用于预防和/或治疗老年性痴呆的β片层阻断肽的制作方法与工艺

本发明涉及多肽及其用途，具体而言，本发明涉及一类可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽，以及所述多肽用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的用途。

背景技术：
阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）又称老年性痴呆，是一种神经退行性疾病。随着人口老龄化进程的加快，老年性疾病已成为一个明显影响人类健康的突出问题。老年性痴呆和恶性肿瘤、心脑血管意外，并列为导致老年人死亡的三大疾病，世界卫生组织已将AD列入21世纪五大重点疾病之一。现代医学研究证明，阿尔茨海默病病理学改变的主要特征为：神经细胞之间形成大量由β-淀粉样肽（β-amyloidpeptide，Aβ）沉积形成的老年斑（senileplaque,SP）、神经细胞内神经元纤维缠结（neurofibrillarytangle,NT）和神经元大量丢失。目前对AD发病机制的认识以淀粉样蛋白学说占主导地位。该学说认为：Aβ的病理性折叠和寡聚物的形成启动了AD的发病过程，如氧自由基形成、氧化应激、细胞内钙离子稳态破坏、蛋白激酶激活、tau蛋白过度磷酸化、诱导凋亡、慢性炎症、补体激活、影响线粒体功能，导致能量代谢障碍等病理生理变化，最终造成神经细胞的死亡，引起AD患者记忆丧失、认知能力减退、行为异常等一系列临床症状。众多证据表明Aβ的神经毒性作用是多种因素导致的AD发病的共同通路，而Aβ的神经毒性与其聚集有关。在Aβ二级结构中，β-折叠的形成是聚集必需的，富含β折叠的结构能够更快地促进Aβ聚集，而β折叠的形成与Aβ肽链中的疏水片段有关。在一定条件下，富含β折叠的结构疏水区暴露，会促使Aβ聚集，形成低聚物，最终成为不可溶性物质在神经元间隙沉积，产生神经毒性并引起脑内胶质细胞活性增高，产生炎性介质和补体，共同形成淀粉样斑块。研究发现可溶性Aβ成分的水平比斑块沉积的密度与认知损伤严重程度的关系更密切，不同的可溶性Aβ的寡聚物如Aβ寡聚物、ADDLS和Aβ纤维可能通过不同的神经毒性机制影响神经功能和神经生存能力（DeshpandeA,MinaE,GlabeC.DifferentConformationsofAβInduceNeurotoxicitybyDistinctMechanismsinHumanCorticalNeurons[J].JNeurosci,2006,26(22):6011-6018）。Aβ是老年斑的主要成分，是淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein,APP）经β、γ分泌酶水解的代谢产物。由于酶切位点的不同产生Aβ1-40或Aβ1-42，Aβ1-42比Aβ1-40具有更大的神经毒性并且更疏水，更易形成寡聚物并进一步聚集，在AD病理过程中起关键作用。Aβ1-42肽的一级结构如下所示（SEQIDNO:3）:Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-151015Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-16202530Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala31354042Aβ1-42C端的10个氨基酸残基33-42及17-21位的氨基酸残基具有高度的疏水性，构成了Aβ1-42疏水区；28-42位氨基酸残基形成β折叠构象的可能性较大，而9-21位的氨基酸残基也可能形成β折叠构象。β折叠构象有利于Aβ1-42肽的聚集，而Aβ肽的聚集又是由于其疏水区的相互作用。MQLiao等应用分光镜和细胞技术发现Aβ肽链中疏水的17－21，25－35片段及C端41－42是主要的致聚集和神经毒性的区域（LiaoMQ,TzengYJ,ChangLY,etal.Thecorrelationbetweenneurotoxicity,aggregativeabilityandsecondarystructurestudiedbysequencetruncatedAbetapeptides[J].FEBSLett,2007,581(6):1161-1165）。目前针对Aβ的药物的研究目标是减少Aβ的生成，增加Aβ清除、预防或逆转Aβ聚集和抑制Aβ的毒性等。美国华盛顿大学医学院的研究人员发现，在清除阿尔茨海默病小鼠脑内的淀粉蛋白斑块后，小鼠的脑细胞开始奇迹般地恢复功能。表明针对Aβ的药物有着令人鼓舞的前景。在各种针对Aβ的药物中，β片层阻断剂越来越为人关注。中国专利CN101531703A公开了几种多肽，其能与Aβ1-42特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成β片层、阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成、且对Aβ纤维具有分解作用，所述多肽被称为β片层阻断肽。经过对比发现，其中序列为His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp（H102）（SEQIDNO:2）的多肽其对Aβ聚集的抑制作用（抑制率27.84%）最强。本领域目前需要能更好地针对Aβ聚集过程中β折叠这一必需环节设计的新的活性药剂，所述药剂能够与β-淀粉样蛋白单体（Aβ1-42）特异结合，阻止β折叠形成进而抑制Aβ肽的聚集，减少脑内Aβ可溶性寡聚体、Aβ纤维及老年斑的形成，加速Aβ肽的降解与清除，从而可用于AD的预防和/或治疗。

