一种酶法水解商陆皂苷甲制备商陆皂苷乙的方法与流程

本发明属于生物工程领域，涉及一种酶法水解商陆皂苷甲制备商陆皂苷乙的方法。

背景技术：

药用植物商陆具有逐水消肿、通利二便、解毒散结等功效，主治水肿胀满、二便不通，外治痈肿疮毒等。商陆中主要活性成分为三萜皂苷类，又称为商陆总皂苷，具有祛痰、镇咳、平喘、抗炎、抗菌及抗病毒等多种药理作用。商陆总皂苷成分复杂，目前已从商陆中分离得到21个三萜皂苷元，均为齐墩果烷型，包括商陆酸、商陆酸-30-甲酯、美商陆皂苷元、加利果酸、商陆酸G等5种母核类型。对于每一类皂苷元，由于连接的糖基侧链不同，也会造成活性上的显著差异。现代研究表明许多具有活性的化合物以天然前药——糖苷的形式存在自然界中，口服后在肠道菌的作用下，会释放出有活性的成分。如何通过商陆中含量较高的皂苷转化为含量较低的皂苷，以阐明其活性作用的物质基础，或将低价值的皂苷转为高价值的皂苷成分，也逐渐成为药用植物商陆研究的热门。

商陆皂苷乙是商陆中一种高活性的单糖苷，在商陆中含量显著低于商陆皂苷甲，故从植物中直接抽提并不是有利的工业制备方法。而商陆皂苷甲与商陆皂苷乙的结构类似，两者区别在于商陆皂苷甲的C-3位葡萄糖基，因此通过水解商陆皂苷甲制备商陆皂苷乙是一种有效的途径。

目前水解转化糖苷类化合物常用的方法有化学法和生物法。在商陆皂苷甲的研究中，多采用酸水解法，如专利CN200610104857.3中利用浓硫酸，加热至沸反应2-5h，对商陆总皂苷水解制得商陆总苷元。该方法虽然简单易行，但该方法也会伴随着污染严重、选择性差、产物纯化困难等缺点。

利用微生物发酵法进行生物转化是一种常见的方法。Zhu Yuyao等利用Streptomyces griseus ATCC 13273和Aspergillus ochraceus CICC 40330两株菌的发酵液催化商陆皂苷甲转化，得到产物商陆皂苷乙、商陆皂苷元以及其他两种副产物。其代谢过程包含了EsA→EsB→Phytolaccagenin，这也为商陆皂苷甲代谢产生商陆皂苷乙提供了有利的依据。尽管微生物发酵法反应条件温和、反应效率高、环境污染少，但反应产物种类多样、成分复杂，不仅影响收率，对于纯化分离也造成了更大的困难。

酶促水解反应也是一种生物转化的常用手段，糖苷酶可以选择性的识别不同种类或不同构型的糖苷键，以定向地水解相应的糖苷键。其主要特点为转化效率高、反应专一性强、条件温和易实现，排除了后期繁琐的分离过程。因此通过寻找经济高效、专一稳定的工具酶来定向地进行生物转化，获得所需要的目标化合物也逐渐成为现代研究的重要突破点。但目前为止，酶水解商陆皂苷甲的实例较为缺乏，主要原因是酶源的限制，通过筛选合适的工具酶和反应条件，获得更高含量、高活性的单糖苷或苷元仍是值得去探索的领域。

技术实现要素：

本发明提供了一种通过酶促水解商陆皂苷甲制备商陆皂苷乙的方法，一种酶法水解商陆皂苷甲制备商陆皂苷乙的方法，按照以下步骤进行：

1)以商陆皂苷甲为原料，采用一种β-葡萄糖苷酶在缓冲液中选择性地水解，使其转变为商陆皂苷乙，具体方法为：

取20-50mg的商陆皂苷甲置于反应瓶中，按照10：1：0.5的体积比依次加入缓冲液、β-葡萄糖苷酶溶液和激活剂后共孵育，以TLC法监测反应进行；

2)商陆皂苷乙的制备：将上述转化液于4℃下20000g离心10min，沉淀和上清液用等倍体积乙酸乙酯处理，40-50℃减压浓缩后溶于等体积甲醇，过制备型色谱柱即得到商陆皂苷乙。

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液，

所述激活剂为CaCl2溶液。

所述β-葡萄糖苷酶来源于蜗牛酶固体制剂。

所述步骤1)中优选条件为：β-葡萄糖苷酶的浓度为5-20mg/ml，底物商陆皂苷甲的浓度为2-5mM，激活剂浓度为10-20mM，所用pH值为5.5-7.0，反应温度为20-40℃，反应时间为1-12h。

