本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种鸡毒支原体快速培养与鉴别方法。
背景技术：
鸡毒支原体（Mycoplasma Galliscepticum,MG）也称鸡败血性支原体，在肉鸡中，MG与其它致病菌可引起禽慢性呼吸道病CRD，此病可导致死亡率、淘汰率及加工过程中废弃率上升；在产蛋母鸡，MG的暴发除造成死亡率上升，其真正危害在于造成产蛋量下降5%～10%。在火鸡中，MG可引起窦炎、气囊炎和以高死亡率为特征的传染性窦炎。该病原广泛分布与世界各地，给养鸡业带来巨大的经济损失；
支原体是介于细菌和病毒之间，能营独立生活的一群微生物。支原体对营养的要求较高，在培养基中需额外加入10～20%人或动物血清、辅酶等生长因子才能生长，兼性厌氧，5～10%CO2可促进其生长，不易分离，这给支原体的检测工作带来了困难。针对规模化养禽业，如果能通过简单且快速的方式确定鸡毒支原体的存在情况，则在禽病的防疫工作中会产生巨大经济价值；
目前鸡毒支原体的检测存在诸多的问题，即缺乏成体系成套路的检测方法，常见的检测方式重质控，轻速度，或不重检测实际效果，样本检测成品率低等。由于分离病原体需多次传代增值培养，并与L型细菌的鉴别等，以扩增一代至少需要一天来算，检测确定的时间实在太多，还有用于生产疫苗时，往往用大量的浓肉汤培养，增值快速的同时也会使得许多样品杂菌产生过多，以至于醋酸铊都抑制不了，使得许多样本检出率大幅降低，给该病的防治带来很大的隐患。因此研究一种快速准确检测鸡毒支原体的方法具有重大的现实意义。
技术实现要素：
本发明专利要解决的技术问题是用快速增殖鸡毒支原体，以用于鸡毒支原体病原的检测，为该病的确诊、鸡群的防疫工作提供有效参考。
为了达到以上目的，本专利采用以下技术方案予以实现：
一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：
（1）鸡毒支原体液体培养基制备：
所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制： 胰酶解酪蛋15～30g、葡萄糖5～15g、大豆木瓜酶消化物3～6g、酵母浸出粉15～30g、1%的醋酸铊溶液5ml；
全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，移出，在120℃，1.8个大气压下灭菌30min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液 8～12ml、无菌猪血清80～120ml、青霉素80～120万单位。调PH值至7.0～7.4，前述百分比均为质量百分比。
在反复选取实验方案中发现，增殖中常用的肉汤类增殖剂，无法用于快速测定，尤其是批量样品的操作测定，因为要使其不出现杂菌，条件非常苛刻，这在批量样品的检测中几乎无法实行，批量样品中大量产生杂菌严重影响检测结果。但是仅仅以酵母浸出粉作为培养料也是不够的，对于鸡毒支原体来说，常常需要2～3天才传一代，通过实验发现，利用胰酶解酪蛋白、葡萄糖、大豆木瓜酶消化物、酵母浸出粉，共同进行培养，增殖速度效果较好。经过反复多批次对比，发现产生杂菌的情况极少，不会影响样品的正常测定。这一组合方式是发明人经过反复对比实验并进行分析，在反复实验后得到的，且具备预料不到的技术效果；
（2）疑似病料采集：
从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少100个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；
（3）初检样提取：
将步骤（2）的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36～37℃培养16～18h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（4）初检：
将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养2～4h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（5）复检：
对于步骤（4）确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品B；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；
（6）PCR扩增检验：
设计引物对MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，对通过了复检的样品，经过PCR扩增，选出732bp的片段，通过测序，检验其与Genbank中FMG-2鸡毒支原体核苷酸序列相似度；
（7）形成报告：
通过初检、复检和PCR扩增检验，确认具有鸡毒支原体的样本号码和数量，生成报告。
前述检测方法中所利用的FM-4固体培养基，其制备方法为：
以PPLO肉汤制成粗制肉汤液体培养基，加入2.5%～3%的琼脂制备成固体，灭菌，冷却至50～60 ℃，按比例每90ml液体中添加10ml马血清以及1ml10倍浓缩MEM培养液，于2～6 ℃冷却，制成固体培养基。
本发明的检测方法，支原体增殖生长良好，而且实施简单，不需要高价设备，成本低，易于操作，适宜在普通的鸡毒支原体检测中推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：
（1）鸡毒支原体液体培养基制备：
所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：
胰酶解酪蛋白30g、葡萄糖15g、大豆木瓜酶消化物3g、酵母浸出粉15g、1%的醋酸铊溶液5ml。全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，倒出，在120℃，1.5个大气压下灭菌30min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液 8ml、无菌猪血清80ml、青霉素80万单位；
用0.1%氢氧化钠溶液调PH值至7.0～7.2，前述百分比均为质量百分比；
（2）疑似病料采集：
从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少120个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；
（3）初检样提取：
将步骤2的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36℃培养16h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（4）初检：
将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养2h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（5）复检：
对于步骤（4）确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品B；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；
（6）PCR扩增检验：
设计引物对MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，对通过了复检的样品，经过PCR扩增，选出732bp的片段，通过测序，检验其与Genbank中FMG-2鸡毒支原体核苷酸序列相似度；
