一种壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种壳聚糖微球复合丝素硫酸钙骨水泥及其制备方法。本发明公开的可注射复合型骨水泥由壳聚糖微球和硫酸钙组成的混合粉末与丝素溶液以1∶0.45的固液比g／ml配制而成，混合粉末中壳聚糖微球含量是0.1％w／w-1％w／w，硫酸钙含量是99％w／w-99.9％w／w。首先利用乳化-化学交联法制备壳聚糖微球，从家蚕蚕丝中提取丝素纤维进一步制成丝素溶液，然后将壳聚糖微球与硫酸钙粉末混合，混合粉末再按照一定量的固液比与丝素溶液混合。本发明的骨水泥复合材料的优点在于不仅可被经皮微创注射至骨缺损部位修复骨缺损，且可在体内被降解吸收，可被用作药物缓释系统进行药物或生长因子释放较长时间作用于填充部位。
【专利说明】一种壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种医用填充材料及其制备方法。具体而言，本发明涉及一种可注射 含有壳聚糖微球和丝素蛋白的硫酸钙骨水泥复合材料及其制备方法。本发明的骨水泥复合 材料不仅可作为填充材料微创注射至填充修复骨缺损且可作为药物缓释系统用于术后的 药物治疗。
【背景技术】
[0002] 随着人口老龄化的加快，椎体压缩性骨折的发生率也随之增多，椎体压缩性骨折 的治疗也不断涌现出新的手术方法，如椎体成形术和椎体后凸成形术[毛海清等，中国组 织工程研究，2013,12 :2108-2115]，对于脊柱外科学材料的要求也越来越高。为了提升 患者的生存质量，必须不断寻找具有良好生物相容性并且能提供足够支撑强度的生物材 料。目前临床上用于填充后凸成形扩张后椎体骨缺损的骨水泥多为聚甲基丙烯酸甲酯 (Polymethyl Methacrylate, PMMA)，在其提供足够支撑强度和粘固作用等优点的同时也存 在一些明显的缺点，如PMM在体内不能被降解吸收，生物相容性差，无生物活性，聚合时释 放大量的热，未聚合单体的毒性等。这些缺点导致了 PMM在临床应用时常常会发生一些严 重的并发症。
[0003] 硫酸钙骨水泥（Calcium Sulfate Cement，CSC)作为一种具有良好的生物相容 性的骨替代材料，可在注入时可随意塑形，固化后留下大量微孔，研究认为[Sidqui M.，et al.，Biomaterials，1995,16 (17) :1327-1332]，CSC在无骨膜存在的条件下不能刺激骨生 成，而在骨膜存在的条件下，硫酸钙降解形成的局部微酸环境及局部高浓度的钙离子有利 于血管和成骨细胞的长入，促进成骨细胞的增殖、分化，调节类骨质的形成，同时阻止纤维 组织的长入，进而发挥其骨诱导和传导的功能[Lazary M.，et al.，Biomaterial, 2007， 28(3) :393-399 ；Chattopadhyay N. , et al. , Biochem Pharmacol,2007,74(3) :438-447]〇 但硫酸钙存在一定的不足，如脆性大、强度较低、固化时间过快[白明等，中国组织工程研 究与临床康复，2011,16:2937-2940]。丝素蛋白（Silk Fibroin，SF)结构与骨骼胶原相 似，无明显抗原性，植入骨骼中不发生明显的排异反应，具有良好的生物相容性，并且有利 于钙盐的沉积[Wang G·，et al·，J Bone Joint Surg Br, 2010,92 (2) :320-325]。壳聚 糖（Chitosan，CTS)具有生物可降解性、生物相容性，是自然界不可多得的天然高分子载 体材料[Wang AH.，et al.，J Microencapsul，2009, 26 (7) :593-602] ;Subramanian A.， et al·，Biomedical sciences instrumentation，2004,40:117_122]。使用壳聚糖微球 (Chitosan Microspheres，CM)包封药物，具有控制药物释放、延长药物疗效的作用[Wang QZ. , et al. ,J Mater Sci Mater Med,2008,19(3) :1371-1377] ；Zhang Y. ,et al.,Biochem Biophys Res Commun, 2006, 344 (I) :362-369],从而提高药物的稳定性，降低药物的毒副作 用[Grenha A.