一种琼脂糖-羟基磷灰石复合微球的制备方法
【专利摘要】一种琼脂糖-羟基磷灰石复合微球的制备方法，包括以下步骤：（1）有机相的制备：将乳化剂加入到油相中，加热并机械搅拌，得到有机相；（2）水相的制备：将琼脂糖、羟基磷灰石分散于蒸馏水中并加热至水相沸腾，溶解琼脂糖，得到水相；（3）有机相与水相混合：将沸腾的水相迅速加入到预加热的有机相中，并不断进行机械搅拌，得到混合相；（4）打开反应器的阀门，使混合相通过压力泵的作用迅速通过静态混合器装置；收集样品，并对样品进行冷却、分离、洗涤，得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球；本方法解决了现有羟基磷灰石材料机械强度低、质脆等不足，制备得到的复合微球机械强度更强，对蛋白质的分离纯化有良好的效果。
【专利说明】一种琼脂糖-羟基磷灰石复合微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及复合材料【技术领域】，尤其是涉及琼脂糖包裹羟基磷灰石复合微球的制备方法。
【背景技术】
[0002]琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1，3连结的β-D-半乳呋喃糖和1，4连结的3，6-脱水a -L-半乳呋喃糖。琼脂糖在水中一般加热到90°C以上溶解，温度下降到35~40°C时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示，强度越高，凝胶性能越好。琼脂糖具有亲水性，几乎不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。
[0003]羟基磷灰石化学式为Caltl (PO4)6 (OH)2，简称HAP，是构成生物体骨骼、牙齿的主要无机成分。近年来HAP已迅速成为人体硬组织的替代材料之一。在生物组织工程支架、修复、整形以及药物缓控释载体等方面起了越来越重要的作用，显示了良好发展前景。但羟基磷灰石本身很脆，不易成型，微溶于水。微球材料具有很多不规则颗粒所没有的优异性能，如高的流动性、高的堆积密度、不易团聚、填充后不易引起应力集中等。但是目前有关羟基磷灰石微球的文献报道很少，这在很大程度上限制了它的应用。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种琼脂糖-羟基磷灰石复合微球的制备方法。本方法 解决了现有羟基磷灰石材料机械强度低、质脆等不足，制备得到的复合微球机械强度更强，对蛋白质的分离纯化有良好的效果。
[0005]本发明的技术方案如下:
一种琼脂糖-羟基磷灰石复合微球的制备方法，包括以下步骤:
(1)有机相的制备:将乳化剂加入到油相中，加热并机械搅拌，得到有机相；
(2)水相的制备:将琼脂糖、羟基磷灰石分散于蒸馏水中并加热至水相沸腾，溶解琼脂糖，得到水相；
(3)有机相与水相混合:将沸腾的水相迅速加入到预加热的有机相中，并不断进行机械搅拌，得到混合相；
(4)打开反应器的阀门，使混合相通过压力泵的作用迅速通过静态混合器装置；收集样品，并对样品进行冷却、分离、洗涤，得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球；
所述乳化剂与琼脂糖的质量比为2:广8:1 ;所述琼脂糖与羟基磷灰石的质量比为8:1~1:8 ;所述琼脂糖在蒸馏水中的浓度为广10被％;所述步骤(1)中的油相与所述步骤
(2)中的蒸馏水的质量比为1:广20:1。
[0006]步骤(1)所述油相为矿物油、液体石蜡、植物油或硅油。步骤(1)所述乳化剂包括Span系列。
[0007]步骤(2)所述羟基磷灰石的颗粒度为10纳米到200微米，形态包括不规则形态及球形。
[0008]步骤(4)所述样品冷却的方法包括:将样品室温下搅拌冷却、将样品置于冰浴中搅拌冷却、将样品倒入预冷却的矿物油中搅拌冷却、将预冷却的矿物油倒入到搅拌着的样品中并搅拌。步骤(4)所述样品分离的方法包括:离心分离、抽滤分离、自动沉降分离。
[0009]本发明有益的技术效果在于:
1、本方法采用的设备简单，容易放大生产；原料易得，成本低廉，工艺简单重复性好，便于工业化生产。
[0010]2、本方法主要采用二次蒸馏水及矿物油、液体石蜡、植物油或硅油为溶剂，整个工艺较环保，污染少。