（7）形成报告：
通过初检、复检和PCR扩增检验，确认具有鸡毒支原体的样本号码和数量，生成报告。
前述检测方法中所利用的FM-4固体培养基，其制备方法为：
以PPLO肉汤制成粗制肉汤液体培养基，加入2.5%的琼脂制备成固体，灭菌，冷却至50℃，按比例每90ml液体中添加10ml马血清以及1ml10倍浓缩MEM培养液，于2℃冷却，制成固体培养基。
实施例2
一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：
（1）鸡毒支原体液体培养基制备：
所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：胰酶解酪蛋白20g、葡萄糖10g、大豆木瓜酶消化物5g、酵母浸出粉25g、1%的醋酸铊溶液5ml。全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，倒出，在120℃，1.6个大气压下灭菌40min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液10ml、无菌猪血清10ml、青霉素100万单位。用0.1%氢氧化钠溶液调PH值至7.3～7.4，前述百分比均为质量百分比；
（2）疑似病料采集：
从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少150个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；
（3）初检样提取：
将步骤（2）的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在36℃培养17h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（4）初检：
将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养3h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（5）复检：
对于步骤（4）确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品B；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；
（6）PCR扩增检验：
设计引物对MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，对通过了复检的样品，经过PCR扩增，选出732bp的片段，通过测序，检验其与Genbank中FMG-2鸡毒支原体核苷酸序列相似度；
（7）形成报告：
通过初检、复检和PCR扩增检验，确认具有鸡毒支原体的样本号码和数量，生成报告。
前述检测方法中所利用的FM-4固体培养基，其制备方法为：
以PPLO肉汤制成粗制肉汤液体培养基，加入2.7%的琼脂制备成固体，灭菌，冷却至55℃，按比例每90ml液体中添加10ml猪血清以及1ml10倍浓缩MEM培养液，于4℃冷却，制成固体培养基。
实施例3
一种鸡毒支原体检测方法，其特征在于：
（1）鸡毒支原体液体培养基制备：
所述鸡毒支原体培养基按如下工艺配制：
胰酶解酪蛋白15g、葡萄糖5g、大豆木瓜酶消化物6g、酵母浸出粉30g、1%的醋酸铊溶液5ml。全部均匀混合后置入500ml容量瓶，用去离子水定容到500ml，倒出，在120℃，2个大气压下灭菌50min，待冷却至常温后，在无菌条件下加入以下成份：经过过滤除菌的5%的精氨酸生素溶液12ml、无菌猪血清120ml、青霉素120万单位。用0.1%氢氧化钠溶液调PH值至7.1～7.3，前述百分比均为质量百分比；
（2）疑似病料采集：
从选自疑似带病批次鸡鼻窦粘液、喉头、气管分泌物之中取至少160个样品，每样品来自不同鸡只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸铊的培养液进行清洗，得到待检样品；
（3）初检样提取：
将步骤2的待检样品按1:10接种于步骤（1）所述鸡毒支原体液体培养基中，在37℃培养18h，留存该样品液，取部分接种到FM-4固体培养基；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（4）初检：
将接种到FM-4固体培养基的样品37℃培养2-4h，先低倍镜观察菌落是否呈煎蛋状，再以高倍显微镜确认鸡毒支原体；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
（5）复检：
对于步骤（4）确认了存在鸡毒支原体的样品，将步骤（3）中对应的留存样品，选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤（3）相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品A，再将传代1次的样品选取1单位菌液作为待检样品，以与步骤3相同的方法再传代1次，取部分接种到FM-4固体培养基，称为复检样品B；所述FM-4固体培养基不含青霉素和醋酸铊；
以高倍显微镜确认鸡毒支原体确认复检样品A和B是否存在鸡毒支原体；并观察菌落形态确认是否L型细菌；
（6）PCR扩增检验：
设计引物对MG1、MG2，上游MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，对通过了复检的样品，经过PCR扩增，选出732bp的片段，通过测序，检验其与Genbank中FMG-2鸡毒支原体核苷酸序列相似度；
（7）形成报告：
通过初检、复检和PCR扩增检验，确认具有鸡毒支原体的样本号码和数量，生成报告。
前述检测方法中所利用的FM-4固体培养基，其制备方法为：
以PPLO肉汤制成粗制肉汤液体培养基，加入3%的琼脂制备成固体，灭菌，冷却至60℃，按比例每90ml液体中添加10ml猪血清以及1ml10倍浓缩MEM培养液，于6℃冷却，制成固体培养基。
实施例4
本发明在产生方法之前，对如何选用增殖基料做了广泛地分析和研究，首先分析的重点是，现存很多用于鸡毒支原体疫苗生产中利用的肉汤，但是通过实验发现，无论是采用普通肉汤、BGLB肉汤、PPLO肉汤等常用肉汤来培养，每百个样品在添加少量1%的醋酸铊溶液后都很难抑制大批量的杂菌生成。该表数据是进行了三次实验的平均值。
由于本发明需要批量采样，要求完全无菌采集处理等很难，几乎不可能完成。由于这里方法的目的是检测而不是生产疫苗，大幅度提高青霉素等用量是不现实的，由此则肉汤作为辅料在这里很难考虑；
着重考虑其他植物类增殖基料，考虑了酵母浸出物、酵母浸出粉、大豆蛋白胨、去除啤酒花的麦芽汁、胰酶解酪蛋白这些类，通过多次实验分析其传代时间，约为：
总的看来，大豆蛋白胨是效果最好的，但是其性能极不稳定，批量应用有障碍，我们考虑到有大豆木瓜酶消化物的成品粉剂出卖，经过实验发现性能比较稳定，决定用其作为主要基料，又研究了其他各种基料对大豆木瓜酶消化物的效果是否有加成作用：
经测试，在大豆木瓜酶消化物中同时使用酵母浸出粉、葡萄糖、胰酶解酪蛋白，实际对传代时间的缩减效果要大于仅使用酵母浸出粉的10%，最短的传代时间可以快至12～16h，多数情况下18h左右可以传代完毕，由此则本发明利用此为主要的增殖基料配方。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。