，et al. ,Eur J Pharm Biopharm，2008,69(l) :83-93]，同时其自身具有抗炎 作用。目前，利用壳聚糖制备化疗药物、胰岛素、抗生素等药物的缓释、控释制剂及血脂吸附 微球已取得较好效果，部分已应用于临床[郭保林等，胶体与聚合物，2006,02 :30-33 ;刘利 萍等，中国药学杂志，2003,10 :46-49 ;Ozbas-Turan S et al·，J Pharm Sci，2002,91(5): 1245-1251 ;Shu ΧΖ·，et al.，J Microencapsul，2001，18(2) :237-245]。本发明在硫酸钙 骨水泥的基础上进一步优化配方，添加丝素蛋白和壳聚糖微球，使骨水泥能提供支撑作用 的同时缓慢释放药物，且可实现微创经皮注入填充修复和术后药物治疗的双重目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥。
[0005] 本发明公开的复合型骨水泥由壳聚糖微球和硫酸钙组成的混合粉末与丝素溶液 以1 : 0. 45的固液比g / ml配制而成，混合粉末中壳聚糖微球含量是0. 1 % W / W-I % w / w，硫酸|丐含量是 99%w / w-99.9%w / w。
[0006] 优选地，上述混合粉末中壳聚糖微球含量是0. 1% w / w-0. 5% w / w，硫酸I丐含 量是99. 5% w / w-99. 9% w / w ;更优选地，上述混合粉末中壳聚糖微球含量是0. 5% w / w，硫酸興含量是99. 5% w / w。
[0007] 优选地，丝素溶液浓度为3 % W / V-9 % W / V ;更优选地，丝素溶液浓度为6 % W / Vo
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥的制备方 法，具体步骤如下：
[0009] (1)制备壳聚糖微球；
[0010] (2)从蚕丝中提取丝素，制成所述丝素溶液；
[0011] (3)将步骤（1)制备的所述壳聚糖微球与硫酸钙粉末混合，所得混合粉末中含有 0· 1 % w / w壳聚糖微球及99 % w /w-99. 9 % w / w硫酸I丐，然后按照1 : 0.45 的固液比g/ml加入步骤（2)中制备的丝素溶液，调制均匀；
[0012] (4)将步骤（3)制备的混合物填注于柱形模具内，放置在烘箱中养护。
[0013] 壳聚糖微球的制备方法包括乳化-化学交联法、喷雾干燥法、离子交联法、沉淀/ 凝聚法。
[0014] 本发明的壳聚糖微球采用乳化-化学交联法制备。
[0015] 采用乳化-化学交联法制备壳聚糖微球的具体步骤如下：先将壳聚糖粉末溶于乙 酸溶液中，制成壳聚糖溶液，在烧瓶中分别加入油相液体石蜡乳化剂Span-80,搅拌同时逐 滴加入已溶解壳聚糖溶液，室温搅拌。缓慢加入三聚磷酸钠（TPP)水溶液，继续搅拌。将混 合溶液离心，所得沉淀物用石油醚、酒精和双蒸水各洗涤三遍，室温干燥后产物研磨成均匀 的粉末，即可得壳聚糖微球。
[0016] 根据本发明的具体实施方案，壳聚糖微球的制备过程如下：先将150mg壳聚糖粉 末溶于10ml2%v / V乙酸溶液中，制成1.5%w / V壳聚糖溶液，在250ml烧瓶中分别加 入油相液体石錯eOmlU^v / V乳化剂Span-80,在2000r / min搅拌的同时逐滴加入已 溶解的I. 5% w / V壳聚糖溶液10ml，室温搅拌2h。缓慢加入20g/L的三聚磷酸钠（TPP) 水溶液50ml，继续搅拌12h。将混合溶液1500r / min离心5min，所得沉淀物用石油醚、酒 精和双蒸水各洗涤三遍，室温干燥后产物研磨成均匀的粉末，即可得壳聚糖微球。
