番茄黄化曲叶病抗病基因ty‑5的分子标记引物及其应用的制作方法与工艺

番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物及其应用技术领域本发明属于生物技术领域，涉及分子标记技术领域，具体涉及一种番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物及其应用。

背景技术：
番茄(Solanumlycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物，在促进农业经济发展、农民增收方面发挥着巨大的作用。种植过程中易受到多种病害的影响，导致产量下降，选育抗病品种十分重要。番茄黄化曲叶病(TomatoyellowleafcurldiseaseTYLCD)是番茄的重要病害，该病害是由双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlvirusTYLCV)引起，主要通过烟粉虱(Bemisiatabaci)传播。该病害最早报道于以色列，随着国际贸易往来的深入，TYLCV逐渐向全球范围扩展，20世纪90年代，该病害传入我国，目前已经遍布我国所有的番茄主产区，对番茄生产造成严重危害，造成巨大的经济损失。TYLCV危害番茄后，通过农业防治、化学防治不仅效果差，甚至还会对生态环境造成破坏，选育和种植抗病品种是最经济、有效、环保的防治方法。由于TYLCV自身的变异，使得只含有Ty-1和Ty-2的番茄材料在一些区域丧失了抗性，而目前国内市场的番茄品种中均不含有ty-5基因，为了加快ty-5基因分子标记辅助育种(marker-assistedselection，MAS)的进程，开发与ty-5紧密连锁的标记，选育含有ty-5基因的材料具有重要的意义。目前在ty-5连锁标记研究方面，只确定1个CAPS标记SlNAC1连锁，连锁距离尚不明确；(参见HuttonSF，ScottJW，SchusterDJ.RecessiveResistancetoTomatoyellowleafcurlvirusfromtheTomatoCultivarTykingIsLocatedintheSameRegionasTy-5onChromosome4.Hortscience，2012，47(3)：324-327)，并且该标记类型在进行检测时，需要对PCR产物进行酶切，实验成本高，操作繁琐。

技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物，用于筛选与TYLCV抗性基因ty-5紧密连锁的分子标记。为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物，该分子标记引物包括上游引物从5’端到3’端为：TAACAAAGCCCTCAAAGC；下游引物5’端到3’端为：GTCTCCGAAACGTAATCC。本发明另一个目的在于提供了一种番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记，解决常规育种中，抗性鉴定工作量大、周期长、成本高的问题；番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记为InDel标记类型，是利用上述茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物，经过PCR扩增得到的与ty-5紧密连锁的共显性DNA分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本发明的第三个目的在于提供一种番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记分子标记方法，克服ty-5标记需要酶切的缺陷，应用分子生物学方法，以含有ty-5基因番茄自交系AVTO1227为材料，筛选与TYLCV抗性基因ty-5紧密连锁的分子标记。番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记方法，包括以下步骤：1)提取番茄基因组DNA；2)以上述番茄基因组DNA为模板与上述番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物进行PCR扩增，对PCR反应的产物进行分离、鉴定、显色后，检测判断番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5。进一步的，上述分子标记方法所述的步骤2)中，PCR反应体系为：10ng/μL模板DNA1μL；4pmmol/L分子标记引物1.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38个循环，最后72℃延伸7min。本发明的第四个目的在于提供番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因ty-5的检测中和在ty-5基因的分子标记辅助育种中应用。番茄黄化曲叶病毒病抗性基因ty-5检测方法：以番茄基因组DNA为模板与上述番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，对电泳后条带进行记录，根据条带大小确定是否含有ty-5基因；其中PCR反应体系为：反应体系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子标记引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmo1/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38个循环，最后72℃延伸7min。相比现有技术，本发明的有益效果在于：1.本发明所述的分子标记引物能TYLCV抗性基因ty-5紧密连锁，可以用TYLCV抗性基因ty-5的筛选和检测；2.本发明所述的分子标记是一种InDel标记，利用一种广泛分布在作物基因组上，根据碱基序列插入或缺失设计的标记，为共显性标记，其在基因组上的分布广泛，与CAPS标记相比，不需要经过酶切就可以进行多态性的分析，操作方便、简洁，实验成本小；3.本发明通过开发与ty-5连锁的InDel标记，在分离群体中筛选与ty-5紧密连锁的标记，以实现TYLCV分子标记辅助育种，加速对含有ty-5基因的番茄品种选育进程；4.