[0011]3、本方法制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石微球较羟基磷灰石微球机械强度高，耐压能力较羟基磷灰石微球提高一倍以上；本方法制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石微球活性基团多，易于进行修饰；亲水性好，生物兼容性好，对DNA检测、蛋白纯化及酶的固定等方面具有良好的应用前景。
[0012]4、本方法制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石微球复合材料由琼脂糖和羟基磷灰石组成，既具备了良好的降解能力，又具备了生物活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1 制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石(球形羟基磷灰石)复合微球的光学显微照片；
图2为羟基磷灰石微球对蛋白的分离效果图；
图3为实施例1制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石复合微球对蛋白的分离效果图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
有机相的制备:将120 g span 80作为乳化剂加入到3000 mL液体石蜡中，然后倒入到10 L带阀门的反应瓶中，使用水浴加热至90°C，并机械搅拌，得到有机相；
水相的制备:将30 g琼脂糖、60 g粒径为40 --m的羟基磷灰石微球分散于750 mL蒸馏水中并微波加热至沸腾，溶解琼脂糖，得到水相；
有机相与水相混合:将沸腾的水相迅速加入到预热的油相中，并不断进行机械搅拌，搅拌约I h至有机相和水相混合均匀，得到混合相；
打开反应瓶阀门及压力泵开关，使混合相在泵的作用下迅速通过静态混合器。使用接收装置收集样品，室温冷却样品，倾倒样品上方的部分油相，使用乙醚和水交替洗涤，通过不断的室温沉降分离得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球。
[0015]产品性能检测:
(I)微观形态观察
图1为实施例1制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石(球形羟基磷灰石)复合微球的光学显微照片，从图中可以看到，羟基磷灰石被琼脂糖均匀包裹，球形的形态良好，分布均匀。
[0016](2)蛋白分离实验
分别使用羟基磷灰石微球和实施例1制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石复合微球作为填料进行蛋白分离实验，分离设备为GE的AKTA，使用的色谱柱的大小为11*22.5mm,缓冲液A为5mM PB, PH=6.5，缓冲液B为500mM PB, PH=6.5，线速度设置为300cm/h。进样量为0.2mL 4mg/ml牛血清白蛋白、lmg/ml溶菌酶和lmg/ml细胞色素C混合溶液。随后进样6个柱体积的缓冲液A，再使用6个柱体积的缓冲液B来平衡体系，最后使用30柱体积线性梯度0%缓冲液B到100%缓冲液B作为洗脱液，可以成功的将牛血清白蛋白、溶菌酶和细胞色素C这三种蛋白进行分离。两种填料的分离效果分布如图2和图3所示。
[0017]从图2和图3可以看到，琼脂糖-羟基磷灰石复合微球可以成功的将牛血清白蛋白、溶菌酶和细胞色素C这三种蛋白进行分离。而羟基磷灰石微球无法很好的分离牛血清白蛋白和溶菌酶这两种蛋白。
[0018](3)机械强度实验
将羟基磷灰石微球及实施例1制备得到的琼脂糖-羟基磷灰石微球复合微球，分别在AKTA上以300cm/h的流速运行48小时后，发现装有羟基磷灰石微球的色谱柱柱压上升，取出羟基磷灰石微球在显微镜下观察发现微球已碎，而琼脂糖-羟基磷灰石微球复合微球没有任何显著变化。
[0019]实施例2
有机相的制备:将60 g span 80作为乳化剂加入到4500 mL矿物油中，然后倒入到10L带阀门的反应瓶中，使用水浴加热至90°C，并机械搅拌，得到有机相；
水相的制备:将15 g琼脂糖、60 g不定形的羟基磷灰石粉体分散于750 mL蒸懼水中并微波加热至沸腾，溶解琼脂糖，得到水相；
有机相与水相混合:将沸腾的水相迅速加入到预热的油相中，并不断进行机械搅拌，搅拌约I h至有机相和水相混合均匀，得到混合相；
打开反应瓶阀门及压力泵开关，使混合相在泵的作用下迅速通过静态混合器。使用接收装置收集样品，冰浴冷却样品，倾倒样品上方的部分油相，使用乙醚和水交替洗涤，通过离心分离得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球。