技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种能更好地针对Aβ聚集过程中β折叠这一必需环节设计的多肽，所述多肽能够与β-淀粉样蛋白单体（Aβ1-42）特异结合，阻止β折叠形成进而抑制Aβ肽的聚集，减少脑内Aβ可溶性寡聚体、Aβ纤维及老年斑的形成，加速Aβ肽的降解与清除，从而可用于AD的预防和/或治疗。本发明的发明人意外地发现，具有如下氨基酸序列的多肽HPYD能够实现上述目的：His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp（SEQIDNO:1）。因此，在本发明的第一方面，提供了包括上述氨基酸序列的多肽。由于上述的多肽能与β淀粉样蛋白单体（Aβ1-42）特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成β片层、阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成、且对Aβ纤维具有分解作用，因此可以用于阿尔茨海默病的预防和/或治疗。因此，在本发明的第二方面，提供了本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括本发明的多肽和可药用的载体。在本发明的第四方面，提供了一种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的本发明的多肽。附图说明图1显示了制备本发明多肽的方法的步骤和所制备产品的检测结果。图1A显示了用于合成和纯化本发明多肽HPYD的主要步骤；图1B显示了HPYD的色谱分析结果；图1C显示了HPYD的质谱检测结果。图2显示了Aβ老化组及HPYD干预后其FT-IR光谱。其中a为Aβ溶液孵育30分钟后的FT-IR光谱；b为Aβ溶液孵育72小时后的FT-IR光谱；c为H102与Aβ溶液共同孵育72小时后的FT-IR光谱；d为HPYD与Aβ溶液共同孵育72小时后的FT-IR光谱。图3显示了HPYD抑制Aβ聚集的电镜观察结果。其中，图A为将Aβ1-42单独孵育5天的电镜结果，放大倍数57000倍；图B为将H102与Aβ1-42共同孵育5天的电镜结果，放大倍数57000倍；图C为将HPYD与Aβ1-42共同孵育5天的电镜结果，放大倍数57000倍。图4显示了HPYD对APP/PSI双转基因小鼠大脑皮层及海马CA1区Aβ表达的影响结果。其中，A1为正常对照组的海马CA1区Aβ表达；A2为模型组的海马CA1区Aβ表达；A3为给药组的海马CA1区Aβ表达；B1为正常对照组的大脑皮层Aβ表达；B2为模型组的大脑皮层Aβ表达；B3为给药组的大脑皮层Aβ表达。图5显示了HPYD对APP/PSI双转基因小鼠大脑皮层及海马CA1区APP表达的影响结果。其中，A1为正常对照组的海马CA1区APP表达；A2为模型组的海马CA1区APP表达；A3为给药组的海马CA1区APP表达；B1为正常对照组的大脑皮层APP表达；B2为模型组的大脑皮层APP表达；B3为给药组的大脑皮层APP表达。图6显示了在定位航行实验中各组小鼠每天平均逃避潜伏期。图7显示了在空间探索实验中各组小鼠跨越隐性平台的次数比较结果。图8显示了在空间探索实验中各组小鼠入水朝向角的比较结果。具体实施方式在本文中公开了一系列多肽的氨基酸序列，本领域技术人员能够理解的是，在以三字母的氨基酸残基表示某一序列时，该序列从左至右表示的是该多肽从N端（氨基端）至C端（羧基端）的序列。例如当使用“His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp”表示某一多肽的序列时，意为该多肽的序列为“N端-His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp-C端”。在本发明的第一方面，提供了包括下述氨基酸序列的多肽：His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp本发明的多肽可以包括上述氨基酸序列、基本上由上述氨基酸序列组成或者由上述氨基酸序列组成。在本发明的一个实施方案中，提供了一种由如下序列组成的多肽，所述多肽在本发明中被命名为HPYD：HPYD:His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp。