述方法制得将聚苯乙烯溶于四氢呋喃得成膜液，丙三醇和正丙醇或丙三醇和1，2-丙二醇按一定体积比充分混合，得凝固浴，取成膜液快速滴于凝固浴表面，得微图案化聚苯乙烯模板；将壳聚糖与异丙基丙烯酰胺反应所得聚合物溶液流延于微图案化聚苯乙烯模板表面，以四氢呋喃溶解聚苯乙烯模板，得到微图案化壳聚糖温敏膜。本发明所述制备方法工艺方法简单，反应易于控制，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低，操作快捷，适用范围广、安全，便于工业化实施。
文档编号C08L51/02GK102942705SQ20121053283
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者贺晓凌, 陈碧洲, 林凯旋, 葛莉莉, 邓中显, 陈莉 申请人:天津工业大学