一种菊花多糖的提取工艺及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种菊花多糖的提取工艺。以市售菊花为原料，采用水提和碱提相结合的方式进行提取，即先采用水提，得到部分多糖提取液，再对滤渣进行碱提，得到另一部分多糖提取液，将上述两部分提取液合并浓缩得到最终产物。本发明提供的菊花多糖的提取工艺，相较于现有的常规提取工艺，所得的多糖具有更高的得率；本发明所得的菊花多糖，相较于现有的常规提取工艺，具有更高的抗氧化活性；本发明所得的菊花多糖，相较于现有的常规提取工艺，具有更高的抗炎活性。
【专利说明】一种菊花多糖的提取工艺及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品加工【技术领域】，涉及一种多糖的提取工艺，尤其涉及一种以菊花为原料的多糖的提取工艺。
【背景技术】
[0002]菊花是一种常见的中草药，具有极高的药用价值，其味甘、性寒，具有清肝明目、清热解毒、散风降压的功效。其中多糖是菊花中有效的药用活性成分之一。研究发现菊花多糖具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、促进免疫力等多种生物活性。另外，菊花作为一种常用中药，它对人体基本上没有毒副作用，因此被广泛应用于开发保健饮料，但是对菊花多糖的生物活性的开发还有很广阔的需求市场。
[0003]近年来有有关菊花多糖的提取方法的研究报道有很多。采用单因素试验和L9(34)正交试验考察了提取时间、提取温度和料液比对野菊花多糖得率的影响(黄家利等，正交设计法优化野菊花多糖的提取工艺，中国实验方剂学杂志，2010，16(18):30-32)。通过比较常规水提法和微波辅助提取法，考察微波功率、提取时间、固液比对菊花多糖提取率的影响，得出微波提取菊花多糖的最佳工艺条件(李朋伟等，菊花多糖提取工艺研究，安徽农业科学，2012 ；40 (6):3586-3587)。采用超声提取技术对菊花多糖的提取方法进行研究，通过考察超声波时间、温度、功率、料液比，得出超声波最佳提取工艺(王丰等，杭白菊多糖超声提取工艺的研究，北方园艺，2012，(2):28-31)。菊花多糖具有较强的清除活性氧自由基的能力(李贵荣，野菊花多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用，中国公共卫生，2002 ; 18 (3):269-270)。多糖的提取或制备方法影响其抗氧化活性(敬思群等，提取工艺对高寒香菊花粗多糖体外抗氧化性的影响分析，食品工业，2014，35(3):165-168 ;王艳丽等，超声参数对白术多糖抗氧化活性的影响，生物加工过程[J]，2012，10(1):7-12 ；张丽霞等，不同提取方法对桦褐孔菌多糖抗氧化活性的影响，安徽农业科学[J]，2012，40(10):5870-5872)。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于开发一种能明显提高菊花多糖抗氧化活性和抗炎活性的菊花多糖的提取工艺。
【发明内容】
[0005]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何在提取菊花多糖的工艺中，既提高多糖的得率和保持多糖的抗氧化活性和抗炎活性。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种菊花多糖的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤:
[0007]1)混合:将菊花除杂洗净，加入蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；
[0008]2)水提:在加热条件下，对步骤1)中的混合液进行磁力搅拌，一段时间后将混合液用滤布过滤，得到的滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；
[0009]3)碱提:在步骤2)的滤渣中加入NaOH溶液，在加热条件下进行磁力搅拌，一段时间后用滤布过滤，得到的滤液即为碱提液；
[0010]4)透析:向步骤3)的碱提液中加入盐酸，调溶液pH值至7，然后用透析袋透析；
[0011]5)浓缩:合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，加热浓缩，得到浓缩液；
[0012]6)沉淀:在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，静置过夜，以除去蛋白质；
[0013]7)润洗:将步骤6)中静置过夜后得到的浓缩液离心，去除上层清液，用低沸点有机溶剂润洗沉淀；
[0014]8)干燥:将步骤7)润洗后的沉淀吹干，得到菊花多糖。
[0015]优选地，步骤1)中的菊花为市售杭白菊，按重量计其含水量为8% ;加入蒸馏水的重量为金针菇重量的20-40倍；所用打磨机为家用型或实验室用型。
[0016]优选地，步骤2)和步骤3)中的加热温度为80_100°C，搅拌时间为2-3小时；所用的滤布为200目或以上。
[0017]优选地，步骤3)中加入NaOH溶液的浓度为0.5-lmol/L，加入的重量为滤渣重量的20-40 倍。
[0018]优选地，步骤4)中加入的盐酸是浓盐酸稀释后的稀盐酸溶液，其较佳的浓度为6mol/L ;透析过程中所使用的透析袋规格为3500Da的截留分子量，透析时间为24小时。
[0019]优选地，步骤5)的浓缩过程在可调温度的恒温加热装置上进行，加热温度为80-100°C ;最终得到的浓缩液体积为浓缩前体积的1/20。
[0020]优选地，步骤6)中加入乙醇的量为使最终混合后的溶液中乙醇的体积百分比浓度大于80%。