显而易见的是，可以对本发明的多肽进行各种修饰。所述的修饰包括但不限于：脯氨酸和赖氨酸的羟基化，赖氨酸、组氨酸侧链的o-氨基基团的甲基化，N端氨基的乙酰化以及在某些情况下C端羧基的酰胺化。应该理解的是，在获知本发明多肽的氨基酸序列之后，上述各种修饰形式对于本领域技术人员是显而易见的，并且含有这些修饰的包括所公开氨基酸序列的多肽也在本发明的范围之内。上述的本发明多肽能够作为β片层阻断肽，其能够与β淀粉样蛋白单体（Aβ1-42）特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成β片层、阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成、且对Aβ纤维具有分解作用，因此可以用作预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。所以，在本发明的另一方面，提供了本发明的多肽在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。本文中所使用的“预防”指的是减少受试者患上病症的风险或者延迟患者患病或者症状出现的时间。本文中所使用的“治疗”并不是指完全治愈，它是指减轻了潜在疾病的症状和/或减少了导致症状的一种或多种潜在的细胞、生理或生物化学病因或机理。应理解本文所使用的减轻是相对于疾病状况而言的，包括疾病的分子状况，而不仅仅是疾病的生理状况。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括一种或多种本发明的多肽和可药用的载体。“可药用的载体”是指在生物学上或其他方面不会具有不良作用的物质，即可以将所述物质与本发明的多肽一同给予受试者，同时不会引起任何不良的生物学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。显然应当选择可使活性成分的任何降解降到最低并且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体，这是本领域技术人员所熟知的。本发明的药物组合物通常包括至少一种本发明的多肽和一种或多种可药用的载体。合适的载体包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、载体、冲淡剂、赋形剂和/或药用佐剂。例如，合适的载体可为生理盐水溶液、柠檬酸盐缓冲液或人工CSF，以及可能添加常用于肠胃外给药组合物的其他物质。中性缓冲盐溶液或与血清清蛋白混合的盐溶液也是示例性的载体。本领域技术人员可以容易地确定可用于本发明组合物和剂型的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于可药用的弱酸、弱碱或它们的混合。优选地，缓冲组分为水溶性物质，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸，以及它们的盐。载体中的基本溶剂在性质上可以为水性的或非水性的。另外载体可以含有用于改善或维持制剂pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌度、稳定性、溶出速度或气味的其他可药用赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有其他可药用的用于改善或维持本发明多肽的释放速率的载体。这类载体为配制缓释制剂的技术人员已知的物质。当本发明的药物组合物被配制成以后，可在无菌管中以溶液、悬液、凝胶、乳剂、固体或者脱水或冻干粉末的形式储存。这些制剂也可以以即用形式、以用前需要重配的冻干粉形式或以用前需要稀释的液体形式储存。优选地，本发明的药物组合物以单次使用的无菌管装形式提供，并在用前一直在2-8℃储存。在即将给药前，可将本发明的药物组合物用合适的无菌的例如任何上述的柠檬酸盐缓冲液恰当地稀释。本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的本发明的多肽。术语“有效量”意为所使用的化合物的量足以防止疾病的发病或症状的出现，或者改善疾病或病症的一种或多种病因或症状。所述改善只需减轻或改变而并不必须消除。对于本发明多肽而言，其预防和/或治疗有效量应根据所针对的个体以及所用的多肽而变化。所用的多肽的预防和/或治疗有效量也应根据个体的年龄、身材、体重、状况等而变化。针对具体受试者，确定本发明多肽的预防和/或治疗有效量是在本领域技术人员的能力范围之内的。将本发明的多肽或本发明的预防和/或治疗方法应用于阿尔茨海默病受试者时，具有显著抑制受试者脑组织内Aβ聚集，减少淀粉样斑块的数量和面积，改善阿尔茨海默病症状的效果。例如可以提高活动力和注意力并减少反应时间，可以改善发音、面部表情、体态、嗅觉、性欲、性功能和情绪状况并使精神状态愉快。