茶多糖衍生物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种茶多糖衍生物的制备方法，该方法以具有降血糖活性的茶多糖为原料，通过室温下化学偶联反应合成出含有叔胺基团的茶多糖衍生物。本发明反应条件温和，避免使用强酸溶剂，较大程度上避免了茶多糖的降解，有利于保持茶多糖的生物活性。本发明的工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价。本发明制备出的含有叔胺基团的茶多糖衍生物，可望用作一种基因载体，用于在肝细胞转染胰岛素基因，进一步提高降血糖性能，因而在治疗糖尿病方面具有一定的应用前景。
【专利说明】茶多糖衍生物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然多糖化学改性领域，具体涉及一种茶多糖衍生物及其制备方法。【背景技术】
[0002]多糖来源于自然界，不仅安全无毒，而且具有很好的生物相容性和降解性。通过化学反应，可合成出一些含胺类基团的多糖衍生物(如壳聚糖衍生物)作为基因载体，它们能高效安全地将基因导入细胞，起到治疗疾病的作用(Lu B., et al.Journal ofControlled Release 2009.137, 54 - 62)。
[0003]大量研究表明，茶多糖具有明显的降血糖等生物活性(汪东风等，中草药，1995，26(5)，255-257 ;徐仲溪等，茶叶科学.2004，24(2)，75-81 ;傅海平等，茶叶通讯.2006，33(2)，24-28)。发明人曾经从粗老茶中分离提取具有降血糖活性的茶多糖(YangL.et al.Biomacromolecules 2010, 11, 3395-3405),经研究证实，该茶多糖与上述文献报道的茶多糖结构相似，是一种含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、核糖、木糖和甘露糖等糖单元的酸性杂多糖，它以(I — 4)和(I — 3)糖苷键连接的半乳糖和阿拉伯糖为主链，端基主要为葡萄糖单元，其它糖单元主要存在于支链中，茶多糖的重均分子量约为IO5 -1O6 g/mol。然而，目前文献中尚未见到有关制备茶多糖衍生物及其制备方法的报道。
[0004]最近研究发现(SamsonS.L., et al.TRENDS in Endocrinology andMetabolism 2006, 17，92 - 100)，通过基因转染技术可以诱导肝细胞产生胰岛素并调节胰岛素的释放，从而降低血糖。因此，基因治疗法正逐渐成为一种治疗糖尿病的新方法，其技术关键是通过基因载体，将外源基因高效地导入细胞。上述茶多糖结构报道的文献显示，茶多糖含有半乳糖基团肝细胞靶向因子，它能被肝细胞膜上ASGPR (Asialoglycoproteinreceptor,去唾液酸糖蛋白受体白)受体识别(Wu D, et al.Biomaterials 2009, 30,1363 - 1371)。所以，如果能通过化学反应，制备出含叔胺基团的茶多糖衍生物作为一种基因载体，用于在肝细胞转染胰岛素基因，将有利于进一步提高降血糖性能。
[0005]目前对于天然多糖的叔胺阳离子化改性，尽管文献中已有通过％羰基二咪唑(CDI)活化法合成出含叔胺基团的支链淀粉和糖原衍生物的报道，但是，由于多糖来源于自然界，各种多糖的化学结构(包括糖单元结构、糖苷键结构、糖链的序列组成、支化结构等)、分子量、物理化学性质以及生物活性相差甚远，使得该合成法在实际应用过程中也存在较大差别。
[0006]支链淀粉和糖原的化学结构较为类似，均为葡萄糖单元通过α-(1 —4)和α-(1 —6)糖苷键连接的超支化多糖，支链淀粉和糖原的重均分子量分别为IO6 -1O8 g/mol和IO6 -1O7 g/mol，它们不具备特殊的生物活性。然而，茶多糖与支链淀粉和糖原相比，不仅化学结构复杂、分子量小，而且还具有特殊的降血糖活性，热稳定性较差，对酸碱敏感(过酸或偏碱的环境均会使茶多糖发生降解)；此外，由于茶多糖含有羧酸基团，导致其不能溶于绝大部分有机溶剂。因此，不能像支链淀粉和糖原那样直接在有机溶剂中通过CDI法偶联叔胺基团。由此看来，如何实现既能保持茶多糖的生物活性又能对其进行化学改性 用作基因转染载体，是一个较大的难题。在现有技术中，尚未见有相关含有叔胺基团的茶多 糖衍生物制备方法的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种含有叔胺基团的茶多糖衍 生物的制备方法。本发明的制备方法能在避免茶多糖降解的前提下偶联叔胺基团，制备得 到含有叔胺基团的茶多糖衍生物。