[0021]优选地，步骤7)中离心的转速为4000rpm ;润洗所用的低沸点有机溶剂为丙酮、乙醇和乙醚中的一种或多种。
[0022]此外，本发明还提供了用上述工艺提取的菊花多糖。
[0023]本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果:
[0024]1、本发明提供的菊花多糖的提取工艺，相较于现有的常规提取工艺，所得的多糖具有更闻的得率；
[0025]2、本发明所得的菊花多糖，相较于现有的常规提取工艺，具有更高的抗氧化活性；
[0026]3、本发明所得的菊花多糖，相较于现有的常规提取工艺，具有更高的抗炎活性。
[0027]以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的得率对比图；
[0029]图2是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的0RAC抗氧化活性对比图，其中TE为trolox当量；
[0030]图3是本发明的两个较佳实施例与对比例获得的多糖的抑制IL-6炎症因子活性对比图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0032]实施例1
[0033]1)混合:将市售杭白菊除杂洗净，加入20倍重量蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；
[0034]2)水提:在加热温度为100°C条件下，对步骤1)中混合液进行磁力搅拌，水提2小时，再将混合液用滤布过滤，得到滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；
[0035]3)碱提:在步骤2)的滤渣中加入20倍重量的NaOH溶液(0.5mol/L)，在加热温度为100°C条件下进行磁力搅拌，碱提2小时后用滤布过滤，得到滤液即为碱提液；
[0036]4)透析:向步骤3)的碱提液中加入盐酸(6mol/L)，调节溶液pH值至7，然后透析24小时；
[0037]5)浓缩:合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，在加热温度为80°C条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；
[0038]6)沉淀:在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，使得混合均匀后乙醇最终的体积百分比浓度大于80%，静置过夜；
[0039]7)润洗:将步骤6)中静置过夜的浓缩液离心后去除上层清液，相继用丙酮和乙醚润洗沉淀；
[0040]8)干燥:将步骤7)润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化和抗炎活性评价。
[0041]实施例2
[0042]1)混合:将市售杭白菊除杂洗净，加入40倍重量的蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；
[0043]2)水提:在加热温度为80°C条件下，对步骤1)中混合液进行磁力搅拌，水提3小时，再将混合液用滤布过滤，得到滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提；
[0044]3)碱提:在步骤2)的滤渣中加入40倍重量的NaOH溶液(lmol/L)，在加热温度为80°C的条件下进行磁力搅拌，碱提3小时后用滤布过滤，得到滤液即为碱提液；
[0045]4)透析:向步骤3)的碱提液中加入盐酸(6mol/L),调节溶液pH值至7,然后透析24小时；
[0046]5)浓缩:合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，在加热温度为100°C条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；
[0047]6)沉淀:在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，使得混合均匀后乙醇最终的体积百分比浓度大于80%，静置过夜；
[0048]7)润洗:将步骤6)中静置过夜的浓缩液离心后去除上层清液，用无水乙醇润洗沉淀两次；
[0049]8)干燥:将步骤7)润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化和抗炎活性评价。
[0050]对比例
[0051]1)混合:将市售杭白菊除杂洗净，加入20倍重量蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液；
[0052]2)第一次水提:在加热温度为100°C的条件下，对步骤1)中的混合液进行磁力搅拌，水提3小时，再将混合液用滤布过滤，将得到的水提液保留，将滤渣进一步水提；
[0053]3)第二次水提:在步骤2)的滤渣中加入20倍重量的蒸馏水，在加热温度为100°C的条件下进行磁力搅拌，水提3小时，然后用滤布过滤，将得到的水提液保留；
[0054]4)浓缩:合并步骤2)和步骤3)中的水提液，在加热温度为80°C条件下浓缩至原来体积的1/20，得到浓缩液；
[0055]5)沉淀:在步骤4)的浓缩液中加入乙醇，并使乙醇的最终体积百分比浓度大于80%，静置过夜；
[0056]6)润洗:将步骤5)中的静置过夜后的浓缩液离心去除上层清液，相继用丙酮和乙醚润洗沉淀；
[0057]7)干燥:将步骤6)润洗后的沉淀吹干、称重，并进行抗氧化和抗炎活性评价。
[0058]评价实骀
[0059]将实施例1、实施例2和对比例所得菊花多糖分别进行抗氧化0RAC评价。