在本发明的另一个实施方案中，可以适当地对例如阿尔茨海默病患者给予本发明的多肽作为认知增进剂，从而提高特别是被痴呆损害的学习能力或者抑制认知衰退和/或痴呆。本发明的多肽的制备本发明的多肽可以通过本领域技术人员已知的任何制备多肽的方法来制备。可以使用化学合成法合成本发明的多肽。多肽的合成可以在溶液中进行，也可以使用固相合成法。多肽的固相合成方法包括Fmoc固相合成法和tBoc固相合成法。人工合成多肽的方法一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。在本发明的一个实施方案中，采用Fmoc固相合成法合成本发明的多肽，并通过HPLC进行纯化。图1显示了在这个实施方案中合成和纯化本发明的多肽HPYD的主要步骤和所制备多肽的检测结果。在这个实施方案中，使用多肽固态合成仪在合成柱上合成多肽，从而大大减轻了产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，合成柱和添加氨基酸的侧链是被保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。本发明的多肽在采用Fmoc法合成和采用制备高效液相（HPLC）柱纯化后，可以使用质谱（MS）分析来鉴定。应当理解的是，所有本发明的多肽均可用与上述实施方案类似的合成方法来制备、纯化和鉴定。也可以通过重组基因工程的方法生产本发明的多肽。简而言之，可以合成编码本发明多肽的多核苷酸，然后将其用本领域已知的方法转化至合适的宿主细胞中并使其被表达，对表达产物进行纯化或处理即可得到本发明的多肽。实施例下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例是为了使本领域普通技术人员能够更好地理解本发明，这仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以℃为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。实施例1：HPYD的制备在本实施例中，使用Fmoc/tBu固相合成法合成了本发明的多肽HPYD，所述多肽的序列为:His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Tyr-Glu-Glu-Asp（SEQIDNO:1）本实施例的多肽合成方法中所用的原料为Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH。HPYD合成和纯化方法的主要步骤如图1A所示。图1A所示的实验方案中所用的TFA试剂为TFA:CH2Cl2(v/v)=2:98。将制备得到的肽粗产品通过HPLC纯化，使最后获得的肽的纯度大于95%，HPLC的结果示于图1B。将通过上述方法制备和纯化的多肽HPYD使用质谱分析鉴定并测序，质谱分析的结果示于图1C。鉴定和测序的结果显示，用上述方法制备的多肽序列和分子量与预期相符。实施例2：HPYD对Aβ1-42聚集和纤维形成的抑制作用1材料与方法1.1药品与试剂Aβ1-42（纯度＞98%）、硫磺素T（ThioflavinT,ThT）、PBS缓冲粉末均购自美国Sigma公司；β片层阻断肽H102、HPYD采用实施例1所述方法合成，高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）纯化，经质谱仪（massspectrometer,MS）分析鉴定纯度均＞95%。1.2ThT荧光分光法分析HPYD抑制Aβ聚集作用ThT荧光强度可以反映Aβ的聚集程度。将Aβ1-42冻干粉用pH7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液50mmol/L配制成浓度为22.15μmol/L的溶液，H102及HPYD分别用同样PBS液配制成浓度为88.60μmol/L的溶液。实验中将Aβ1-42与H102及HPYD分别等体积混合，终浓度分别为11.07μmol/L和44.3μmol/L。将上述两组溶液在37℃孵育24h后，每组取10μL与3.0μmol/L的ThTPBS液990μL迅速混匀，用VARIANPTC-Au00-01058荧光分光光度仪在激发波长453nm、发射波长478-486nm测定其ThT荧光强度。1.3FT-IR光谱法观察HPYD对Aβ1-42聚集的抑制作用采用1.2的方法配制22.15μmol/LAβ1-42的PBS磷酸缓冲溶液四份，将其中两份溶液分别加等体积的PBS磷酸缓冲溶液在37℃下单独孵育30min（30min老化组）和72h（72h老化组）；其余两份溶液分别加入等体积的H102（88.60μmol/L）及HPYD（88.60μmol/L）在37℃下共同孵育72h，将孵育后各样品真空冷冻干燥处理。取出冷冻干燥处理后的H1023.5μg、HPYD3.7μg分别与无水溴化钾(120～180mg)充分混合，压片机加压5min形成溴化钾压片，用Nico1etMagna760FT-IR仪对其进行测量和分析，分辨率为4cm-1光谱观察范围为3500～400cm-1。