本发明的分子标记可以与其他的连锁标记结合，确定ty-5在染色体上的位置，为该基因的精细定位和此后对该基因的克隆奠定了基础；5.本发明的分子标记应用于对ty-5基因抗性材料的选育，可降低生产过程中化学农药的施用，减轻病害的传播流行，节约生产成本，保障番茄生产的顺利开展，提高番茄产业的经济效益。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明；图1InDel标记ty5-17在亲本和极抗、极感单株的扩增图谱；其中M：100bpMarker；P1：抗病亲本AVTO1227；P2：感病亲本moneymaker；1-5：F2极抗病单株；6-10：F2极感病单株；图2InDel标记ty5-17在亲本和任意37株F2单株的扩增图谱；其中M：100bpmarker；P1：抗病亲本AVTO1227；P2：感病亲本moneymaker；F2单株；由moneymaker×AVTO1227的F1自交获得的任意37株F2单株；图3InDel标记ty5-17在不同番茄材料及品种组合中的扩增图谱；其中，M：100bpmarker；P1：抗病亲本AVTO1227；P2：感病亲本moneymaker；1：1106-7-0；2∶9210；3∶9320；4：FJ-1；5：CLN2026D；6：CLN2777A；7：金陵美玉；8：金陵宝玉9：苏粉11号；10：苏粉14号；11：moneymaker×AVTO1227。具体实施方式番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物，该分子标记引物包括上游引物从5’端到3’端为：TAACAAAGCCCTCAAAGC(SEQIDNo.1)；下游引物5’端到3’端为：GTCTCCGAAACGTAATCC(SEQIDNo.2)。具体的，番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物为InDel标记类型，能与ty-5基因紧密连锁。本发明另一个目的在于提供了一种番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记，解决常规育种中，抗性鉴定工作量大、周期长、成本高的问题；番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记为InDel标记类型，是利用上述茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物，经过PCR扩增得到的与ty-5紧密连锁的共显性DNA分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本发明的第三个目的在于提供一种番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记分子标记方法，克服ty-5标记需要酶切的缺陷，应用分子生物学方法，以含有ty-5基因番茄自交系AVTO1227为材料，筛选与TYLCV抗性基因ty-5紧密连锁的分子标记。番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记方法，包括以下步骤：1)提取番茄基因组DNA；2)以上述番茄基因组DNA为模板与上述番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物进行PCR扩增，对PCR反应的产物进行分离、鉴定、显色后，检测判断番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5。进一步的，上述分子标记方法所述的步骤2)中，PCR反应体系为：10ng/μL模板DNA1μL；4pmmol/L分子标记引物1.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38个循环，最后72℃延伸7min。本发明的第四个目的在于提供番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因ty-5的检测中和在ty-5基因的分子标记辅助育种中应用。番茄黄化曲叶病毒病抗性基因ty-5检测方法：以番茄基因组DNA为模板与上述番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，对电泳后条带进行记录，根据条带大小确定是否含有ty-5基因；其中PCR反应体系为：反应体系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子标记引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38个循环，最后72℃延伸7min。以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中除了给出说明的原料或试剂的来源外，其他材料及试剂均为现有的材料和试剂，可以通过购买方式获得；在下述实施例中本发明所述的番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物简称为ty5-17。实施例1番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记，为InDel标记类型，是利用下述番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物：上游引物从5’端到3’端为：TAACAAAGCCCTCAAAGC下游引物5’端到3’端为：GTCTCCGAAACGTAATCC；经过PCR扩增得到的与ty-5紧密连锁的共显性DNA分子标记；PCR反应体系为：反应体系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子标记引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38个循环，最后72℃延伸7min；该分子标记的核苷酸序列为SEQIDNo.3。