所述步骤2)中处理沉淀的有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。

上述酶处理商陆皂苷甲后，使得二糖苷选择性的转化为单糖苷，在优选条件下，转化率达到98％以上。

本发明提供了一种利用工具酶高效高选择性转化商陆皂苷甲，制备更高应用价值的代谢产物的方法，转化率可达到98％以上，最终收率可在90％以上。与其他方法相比，该方法转化效率高、反应专一性强、条件温和易实现，产物纯度高，缩减了后期繁琐的分离过程。

附图说明

图1为不同展开剂下商陆皂苷甲及其反应上清的TLC,

图2为10mg/ml的酶浓度下商陆皂苷甲1h的转化图,

图3为20mg/ml的酶浓度下商陆皂苷甲1h的转化图,

图4为50mg/ml的酶浓度下商陆皂苷甲1h的转化图,

图5为商陆皂苷甲与制备的商陆皂苷乙。

具体实施方式

本发明通过下列实施例对本发明技术内容予以进一步阐明，其目的仅仅为了更好理解本发明，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

取100ml三角瓶依次加入11ml磷酸缓冲液(PH6.0)，1.4ml浓度为100mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液(使酶的终浓度为10mg/ml)，1.2ml浓度为20mM的商陆皂苷甲溶液，400ul浓度为20mM的CaCl₂溶液，封闭瓶口后，于37℃下200rpm旋转式摇床反应12h，每隔1h取样进行TLC(如图1所示，为不同配比的展开剂下商陆皂苷甲及其反应上清的TLC图)，或HPLC分析(检测波长203nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，流动相A的比例为，0.01-8.0min，60％-50％；8.0-10.0min，50％-10％；10.0-13.0min，10％-10％；13.0-13.5min，10％-60％；13.5-17.0min，60％-60％)，商陆皂苷甲1h转化率为82.65％，反应12h后转化率达到90.13％以上。如图2所示，为10mg/ml的酶浓度下商陆皂苷甲的转化图。

实施例2

取100ml三角瓶依次加入9.8ml磷酸缓冲液(PH6.0)，2.8ml浓度为100mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液(使酶的终浓度为20mg/ml)，1.2ml浓度为20mM的商陆皂苷甲溶液，400ul浓度为20mM的CaCl2溶液，封闭瓶口后，于37℃下200rpm旋转式摇床反应12h，每隔1h取样进行TLC(如图1所示，为不同配比的展开剂下商陆皂苷甲及其反应上清的TLC图)，或HPLC分析(检测波长203nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，流动相A的比例为，0.01-8.0min，60％-50％；8.0-10.0min，50％-10％；10.0-13.0min，10％-10％；13.0-13.5min，10％-60％；13.5-17.0min，60％-60％)，商陆皂苷甲1h转化率为87.89％，反应12h后转化率达到93％以上。如图3所示，为20mg/ml的酶浓度下商陆皂苷甲的转化图。

实施例3

取100ml三角瓶依次加入5.4ml磷酸缓冲液(PH6.0)，7ml浓度为100mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液，1.2ml浓度为20mM的商陆皂苷甲溶液，400ul浓度为20mM的CaCl₂溶液，封闭瓶口后，于37℃下200rpm旋转式摇床反应12h，每隔1h取样进行TLC(如图1所示，为不同配比的展开剂下商陆皂苷甲及其反应上清的TLC图)，或HPLC分析(检测波长203nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，梯度为，0.01-8.0min，60％-50％A；8.0-10.0min，50％-10％A；10.0-13.0min，10％-10％A；13.0-13.5min，10％-60％A；13.5-17.0min，60％-60％A)，商陆皂苷甲1h转化率为95.59％，反应12h后转化率达到98％以上。如图4所示，为50mg/ml的酶浓度下商陆皂苷甲的转化图。

实施例4

按照实施例3中进行反应，1h后终止反应，将反应液在4℃下20000g离心10min，收集上清液共14ml，用等倍体积的乙酸乙酯萃取三次，沉淀也以等倍体积的乙酸乙酯溶解，40℃减压浓缩，蒸干后溶于4ml甲醇，过制备型色谱柱即得到商陆皂苷乙，收率>93.5％，纯度>98％,如图5所示，为制备的商陆皂苷乙。