一种抗Mac‑2BP人源化抗体的制备的制作方法与工艺

一种抗Mac-2BP人源化抗体的制备技术领域本发明所涉及的是生物制药技术领域。本发明涉及一种抗癌细胞表达的Mac-2BP蛋白的人源化抗体，编码该抗体的多核苷酸，包含该多核苷酸的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞，以及它们在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术：
肿瘤是对人类威胁最大的恶性疾病之一，其死亡率在世界和我国的各种疾病中分别排在第二位和第三位，严重影响着人类的健康。临床治疗癌症的方法主要是手术切除和放、化疗，但这三大常规治疗手段并没有明显的降低肿瘤的死亡率，其5年生存率仅达10-30℅。近年来肿瘤的靶向治疗在临床中取得了令人鼓舞的结果，成为最有前景和最活跃的领域。针对特异表达于肿瘤的，并在肿瘤生长或转移中发挥重要作用的治疗靶点蛋白，采用各种靶向治疗剂特异地阻断干扰治疗靶点的生物学功能，从而发挥影响肿瘤生长转移的治疗作用，将可能有效地治疗恶性肿瘤。在肿瘤的各种靶向治疗药物中，最成功的是抗体类药物。抗体类药物因其特异性好、靶向性强、阻断靶点蛋白的效能高，近年来在治疗肿瘤的研究中已取得了突破性进展。Rituxan是1997年第一个获FDA批准上市的抗肿瘤抗体药物，用于治疗B细胞性非何杰金淋巴瘤。Herceptin于1998年获批准，主要用于HER-2/neu阳性的乳腺癌。Mylotarg(2000)用于治疗急性复发性髓性白血病。近年来，先后获批准用于治疗肿瘤的抗体药物还有Mylotarg、Campath-1H、Zevalin、Bexxer、Erbitux和Avastin等。目前，Rituxan与Herceptin已在临床肿瘤治疗中取得了巨大的成功。尽管目前抗肿瘤单抗药物所针对的肿瘤特异蛋白靶点已经有了几十种之多，例如：CD20(Grillo-LopezAJ.抗CD20的单抗：白血病的治疗的策略和结果.抗肿瘤治疗经验综述.2002；2:323-329；Grillo-LopezAJ.AntiCD20mAbs:modifyingtherapeuticstrategiesandoutcomesinthetreatmentoflymphomapatients.ExpertRevAnticancerTher.2002；2:323-329.)，Her2-neo(MendelsohnJ,BaselgaJ.EGF受体家族作为肿瘤靶向治疗的靶点.癌基因.2000；19:6550-6565；TheEGFreceptorfamilyastargetsforcancertherapy.Oncogene.2000；19:6550-6565.)，VEGF(SchwartzbergLS.Edrecolomab的临床经验：一种治疗结肠癌的单抗.抗肿瘤血液学的综述.2001；40:17-24；SchwartzbergLS.Clinicalexperiencewithedrecolomab:amonoclonalantibodytherapyforcolorectalcarcinoma.CritRevOncolHematol.2001；40:17-24.)，CD33，CD52，EGRFR，CD25，CO17-1A，CEA、CD22、GD2、EGFR、EGF、CD6、CD11a等，但对各种恶性肿瘤的临床治疗来说，抗肿瘤新靶点的靶向治疗药物仍然是远远不够的。由于肿瘤发生发展是一个多因素，多基因突变的过程，仅仅针对少量靶点的靶向治疗药物并不能非常有效地治疗肿瘤，而往往只能延缓这一过程；另外不同的肿瘤有不同的发病机理，具有不同的治疗靶点，需要有不同的靶向治疗药物，因此，肿瘤的临床治疗还需要更多的、针对不同治疗靶点的新药，以期协同发挥作用，更为有效地治疗肿瘤。本发明所涉及的单克隆抗体所识别的靶蛋白是细胞分泌蛋白Mac-2BP，也可能通过其相互作用蛋白出现在肿瘤细胞膜上。Mac-2BP基因定位于染色体17q25，Mac-2BP是一种天然分子量达几百万道尔顿的蛋白，它由许多分子量85-97kDa的亚单位构成，这些亚基在二元剪切位点对蛋白质裂解非常敏感。免疫印迹显示在人的血清、精液、唾液、眼泪以及尿液和母乳中均能检测到少量Mac-2BP的表达，基因克测序表明Mac-2BP的cDNA编码的成熟蛋白质由567个氨基酸构成，位于18个氨基酸组成的信号肽之后。成熟的Mac-2BP含有16个Cys和7个N-连接糖基化位点，位于N端的106个氨基酸与一种巨噬细胞清道夫受体富含Cys的结构域(SRCR)非常相似。Mac-2BP蛋白可以分成三个结构域，氨基端的清道夫受体富含Cys(SRCR)结构域(D1)、高度糖基化的粘蛋白样结构域(D2)和大约27kDa的羧基端结构域(D3)。研究表明Mac-2BP可与胶原Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、FN和巢蛋白结合，而不与纤维状胶原I、Ⅲ或者其它基底膜蛋白结合，Mac-2BP可以介导细胞与laminin的粘附。以往的研究表明Mac-2BP存在于血清或是细胞外基质当中，在大部分癌组织当中处于高表达水平，可作为一种可能非常有用的肿瘤血液标志物，Mac-2BP蛋白作为一种特异的肿瘤血清标志物已经得到大量临床资料的证实和学术界的公认，它在肺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、头颈癌、脑癌、白血病、黑色素瘤以及胰腺癌等多种常见恶性肿瘤中均特异升高，并且与肿瘤的恶性程度和不良预后密切相关，是一种非常有用的预测肺癌发生发展的指标。