[0017] 丝素溶液制备方法如下：将蚕丝放入碳酸钠溶液中一定时间后取出，先用温水搓 洗，再用去离子水搓洗以脱胶，放入烘箱中烘干即得到脱胶的丝素纤维。将丝素纤维放入溴 化锂溶液中，恒温磁力搅拌，即得到棕黄色的丝素-溴化锂混合液。将丝素-溴化锂混合液 倒入清洁的透析袋中，透析三天，反复换水，经过滤获得去盐丝素溶液。再将去盐丝素溶液 装入透析袋中放入高浓度的聚乙烯醇（PEG)溶液中浓缩，将所得的浓缩液装入离心管中， 离心，上清液即为丝素溶液的储液。将丝素溶液的储液稀释成不同浓度用于后续实验。
[0018] 根据本发明的具体实施方案，丝素溶液制备过程如下：将5g蚕丝放入2L含有 100°C、0.02mol / L的碳酸钠溶液中，30min后取出，用温水搓洗5遍，再用去离子水搓洗2 遍以脱胶，放入45°C-55°C烘箱中烘干即得到脱胶的丝素纤维。将丝素纤维放入20% w / v9. 3mol / L的溴化锂溶液中，在60°C下恒温磁力搅拌4h，即得到棕黄色的丝素-溴化锂混 合液。将丝素-溴化锂混合液倒入清洁的透析袋中，两头扎紧，放入去离子水中透析三天， 反复换水，经过滤获得去盐丝素溶液。再将去盐丝素溶液装入透析袋中放入高浓度的聚乙 烯醇（PEG)溶液中浓缩12h，将所得的浓缩液装入离心管中，4°C，4950r / min离心lh，上清 液即为丝素溶液的储液。将丝素溶液的储液稀释成不同浓度用于后续实验。
[0019] 上述步骤（3)的具体操作如下：将壳聚糖微球与硫酸钙粉末混合，混合粉末中壳 聚糖微球含量为〇. 1 % W / W-I % W / W壳聚糖微球，硫酸I丐含量为99% W / W-99. 9 % W / w，然后加入无水乙醇搅拌均匀，室温挥发干燥，用玛瑙研钵研磨后备用。将硫酸钙与壳聚糖 组成的混合粉末与丝素溶液按1 : 0.45的固液比g / ml调制均匀，待凝固后即为本发明 的复合骨水泥产品。
[0020] 本发明的优点和有益效果如下：
[0021] (1)本发明首次将壳聚糖微球和丝素加入到硫酸钙骨水泥中制成可注射修复承重 部位骨缺损的复合型磷酸钙骨水泥，优化了硫酸钙骨水泥的抗压强度和凝固时间，进一步 提高了硫酸钙骨水泥作为微创经皮椎体骨缺损修复材料的性能，扩大了其应用范围。
[0022] (2)本发明将壳聚糖微球加入到硫酸钙骨水泥中，除提高骨水泥作为骨损伤修复 材料的性能之外，还能作为药物缓释系统，负载药物（如抗生素）或者成骨因子，通过壳聚 糖的缓慢释放用以提高临床疗效。
[0023] 本发明的复合型骨水泥可携带治病药物应用于体内，通过壳聚糖微球的缓慢释放 药物的功能，延长负载促进骨修复的因子或蛋白的释放时间，提高骨缺损的修复效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1显示壳聚糖微球（CM)的粒径及形态，其中（a)表示光镜下CM形态，（b)表示 电镜下CM的形态，（c)表示CM的粒径分布；
[0025] 图2显不骨水泥的XRD图，其中（a)代表硫酸I丐骨水泥（CSC)，（b)代表壳聚糖微 球复合丝素基硫酸钙（CM / SF / CS)骨水泥；
[0026] 图3显示物质的红外光谱，其中（a)代表壳聚糖微球（CM)，（b)代表丝素（SF)，（c) 代表硫酸钙骨水泥（CSC)，（d)代表壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙（CM / SF / CS)骨水泥；
[0027] 图4显示骨水泥的扫描电镜，其中（a)代表硫酸钙骨水泥（CSC)，（b)代表丝素基 硫酸钙（SF / CS)骨水泥，（c)代表壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙（CM / SF / CS)骨水泥， (d)代表骨水泥内的壳聚糖微球（CM);
[0028] 图5显示含有不同浓度丝素溶液的SF / CS骨水泥的抗压强度；
[0029] 图6显示含有不同比例壳聚糖微球的CM / SF / CS骨水泥的抗压强度；
[0030] 图7显示CS、SF / CS和CM / SF / CS三种骨水泥的抗稀散性，其中（a)代表 lOmin，（b)代表 24h，（c)代表 48h ;
[0031] 图8显示CS、SF / CS、CM / SF / CS三种骨水泥的凝固时间。
【具体实施方式】