[0060]具体评价方法如下:在96孔酶标板(黑色)最外周加入300 μ L水。测量孔中依次加入25 μ L样品，150 μ L 4xlO_6mM荧光素钠溶液。将酶标板放入酶标仪中，37°C下预热30min后，加入25yL AAPH开始荧光淬灭反应。其中空白组以25 μ L缓冲液代替样品，对照组以25 μ L不同浓度的Trolox溶液代替样品。样品平行测定三次。结果以Trolox含量作为当量来表不0RAC值。酶标仪测量条件设置如下:激发波长485nm,发射波长528nm ;加入AAPH后，振幅1mm,震荡8S。反应开始后，测量循环次数为120,循环周期为lmin。
[0061]将实施例1、实施例2和对比例所得菊花多糖分别进行抗炎症评价。
[0062]具体评价方法如下:将肝细胞按2xl05/孔的浓度在24孔板上铺板，置于37°C ,5%C02的环境下培养24h等待细胞贴壁；24h之后，分别向各个板孔中加入540 μ L培养基和60 μ L的菊花多糖DMS0溶液，空白孔和对照孔加入等体积DMS0 ;将培养板置于37°C下培养24h，用PBS洗涤一遍板孔，再向板孔中加入含有1 μ g/ml的脂多糖培养液800 μ L，空白孔不含脂多糖的培养液，在37°C下孵育4h ;取出培养板，收集板孔中的培养液待测定IL-6致炎因子的水平。在96孔板中每个孔加入100uL IL-6包被抗体液，封板，并在4°C下过夜等待抗体吸附；将板孔中的液体吸出，用洗涤液洗涤三次，每次洗涤后静置lmin，在吸水纸上拍打平板，移除残留洗漆液；向每孔中各加入200μ 1 lXAssay Diluent,封板后在室温下避光孵育lh ;lh后取出平板，用洗涤液洗涤一遍，每孔中加入100 μ L标品及多糖样品，封板室温孵育2h ;每孔中加入100uL检测抗体，封板，室温孵育lh ;每孔中加入100uL Avidin-HRP,封板，室温孵育30min ;洗板时每孔洗液浸泡l_2min，重复5_7次；每孔加入100 μ L底物溶液封板，室温孵育15min ;每孔中加入50uL终止液；使用酶标仪分别测定450nm与570nm下的光吸收值，结果以450nm下的读数减去570nm下的值表示。
[0063]结果与比较
[0064]如图1所示，实施例1和实施例2的多糖得率分别为3.96%和5.21% (w/w)，而对比实施例为1.86% (w/w) 0由此可见，本发明所提供的菊花多糖的提取工艺可以提高菊花多糖的产率。
[0065]如图2所示，实施例2制得的多糖0RAC值最高，为75.6 μ mol TE/mg，即抗氧化活性最好，其次为实施例1，为12.9μπι01 TE/mg，对比例制得的多糖抗氧化值最小，仅为2.8 μ mo 1 TE/mg。由此可见，本发明所提供的菊花多糖的提取工艺可以明显提高菊花多糖的抗氧化活性。
[0066]如图3所示，用实施例1和实施例2制得的菊花多糖孵育的肝细胞的IL-6水平分别降低了 36%和45%，而在对比例仅降低了 20%左右。由此可见，本发明所提供的菊花多糖的提取工艺可以提闻菊花多糖的抗炎症因子活性。
[0067]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本【技术领域】中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种菊花多糖的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤: 1)混合:将菊花除杂洗净，加入蒸馏水，用打磨机高速打碎，得到混合液； 2)水提:在加热条件下，对步骤I)中的混合液进行磁力搅拌，一段时间后将混合液用滤布过滤，得到的滤液即为水提液，将滤渣取出进行碱提； 3)碱提:在步骤2)的滤渣中加入NaOH溶液，在加热条件下进行磁力搅拌，一段时间后用滤布过滤，得到的滤液即为碱提液； 4)透析:向步骤3)的碱提液中加入盐酸，调溶液pH值至7，然后用透析袋透析； 5)浓缩:合并步骤2)中的水提液和步骤4)中透析后的碱提液，加热浓缩，得到浓缩液； 6)沉淀:在步骤5)的浓缩液中加入乙醇，静置过夜，以除去蛋白质； 7)润洗:将步骤6)中静置过夜后得到的浓缩液离心，去除上层清液，用低沸点有机溶剂润洗沉淀； 8)干燥:将步骤7)润洗后的沉淀吹干，得到菊花抗氧化多糖。
2.根据权利要求1所述的菊花多糖的提取工艺，其特征在于，步骤I)中的菊花按重量计，其含水量为5%，加入蒸馏水的重量为菊花重量的20-40倍。
3.根据权利要求1所述的菊花多糖的提取工艺，其特征在于，步骤2)和步骤3)中的加热温度为80-100°C，搅拌时间为2-3小时。
4.根据权利要求1所述的菊花多糖的提取工艺，其特征在于，步骤2)和步骤3)中所述滤布为200目或以上。
5.根据权利要求1所述的菊花多糖的提取工艺，其特征在于，步骤3)中加入的所述NaOH溶液的浓度为0.5-lmol/L，加入的重量为滤渣重量的20-40倍。
6.根据权利要求1所述的菊花多糖的提取工艺，其特征在于，步骤4)中所述透析使用的透析袋规格为3500Da的截留分子量，透析时间为24小时。
7.根据权利要求1所述的菊花多糖的提取工艺，其特征在于，步骤6)中所述加入乙醇的量为使混合后的溶液中乙醇的最终体积百分比浓度大于80%。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的提取工艺制得的菊花多糖。
9.根据权利要求8所述的菊花多糖在抗氧化食品和药品中的应用。
10.根据权利要求8所述的菊花多糖在抗炎症食品和药品中的应用。
【文档编号】C08B37/00GK104292350SQ201410475017
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】敬璞, 宋立华, 赵淑娟, 陆漫漫, 蔡湛, 袁芳豪 申请人:上海交通大学