[0008]本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：一种含有叔胺基团的茶多糖衍生 物的制备方法，具体包括如下步骤：
S1.称取0.1?1克茶多糖，置于10?100毫升pH4?7的缓冲溶液中，于室温溶解；
S2.称取0.5?5克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC)，置于 1?10毫升pH4?7的缓冲溶液中，于室温搅拌5?30分钟溶解；
S3.将步骤S2得到的混合液滴加到步骤S1得到的混合液，于室温反应1?24小时， 将反应液用蒸馏水透析，干燥后得到中间产物，命名为NACU-TPS ；
S4.称取0.1?1克步骤S3得到的中间产物NA⑶-TPS，溶于5?50毫升的无水二甲 亚讽中，于室温溶解；
S5.称取0.1?10克⑶I，置于1?10毫升的无水二甲亚砜中，于室温搅拌1?10小 时溶解；
S6.将步骤S5得到的混合液以及0.1?10毫升3- 二甲胺基丙胺（DMAPA)分别滴加 到步骤S4得到的混合液，在惰性气体保护下，于室温反应1?24小时后，用酸溶液调节反 应体系的pH值至中性，然后将反应液用蒸馏水透析，干燥后得到终产物一含有叔胺基团的 茶多糖衍生物，命名为DMAPA-NACU-TPS。
[0009]本发明所述茶多糖原料参照现有技术方法分离提取所得，如可参照文献：（1)徐 仲溪，王坤波.茶多糖化学及生物活性的研究.茶叶科学.2004，24(2)，75-81 ；(2) 傅海平，黄怀生，胡孟阳，李志刚.茶多糖生物活性及提取纯化的研究进展.茶叶通讯. 2006，33(2)，24-28 ;(3) Yang L, Fu S, Zhu X，Zhang L, Yang Y, Yang X，Liu H. Hyperbranched acidic polysaccharide from green tea. Biomacromolecules 2010, 11， 3395-3405。
[0010]本发明采用缓冲溶液（pH4_7)溶解茶多糖，其作用在于促使茶多糖中的羧酸离子 基团（_C00_)通过质子化作用转变为羧酸基团（-C00H)，进而与EDC发生化学反应。可以 选择本领域常用的缓冲溶液（PH4-7)，作为一种优选方案，步骤S1或S2中所述缓冲溶液 (PH4-7)为乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4. 0)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4. 4)、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（PH5. 3)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH5. 8)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（PH6. 2)或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（pH6. 8)等。
[0011]由于CDI对水敏感，易吸水分解，因而CDI的反应必须控制在无水条件下进行，所 用到的原料和溶剂均需充分除水干燥。作为一种优选方案，步骤S4或S5中所述无水二甲 亚砜的制备方法为：在50?500毫升二甲亚砜中加入0. 1?20克氢化钙，室温搅拌1?7 天，静置1?7天，过滤，在滤液中加入分子筛，浸泡1?7天。在无水二甲亚砜中加入分子筛的作用持续吸除二甲基亚砜中水分，保证其干燥无水，作为一种优选方案，所述分子筛的型号为3~5A。
[0012]为了使茶多糖充分溶解，提高茶多糖偶联反应的程度，茶多糖在溶液中需溶解一定时间才能使得茶多糖链段充分伸展，作为一种优选方案，步骤SI或S4中所述室温溶解为室温搅拌I~24小时溶解。
[0013]优选地，步骤S3或S6中所述干燥为冷冻干燥，使得茶多糖衍生物在低温下完成干燥，保证其活性不会发生变化。
[0014]本发明在透析前通过酸溶液中和反应液的目的在于，为了避免未反应的DMAPA原料以及副产物咪唑对茶多糖衍生物的降解。所述酸溶液可以选择本领域常用的酸，作为一种优选方案，步骤S6中所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸、磺酸、乙酸或草酸等。
[0015]本发明透析的目的在于除去溶剂及未反应的原料，采用常规的纯水透析即可，作为一种优选方案，步骤S3或S6中所述透析选用截流分子量为500~50，000的透析袋，保证除去小分子杂质的同时不会将茶多糖衍生物透析出来，透析时间为I~5天。