[0032] 通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步 说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
[0033] 实施例1壳聚糖微球的制备
[0034] 制备：米用乳化-化学交联法制备壳聚糖微球，先将150mg壳聚糖粉末溶于 10ml2%v / V乙酸溶液中，制成1.5%w / V壳聚糖溶液，于250ml烧瓶中分别加入油相 液体石錯eOmlU^v / V的乳化剂Span-80,在2000r / min搅拌的同时逐滴加入已溶解 的I. 5% w / V壳聚糖溶液10ml，室温搅拌2h。缓慢加入20g/L的三聚磷酸钠（TPP)水溶 液50ml，继续搅拌12h。将溶液1500r / min离心5min，沉淀物用石油醚、酒精和双蒸水各 洗涤三遍，室温下干燥后产物研磨成均匀的粉末，即可得壳聚糖微球。
[0035] 壳聚糖微球形态和粒径的观察：将壳聚糖微球粉末分散于蒸馏水中，在带标尺的 光学显微镜下观察微球的球形及分散性。将微球悬液滴于样品台，待干燥后用导电胶固定 后喷金，电压为15kV，用扫描电镜（SEM，FEI-Quanta250)观察微球表面形态。将微球溶悬 浮于蒸馏水中，采用粒度分析仪（HELOS / CUVETTE湿法粒度仪）测定微球粒径大小。
[0036] 结果：光镜下观察微球球形良好，分散均匀，粒径大小一致，无黏连（图la)。扫 描电镜显示微球的球形完整，表面光滑无皱褶（图lb)。粒径分析显示微球粒径集中在 5 μ m-30 μ m范围内，平均为20. 28 μ m，分布较均匀（图Ic)。
[0037] 壳聚糖微球溶胀率测定：采用壳聚糖微球的吸水能力RS表示[Liu LS.，et al.， Biomaterials，1999, 20 (12) : 1097-1108]。将质量为WD的微球置于PBS中室温4h后取出， 置于与水平面成60°的玻璃平板上，2min后用吸水纸吸干多余水分，称量WW，按下式计算 RS ：
[0038] RS= [(Wff-WD) / WD] X 100%
[0039] 结果：微球的溶胀率为77. 02% +5. 57%，吸水后重量增加，微球体积增大明显。 [0040] 实施例2丝素蛋白溶液的制备
[0041] 将5g蚕丝放入2L含有100°C、0.02mol / L的碳酸钠溶液中，30min后取出，用温 水搓洗5遍，再用去离子水搓洗2遍以脱胶，放入45°C _55°C烘箱中烘干即得到脱胶的丝素 纤维。将丝素纤维放入9. 3mol / L的LiBr溶液（20% w / V)中，在60°C下恒温磁力搅拌 4h，即得到棕黄色的SF-LiBr混合液。将SF-LiBr混合液倒入清洁的透析袋中，两头扎紧， 放入去离子水中透析三天，反复换水，经过滤获得去盐的丝素溶液。将去盐丝素溶液放入透 析袋，再将透析袋放入高浓度的PEG溶液中浓缩12h，将浓缩后的丝素溶液装入离心管中在 4°C，4950r / min离心lh，取上清液保存于4°C备用。
[0042] 实施例3SF / CS骨水泥和CM / SF / CS骨水泥的制备
[0043] 本实施例中各种骨水泥的制备按照表1的配方进行。
[0044] SF / CS骨水泥的制备：分别将3 % w / v、6 % w / v、9 % w / V的丝素溶液按 0.45:1的液固比1111/8与硫酸钙在温度为221：±11：，湿度为40%-60%的条件下混合， 将SF / CS调和物填注于柱形模具内（直径为4. 6mm)。将所制得的样品放置在37°C烘箱 中养护，48h后取出。
[0045] CM / SF / CS骨水泥的制备：分别制备壳聚糖微球含量为0. 1% w / w、0. 5% w / / W、5%w / w的硫酸钙混合粉末，加入无水乙醇搅拌均匀后室温挥发干燥，用玛瑙 研钵研磨后备用。丝素溶液与混合骨水泥粉末按0.45 : 1的液固比ml / g调制均匀，待 其凝固。
[0046] 表1各组骨水泥中的成分比例
[0047]
【权利要求】