采用Origin8.0软件对1700～1600cm-1的酰胺I谱带谱进行分析。由于样品成分的复杂性及酰胺I带附近的振动峰对二级结构的影响，扩大拟合范围到1750～1550cm-1。1.4HPYD抑制Aβ聚集的电镜观察采用1.2的方法配制Aβ1-42的PBS磷酸缓冲溶液(11.07μmol/L20μl)，将该溶液在37℃下单独孵育5d。同时，Aβ1-42(22.15μmol/L,10μl)分别与H102及HPYD(88.61μmol/L，10μl)在相同条件下共同孵育5d。取每组样本各5μl，滴于含碳支持膜300目去离子铜网上，室温静置15min。2%醋酸双氧铀避光负染2min。干燥后透射电镜观察。上述研究均以Aβ1-42作为阴性对照，以H102为阳性对照。2.实验结果2.1ThT荧光法分析药物对Aβ1-42聚集和纤维形成的影响Aβ1-42在PBS溶液中能形成非常高的荧光强度，表明Aβ1-42能自我聚集和形成Aβ纤维。以老化组（Aβ1-42冻干粉用pH7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液50mmol/L配制成浓度为11.07μmol/L溶液，将该溶液在37℃下孵育24小时，即为老化组）去本底荧光强度为100%，计算各组药物对Aβ1-42抑制率(%)。结果如表1所示，HPYD对Aβ1-42的抑制率比H102高。表1HPYD对Aβ1-42聚集的抑制作用与Aβ1-42组比较，经F检验：*P＜0.05抑制率=(1-β片层阻断肽的相对荧光强度/Aβ1-42的相对荧光强度)x100%2.2FT-IR光谱法观察HPYD对Aβ1-42聚集的抑制作用Aβ1-42的二级结构成分主要包括自由卷曲、α-螺旋、β-折叠片(伸展结构)和β-转角。图2显示，在代表β-折叠片的波数（1640～1620cm-1）中，各组曲线的最大负峰皆位于1624cm-1附近，其中，HPYD组的透过率明显高于老化组（尤以72h老化组的透过率为最低）。HPYD组中的β-折叠片含量最低；β-折叠片的含量随孵育时间的延长而升高；HPYD组与H102组在代表其二级结构各波数中的透过率明显高于Aβ单独孵育72h组。2.3HPYD抑制Aβ聚集的电镜观察HPYD抑制Aβ聚集的电镜观察见图3。A：Aβ1-42单独孵育5d，出现大量Aβ纤维，呈芒刺式晶状聚集，有分枝，且大片交织成深染、密集的网状结构，其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构；B：H102与Aβ1-42共同孵育5d，Aβ纤维减少明显，呈芒刺式晶状聚集，有分枝，交织成网状，其间可见呈聚集状态的无定形结构；C：HPYD与Aβ1-42共同孵育5d，Aβ纤维形成明显减少且直径变细，染色变浅，交织成网状，其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构。电镜的结果显示HPYD抗Aβ聚集作用比H102更强。结论HPYD可抑制Aβ的聚集和纤维形成。实施例3.HPYD对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ和APP表达的影响1材料与方法1.1动物APP/PS1双转基因小鼠14只随机分为模型组和给药组，同月龄同背景的C57BL/6J小鼠7只设为正常对照组。均购自中国医学科学院中国协和医科大学试验动物研究中心。采用鼻腔给药方法，给药组用自制给药器给予33mg/ml的HPYD生理盐水溶液5μl/d，正常对照组和模型组鼻腔给予等体积生理盐水。给药30d后进行检测。1.2药品与试剂：Aβ1-42抗体购自Chemicon公司；APP抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、0.1%多聚赖氨酸购自武汉博士德公司；其他试剂均为国产分析纯。1.3免疫组化染色：实验动物行Morris水迷宫测定小鼠的学习记忆能力之后，采用0.1kg/L水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉。经左心室迅速插管，同时剪开右心房，快速灌注0.01MPBS缓冲液，待肝脏变白后，迅速冰浴上取脑，放入4%多聚甲醛溶液中固定24h以上。待脑组织下沉后，行蜡块包埋。行小鼠脑矢状切面切片，待海马CA1区出现后连续切片，切片厚度5μm。免疫组化染色：（1）组织切片常规脱蜡至水（2）3%H2O2室温孵育10min，以消除内源酶活性。（3）柠檬酸缓冲液微波沸腾进行抗原修复，5min×2次，取出冷却至室温。（4）分别加入稀释好的一抗：Aβ（1:100）、APP（1:100），滴加量为能够覆盖组织即可，4℃冰箱过夜。（5）根据一抗来源分别滴加相应生物素标记的羊抗鼠和羊抗兔通用二抗，滴加量为能够覆盖组织即可，37℃孵育20min。（6）滴加SABC液，滴加量为能够覆盖组织即可，37℃孵育20min。（7）DAB显色剂显色，镜下控制染色程度，去离子水终止显色反应后充分冲洗。