[0016]本发明制备方法在惰性气体保护下进行，确保反应体系处于无水、无氧状态，避免CDI活性下降以及茶多糖被氧化，作为一种优选方案，所述惰性气体为氮气、氦气或氩气。
[0017]本发明所述室温的温度为15~38°C。
[0018]一种含有叔胺基团的茶多糖衍生物，参照本发明制备方法制得。
[0019]本发明所述制备方法的合成反应机理和工艺流程图如图1和图2所示。与合成支链淀粉和糖原衍生物的CDI法相比，含有叔胺基团茶多糖衍生物的合成方法具有以下特
占-
^ \\\.(I)茶多糖(TPS)中羧酸基团与EDC反应，得到含有叔胺基团的中间产物(NACT-TPS)。该合成法的特点是，反应条件温和(室温，溶剂为PH 4-7的缓冲溶液)，有利于较大程度上避免茶多糖的降解。此外，NA⑶-TPS中间产物能溶于二甲亚砜，有利于进一步通过⑶I法合成含叔胺基团的茶多糖衍生物终产物(DMAPA-NACU-TPS)。
[0020](2) NA⑶-TPS中间产物在二甲亚砜溶剂中与DMAPA于室温反应，得到DMAPA-NACU-TPS终产物。为了避免未反应的DMAPA原料以及副产物咪唑对茶多糖衍生物的降解，在终产物对水透析纯化前用稀酸将其PH值调至中性。这区别于文献中通过CDI法合成其它多糖衍生物的纯化方法。
[0021]本发明具有如下有益效果:
(I)本发明的化学合成反应均在室温下进行，避免使用强酸溶剂，较大程度上避免了茶多糖的降解，这些温和的反应条件有利于保持茶多糖的生物活性。
[0022](2)本发明的工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价。
[0023](3)本发明制备出的含有叔胺基团的茶多糖衍生物，可望用作一种基因载体，用于在肝细胞转染胰岛素基因，进一步提高降血糖性能，因而在治疗糖尿病方面具有一定的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明制备方法的反应机理图；` 图2为本发明制备方法的工艺流程图；图3为本发明茶多糖原料及产物的红外光谱图(FTIR)；
图4为本发明茶多糖原料及产物的核磁谱图(1H NMR)；
其中，a为茶多糖(TPS)，b为中间产物(NACU-TPS)，c为含叔胺基团的茶多糖衍生物(DMAPA-NACU-TPS)。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0026]实施例1
(I)称取0.5克茶多糖，置于60毫升的乙酸-乙酸钠缓冲液(PH4.0)中，于20°C搅拌20小时溶解。
[0027](2)称取5克EDC，置于8毫升乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，于20°C搅拌8分
钟溶解。
[0028](3)将步骤(2)得到的混合液滴加到步骤(1)得到的混合液，于20 V反应10小时，将反应液装入透析袋中(截流分子量1，000)，对蒸馏水透析3天，冷冻干燥后得到中间产物，命名为NACU-TPS，通过红外光谱和核磁共振波谱实验进行结构分析，计算出取代度为
0.3。
[0029](4)称取0.3克步骤(3)得到的中间产物NA⑶-TPS，溶于30毫升的无水二甲亚砜中，于20°C搅拌24小时溶解。
[0030](5)称取0.1克⑶I，置于I毫升的无水二甲亚砜中，于20°C搅拌2小时溶解。
[0031](6)将步骤(5)得到的混合液以及5毫升DMAPA分别滴加到步骤(4)得到的混合液，在氮气体保护下，于20°C反应24小时后，用0.5 mol/L硫酸调节反应体系的pH值至中性，然后将反应液装入透析袋中(截流分子量500)，对蒸馏水透析5天，冷冻干燥后得到终产物一含有叔胺基团的茶多糖衍生物。
[0032]将所得茶多糖原料和各产物进行红外光谱法表征，所得FTIR谱图如图3所示。从图3可以看出:与茶多糖的FTIR谱图对比，NACU-TPS的FTIR谱图在2745cm-1附近出现了 -N-(CH3)2伸缩振动吸收峰，2519 CnT1出现了质子化叔胺的特征吸收峰，1541CHT1出现了N-H变角振动吸收峰，证明N-酰脲基团已偶联到TPS主链。此外，与NA⑶-TPS的FTIR谱图对比，DMAPA-NA⑶-TPS的FTIR谱图在1708(^1附近出现了氨基甲酸酯基团的特征吸收峰，1549 CnT1处的N-H变角振动吸收峰增强，1263cm^出现了 C-N伸缩振动吸收峰，证明DMAPA基团已偶联到茶多糖主链。