1. 一种壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥，其特征在于，所述骨水泥由壳聚糖微球 和硫酸钙组成的混合粉末与丝素溶液以1 : 0.45的固液比（g/ml)配制而成，所述混合粉 末中所述壳聚糖微球含量是〇. 1%W / W-1%W / W，所述硫酸|丐含量是99%w / W-99. 9% w / w〇
2. 根据权利要求1所述的壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥，其特征在于，所述混 合粉末中所述壳聚糖微球含量是〇. 1% w / w-0. 5% w / w，所述硫酸興含量是99. 5% w / w-99. 9% w / w〇
3. 根据权利要求1所述的壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥，其特征在于，所述丝 素溶液浓度为3% w / v-9% w / V。
4. 根据权利要求1所述的壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥，其特征在于，所述丝 素蛋白溶液浓度为6% w / V。
5. -种权利要求1所述的壳聚糖微球复合丝素基硫酸钙骨水泥的制备方法，其特征在 于，所述制备方法包括以下步骤： (1) 制备所述壳聚糖微球； (2) 从蚕丝中提取丝素，制成所述丝素溶液； (3) 将步骤（1)制备的所述壳聚糖微球与硫酸钙粉末混合，混合粉末中所述壳聚糖微 球含量为〇? 1% W / W-1% w / W，所述硫酸|丐含量为99% w / W-99.9% w / W，然后按照 1 : 0.45的固液比g/ml加入步骤（2)中制备的所述丝素溶液，调制均匀；将上述混合物填 注于柱形模具内，放置在烘箱中养护。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖药物微球的制备方法包 括乳化-化学交联法、喷雾干燥法、离子交联法、沉淀/凝聚法。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖微球采用所述乳化-化学 交联法制备。
8. 根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述乳化-化学交联法具体步骤 如下：先将壳聚糖粉末溶于乙酸溶液中，制成壳聚糖溶液，在烧瓶中分别加入油相液体石蜡 乳化剂Span-80,在搅拌同时逐滴加入已溶解的所述壳聚糖溶液，室温搅拌。缓慢加入三聚 磷酸钠水溶液，继续搅拌。将混合溶液离心，所得沉淀物用石油醚、酒精和双蒸水各洗涤三 遍，室温干燥后产物研磨成均匀的粉末，即可得所述壳聚糖微球。
9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述丝素溶液的制备方法如下：将蚕 丝放入碳酸钠溶液中，一定时间后取出，先用温水搓洗，再用去离子水搓洗以脱胶，放入烘 箱中烘干即得到脱胶的丝素纤维。将丝素纤维放入溴化锂溶液中，恒温磁力搅拌，即得到棕 黄色的丝素-溴化锂混合液。将所述丝素-溴化锂混合液倒入清洁的透析袋中，透析三天， 反复换水，经过滤获得去盐丝素溶液。再将去盐丝素溶液装入透析袋中放入高浓度的聚乙 烯醇溶液，浓缩，将所得的浓缩液装入离心管中，离心，上清液即为所述丝素溶液的储液。将 所述丝素溶液的储液稀释成不同浓度。
10. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤⑶的操作如下：将所述 壳聚糖微球与所述硫酸粉末混合，所述混合粉末中含有〇. 1% w / W-l% W / W所述壳聚 糖微球和99% w / W-99. 9% w / W所述硫酸|丐，在所述混合粉末中加入无水乙醇搅拌均勻， 室温挥发干燥，用玛瑙研钵研磨后备用。将所述丝素溶液与所述硫酸钙和所述壳聚糖微球 组成的所述混合粉末按0.45 : 1的液固比ml / g调制均匀，待凝固后即得到本发明的复 合骨水泥产品。
【文档编号】C08L5/08GK104491930SQ201410107798
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】杨惠林, 朱雪松, 皮斌, 王鹏, 王金宁, 陶云霞 申请人:苏州大学附属第一医院