（8）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于显微镜下观察。阴性对照用0.01MPBS溶液替代一抗，其余步骤相同。1.4数据处理：所得数据以均数±标准差表示，采用统计软件SPSS16.0进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1Aβ免疫组化染色Aβ免疫组化染色结果显示正常对照组海马CA1区及皮层神经元胞浆着色成阴性或弱阳性，阳性细胞率（阳性细胞占总细胞数的比例）较低，模型组较正常对照组阳性细胞增多，阳性细胞率增加，差异有统计学意义（P<0.01），胞浆着色明显加深，Aβ表达增强。给药组与模型组相比，胞浆着色较浅，阳性细胞率较低，差异有统计学意义（P<0.01），Aβ表达较弱。给药组与正常组相比，两者无显著性差异（（P>0.05））。见表2，图4。表2各组小鼠皮层及海马CA1区Aβ活性比较（n=7,与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，＊＊P<0.012.2APP免疫组化染色APP免疫组化染色结果显示正常对照组海马CA1区及皮层神经元胞浆着色成阴性或弱阳性，阳性细胞率较低，模型组较正常对照组阳性细胞增多，阳性细胞率增加，差异有统计学意义（P<0.01），胞浆着色明显加深，APP表达增强。给药组与模型组相比，胞浆着色较浅，阳性细胞率较低，差异有统计学意义（P<0.01），APP表达较弱。给药组与正常组相比，两者无显著性差异（P>0.05）。见表3，图5。表3各组小鼠皮层及海马CA1区APP活性比较（n=7,与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，＊＊P<0.013结论HPYD经鼻腔给药入脑，可降低脑内APP及Aβ蛋白的表达。实施例4.HPYD对APP/PS1双转基因小鼠行为学影响1材料与方法1.1动物APP/PS1双转基因小鼠14只随机分为模型组和给药组各7只，同月龄同背景的C57BL/6J小鼠7只设为正常对照组。采用鼻腔给药方法，给药组用自制给药器给予33mg/ml的HPYD生理盐水溶液5μl/d，正常对照组和模型组鼻腔给予等体积生理盐水。给药30d后进行检测。1.2Morris水迷宫测试（1）定位航行：置平台于水迷宫第三象限中环内，每日相同时段每只小鼠游泳2次（90s/次），历时5d。记录小鼠寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。如果小鼠在90s内未找到平台，则将其引至平台停留20s，逃避潜伏期记为90s。（2）空间探索：第6日撤去平台，相同时段，任选一个入水点将小鼠放入水中，每只小鼠游泳1次（90s/次）。记录小鼠在90s内游泳轨迹、跨越隐性平台的次数及入水后游泳初始角度等指标测试小鼠的记忆能力。1.3数据处理所得数据以均数±标准差表示，采用统计软件SPSS16.0进行统计分析，利用单因素方差分析，两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1定位航行实验结果与正常对照组小鼠相比，模型组逃避潜伏期明显延长，差异具有统计学意义（P<0.01）。给药组与模型组比较，逃避潜伏期时间呈下降趋势，差异具有统计学意义（P<0.01）。给药组与对照组的逃避潜伏期时间随着实验次数的增加在总体上均呈下降趋势，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4，图6。表4各组小鼠每天平均逃避潜伏期变化（s,n=7,与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.012.2空间探索实验结果各组小鼠跨越隐性平台的次数及朝向角的比较模型组与正常对照组相比小鼠跨越隐性平台的次数明显减少、朝向角（小鼠入水时游向与入水点跟平台连线的夹角）明显增大，差异有统计学意义（P<0.01）。给药组与模型组比较小鼠跨越隐性平台的次数增多、朝向角较小，差异有统计学意义（P<0.01）。给药组与正常对照组比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。见表5，图7、8。表5各组小鼠空间探索实验中穿越隐性平台的次数及初始角比较(n=7,与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，＊＊P<0.01结论HPYD鼻腔给药后经嗅路入脑，可以显著提高AD模型小鼠的学习记忆能力。在本申请中，引用了多种出版物。所提及的出版物通过引用的方式全文纳入本说明书中，以便更加详尽的叙述本发明所属技术领域的情况。对于本领域技术人员显而易见的是，只要不背离本发明的范围和精神，可对本发明进行各种修改和变动。通过考虑本发明在此所公开的说明书和实例，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书和实施例仅作示例性用途，本发明真正的范围和精神在所附的权利要求书中说明。