[0033]将所得茶多糖原料和各产物进行核磁共振波谱法表征，所得1H NMR谱图如图4所示。茶多糖的糖单元质子峰归属如下:异头氢(Hl)的质子峰出现在5.3-4.8ppm, H2-H6的质子峰出现4.5-3.lppm。与茶多糖的1H NMR谱图对比，NA⑶-TPS的1H NMR谱图出现了以下新峰:3.0 ppm (a)、2.7 ppm (b, C)、1.9 ppm (d)和 1.0 ppm (e)(归属见图 4b),证明已合成出目标产物NACU-TPS ;此外，与茶多糖的1H NMR谱图对比，DMAPA-NACU-TPS的1H NMR谱图出现了以下新峰:3.0 ppm (a)、2.7 ppm (b)、2.4 ppm (c)、1.7 ppm (d)和 1.1 ppm(e)(归属见图4c)，证明合成出DMAPA-NA⑶-TPS衍生物。通过核磁共振波谱的质子积分法，可计算出NA⑶-TPS和DMAPA-NA⑶-TPS的取代度(即每个糖单元中偶联的配体基团数目)。a -Glc: α -匍萄糖；α -GalpA: α -半乳糖醒酸；α -Galp: α -半乳糖。
[0034]NA⑶-TPS和DMAPA-NA⑶-TPS的取代度可按以下方法进行计算:分别对茶多糖衍生物NA⑶-TPS或DMAPA-NA⑶-TPS中异头Hl (5.3-4.8ppm)共振峰和多胺基团中甲基质子He、亚甲基质子Hb的共振峰(b和c峰)进行积分，根据公式(I)计算多胺基团在茶多糖分子中的取代度:
【权利要求】
1.一种含有叔胺基团的茶多糖衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤: S1.称取0.1~I克茶多糖，置于10~100毫升ΡΗ4~7的缓冲溶液中，于室温溶解； S2.称取0.5~5克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置于I~10毫升pH4~7的缓冲溶液中，于室温搅拌5~30分钟溶解； S3.将步骤S2得到的混合液滴加到步骤SI得到的混合液，于室温反应I~24小时，将反应液用蒸馏水透析，干燥后得到中间产物，命名为NACU-TPS ； S4.称取0.1~I克步骤S3得到的中间产物NA⑶-TPS，溶于5~50毫升的无水二甲亚讽中，于室温溶解； S5.称取0.1~10克％ 羰基二咪唑，置于I~10毫升的无水二甲亚砜中，于室温搅拌I~10小时溶解； S6.将步骤S5得到的混合液以及0.1~10毫升3- 二甲胺基丙胺分别滴加到步骤S4得到的混合液，在惰性气体保护下，于室温反应I~24小时后，用酸溶液调节反应体系的pH值至中性，然后将反应液用蒸馏水透析，干燥后得到终产物一含有叔胺基团的茶多糖衍生物,命名为 DMAPA-NACU-TPS。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3或S6中所述干燥为冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S4或S5中所述无水二甲亚砜的制备方法为:在50~500毫升二甲亚砜中加入0.1~20克氢化钙，室温搅拌I~7天，静置I~7天，过滤，在滤 液中加入分子筛，浸泡I~7天。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤SI或S4中所述室温溶解为室温搅拌I~24小时溶解。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3或S6中所述透析选用截流分子量为500~50，000的透析袋，透析时间为I~5天。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤SI或S2中所述缓冲溶液中为乙酸-乙酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S6中所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸、磺酸、乙酸或草酸。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述惰性气体为氮气、氦气或氩气。
9.根据权利要求1-8任一项所述制备方法，其特征在于，所述室温的温度为15~.38。。。
10.一种含有叔胺基团的茶多糖衍生物，其特征在于，根据权利要求1-9任一项所述制备方法制得。
【文档编号】C08B37/00GK103613681SQ201310662617
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】杨立群, 伍淑韵, 梁玄, 邹珊珊, 潘靖雯, 吴燕琳, 张黎明 申请人:中山大学