[0020]实施例3
有机相的制备:将80 g span 85作为乳化剂加入到1000 mL植物油中，然后倒入到10L带阀门的反应瓶中，使用水浴加热至90°C，并机械搅拌，得到有机相；
水相的制备:将10 g琼脂糖、80 g粒径为100 --m的羟基磷灰石微球分散于1000 mL蒸馏水中并微波加热至沸腾，溶解琼脂糖，得到水相；
有机相与水相混合:将沸腾的水相迅速加入到预热的油相中，并不断进行机械搅拌，搅拌约I h至有机相和水相混合均匀，得到混合相；
打开反应瓶阀门及压力泵开关，使混合相在泵的作用下迅速通过静态混合器。使用接收装置收集样品，将样品倒入预冷却的植物油中冷却，倾倒样品上方的部分油相，使用乙醚和水交替洗涤，通过不断的室温沉降分离得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球。
[0021]实施例4
有机相的制备:将40 g span 85作为乳化剂加入到4000 mL硅油中，然后倒入到10 L带阀门的反应瓶中，使用水浴加热至90°C，并机械搅拌，得到有机相；
水相的制备:将2 0 g琼脂糖、2.5 g粒径为50 nm的羟基磷灰石粉末分散于200 mL蒸馏水中并微波加热至沸腾，溶解琼脂糖，得到水相；有机相与水相混合:将沸腾的水相迅速加入到预热的油相中，并不断进行机械搅拌，搅拌约I h至有机相和水相混合均匀，得到混合相；
打开反应瓶阀门及压力泵开关，使混合相在泵的作用下迅速通过静态混合器。使用接收装置收集样品，室温冷却样品，倾倒样品上方的部分油相，使用乙醚和水交替洗涤，通过不断的室温沉降分离得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球。
[0022]本发明公开和提出的琼脂糖-羟基磷灰石复合微球及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料、工艺参数、结构设计等环节实现。本发明的产品和方法已通过较佳实例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【权利要求】
1.一种琼脂糖-羟基磷灰石复合微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)有机相的制备:将乳化剂加入到油相中，加热并机械搅拌，得到有机相； (2)水相的制备:将琼脂糖、羟基磷灰石分散于蒸馏水中并加热至水相沸腾，溶解琼脂糖，得到水相； (3)有机相与水相混合:将沸腾的水相迅速加入到预加热的有机相中，并不断进行机械搅拌，得到混合相； (4)打开反应器的阀门，使混合相通过压力泵的作用迅速通过静态混合器装置；收集样品，并对样品进行冷却、分离、洗涤，得到琼脂糖-羟基磷灰石复合微球； 所述乳化剂与琼脂糖的质量比为2:1~8:1 ;所述琼脂糖与羟基磷灰石的质量比为8:1~1:8 ;所述琼脂糖在蒸馏水中的浓度为1~10 wt% ;所述步骤(1)中的油相与所述步骤(2)中的蒸馏水的质量比为1:1~20:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述油相为矿物油、液体石蜡、植物油或硅油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述乳化剂包括Span系列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述羟基磷灰石的颗粒度为10纳米到200微米，形态包括不规则形态及球形。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述样品冷却的方法包括:将样品室温下搅拌冷却、将样品置于冰浴中搅拌冷却、将样品倒入预冷却的矿物油中搅拌冷却、将预冷却的矿物油倒入到搅拌着的样品中并搅拌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述样品分离的方法包括:离心分离、抽滤分离、自动 沉降分离。
【文档编号】C08K3/32GK103923355SQ201410141839
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】徐卫, 宋芳, 曹松峰, 袁海辉, 王伟 申请人:无锡百运纳米科技有限公司