实施例2番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记，为InDel标记类型，是利用上述番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物：上游引物从5’端到3’端为：TAACAAAGCCCTCAAAGC下游引物5’端到3’端为：GTCTCCGAAACGTAATCC；经过PCR扩增得到的与ty-5紧密连锁的共显性DNA分子标记；PCR反应体系为：反应体系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子标记引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38个循环，最后72℃延伸7min；该分子标记的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。应用实施例1采用本发明所述的番茄黄化曲叶病抗病基因ty-5的分子标记引物鉴定不同品种的番茄是否含有ty-5基因：1.供试材料父本(P1)：抗番茄黄化曲叶病材料AVTO1227(王银磊，杨玛丽，赵丽萍，etal.含Ty-5基因番茄材料的引进、评价及利用.西南农业学报，2014，(05)：2090-2094)；母本(P2)：感番茄黄化曲叶病材料moneymaker；群体：moneymaker×AVTO1227杂交制备F1，F1单株自交获得F1代分离群体；具体的材料及品种组合见详见表1。2.鉴定步骤如下：1)抗病性鉴定：对4叶1心的幼苗进行携带TYLCVD烟粉虱的人工接种，接种一周后喷施杀虫剂，之后将接种后的番茄幼苗定植于大棚；定植4周后调查植株发病情况，按照发病严重程度分为0-4级：0级，无任何感病症状；1级，顶端叶边缘微微变黄化；2级，顶端小叶稍微变黄并发生很小的卷曲；3级，大范围的叶片变黄，卷曲严重，植株生长量小；4级，症状非常严重，植株矮化，基本停止生长；2)基因组DNA的提取：番茄叶片研磨后立即加入271μL的DNA提取混合液，271μL核裂解液和108μL十二烷基肌氨酸钠，混匀后置于65℃的培养箱45min；加入600μL的氯仿-异戊醇(24∶1)，轻轻翻转，使两者混合均匀，放入离心机中10000rpm离心6min；吸取上清夜，转入新离心管，加入600μL预冷异丙醇，轻轻摇匀，12000rpm离心10min，弃上清液；加入200μL的70％乙醇，漂洗2次，将试管置于室温下晾干；加入200μLT1/10E溶液，使DNA溶解，置于-20℃保存；3)InDel分子标记引物ty5-17的分析：A.极抗极感单株的选取通过对F2群体进行烟粉虱接种，鉴定单株对番茄黄化曲叶病的抗性，根据发病的严重程度进行分级；选取无发病症状，病级记录为0的5个任意单株作为极抗病单株；选取植株矮化，生长受到严重抑制，叶片黄化卷曲严重，病级记录为4的5个任意单株作为极感病单株；B.InDel连锁标记的分析在番茄4号染色体SlNAC1附近选取新的InDEL位点进行分析，确定分子标记引物ty5-17与ty-5基因具有连锁关系，利用ty5-17标记引物进行标记，标记方法中PCR反应体系为：模板DNA10ng/μL1μL；4pmmol/L子标记引物ty5-171.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；每个循环94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共38个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离鉴定，银染显色，然后在可见投射仪上观察、记录实验结果；3)鉴定结果通过对244株F2单株进行抗性鉴定，将病情≤2的记为抗病植株，病情≥3的记为感病植株，抗病植株共计59株，感病植株共计185株，符合3∶1的分离比例(χ2＝0.09)，ty-5为单隐性遗传；分子标记引物ty5-17在抗病亲本AVTO1227、感病亲本moneymaker以及极抗和极感单株间进行扩增，AVTO1227和所有的极抗单株均只扩增出大小为172bp的条带；moneymaker扩增出187bp的条带；5个极感单株中4株扩增出大小为187bp的条带，1株扩增出172和187大小的杂合带型，结果参见图1，其中M：100bpMarker；P1：抗病亲本AVTO1227；P2：感病亲本moneymaker；1-5：F2极抗病单株；6-10：F2极感病单株。对两个亲本扩增产物进行测序分析，证实15bp的核苷酸片段插入到moneymaker材料，导致多态性的产生，插入的15个碱基为5’-ATAAGTACGTATTGG-3’。InDel标记ty5-17在抗病亲本AVTO1227、感病亲本moneymaker以及任意37株F2单株间进行扩增，鉴定为抗病的单株均只扩增出大小为172bp的条带；鉴定为感病的单株扩增出大小为172bp的条带，或172和187大小的杂合带型。表型和基因型完全吻合。结果参见图2，其中M：100bpmarker；P1：抗病亲本AVTO1227；P2：感病亲本moneymaker；F2单株；由moneymaker×AVTO1227的F1自交获得的任意37株F2单株。InDel分子标记引物ty5-17进一步应用于对番茄材料和品种组合的鉴定。从图3可见，其中，M：100bpmarker；P1：抗病亲本AVTO1227；P2：感病亲本moneymaker；1∶1106-7-0；2∶9210；3∶9320；4：FJ-1；5：CLN2026D；6：CLN2777A；7：金陵美玉；8：金陵宝玉9：苏粉11号；10：苏粉14号；11：moneymaker×AVTO1227。所有不合有ty-5基因的番茄材料或品种，均只扩增到单一的187bp大小的条带；AVTO1227与moneymaker的F1杂交种扩增出172和187大小的杂合带型。由此说明，分子标记引物ty5-17可以应用于ty-5基因的分子标记辅助育种中。不同品种的番茄是否含有ty-5基因检测结果见表1。表1：番茄材料及品种组合材料名称抗病基因型AVTO1227ty-5/ty-5moneymaker无1106-7-0Ty-3/Ty-39210无9320无FJ-1无CLN2026Dty-2/ty-2CLN2777ATy-2/Ty-2金陵美玉无金陵宝玉无苏粉11号Ty-3/ty-3苏粉14号Ty-3/ty-3moneymaker×AVTO1227Ty-5/ty-5上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。