但是关于Mac-2BP在肿瘤发生发展中所起的功能作用却很少有研究报道，最近仅新发现部分Mac-2BP可能是一种lectin受体DCSIGN的配体，可能具有作为结肠癌标志物的潜力(NonakaM,MaBY,ImaedaH,etal.Dendriticcell-specificintercellularadhesionmolecule3-grabbingnon-integrin(DC-SIGN)recognizesanovelligand,Mac-2-bindingprotein,characteristicallyexpressedonhumancolorectalcarcinomas.JBiolChem.2011；286(25):22403-13.)。然而，本发明的前期研究(未发表)发现，Mac-2BP不仅在多种肿瘤特异高表达，而且通过抗体中和剂干扰阻断其功能可以显著抑制体内肿瘤的生长，抗Mac-2BP鼠单抗对Mac-2BP强表达的GLC-82、中等表达强度的A549和低表达的ANIP973这3种人肺癌裸鼠移植瘤模型的抑瘤率分别达到了60.14％-83.35％。因此，开发针对Mac-2BP的抗体药物将有可能为肿瘤临床治疗提供新靶点的靶向治疗新药。目前的业界已经成为公知，一种单克隆抗体的结合特异性及亲合力绝大部分程度上均是由抗体的轻链和重链超可变区(或称互补决定区，complementarydeterminantregion，简称CDR)的氨基酸序列决定的，任何具有相同CDR序列的单克隆抗体，其识别靶抗原的特异性、亲合力和所发挥的治疗作用基本相同。美国食品及药品监督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration，FDA)在其指导原则中认定，凡是具有相同互补决定区的同类型抗体属于同一种抗体，在临床治疗药物审批中按照同一种抗体处理。因此，在获得一种有临床治疗价值的抗体的CDR序列之后，业界很容易根据成熟、公知的现有各项技术将其非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相同生物活性的其它单克隆抗体。

技术实现要素：
本发明是基于所获得的一株具有与Mac-2BP蛋白特异性结合的亲本抗Mac-2BP鼠单克隆抗体，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其CDR区序列，构建了相应的人源化抗体及其真核细胞表达载体，并获得了表达并分泌该抗Mac-2BP人源化抗体的细胞株，生产纯化了该人源化抗体。本发明进一步证明了所述的人源化抗体除了具有与Mac-2BP蛋白、Mac-2BP阳性的肿瘤细胞结合的特异性外，还具有人源性，将可减少其人体应用时的毒副作用。本发明进一步采用动物移植瘤模型证明了所述的人源化抗体具有抑制Mac-2BP阳性肿瘤生长的能力，因此可用于制备Mac-2BP阳性恶性肿瘤的靶向治疗药物。因此，本发明主要涉及了以下几个方面：第一方面，本发明涉及一种抗Mac-2BP蛋白的人源化单克隆抗体，其中所述单克隆抗体由含有3个轻链可变区的轻链和含有3个重链可变区得的重链组成，其中所述3个轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1-3所示，所述3个重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4-6所示。本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的人源化抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。第二方面，本发明涉及一种具体的抗Mac-2BP人源化单克隆抗体，其中该抗Mac-2BP人源化抗体的轻链蛋白质氨基酸序列为SEQIDNO:7，重链蛋白质氨基酸序列为SEQIDNO:8。该单克隆抗体的轻链包含了SEQIDNO:1-3所示的CDR区，重链包含了SEQIDNO:4-6所示的CDR区。第三方面，本发明涉及编码第一方面或第二方面所述的单克隆抗体或其单克隆抗体变体的多核苷酸。本领域公知，即使改变核苷酸的序列，只要最后按照三联密码子遗传法则可翻译出含氨基酸序列SEQIDNO:1-3和氨基酸序列SEQIDNO:4-6的抗体蛋白质，均为编码该抗Mac-2BP人源化抗体的多核苷酸。所述的核酸为DNA。第四方面，本发明涉及一种表达载体，其中含有编码氨基酸序列SEQIDNO:1-3或SEQIDNO:4-6的多核苷酸，所述表达载体在真核细胞中表达。按照本领域内的公知和通用技术，只要知道所需表达的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列，业界人员很容易构建出可表达出该抗体的多种形式的表达载体。第五方面，本发明涉及一种具体的可表达抗Mac-2BP人源化单克隆抗体的表达载体，所述的表达载体为图2所示的pSRNC-Cκ-Mac-2BP或图6所示的pSRDC-Cγ1-Mac-2BP。第六方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含第五方面或第四方面所述的表达载体。第七方面，本发明涉及治疗有效量的第一或第二方面之一所述的抗体，或第三方面所述的核酸，或第四方面、第五方面所述的载体，或第六方面所述的宿主细胞在制备抗Mac-2BP阳性肿瘤的抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤选自细胞分泌表达Mac-2BP阳性的恶性肿瘤的组。根据第三方面所述的核酸可制备出第四方面、第五方面所述的载体，转染表达用的细胞后可制备出第六方面所述的宿主细胞用于最终生产第一或第二方面之一所述的抗体，该抗体可直接用于细胞分泌表达Mac-2BP阳性的恶性肿瘤的治疗。附图说明图1.采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增抗Mac-2BP鼠单抗9F10的VL、VH基因PCR产物。泳道1.鼠单抗VL基因PCR扩增空白对照产物；泳道2.鼠单抗VL基因PCR产物1；泳道3.鼠单抗VL基因PCR产物2；泳道4.鼠单抗VH基因PCR扩增空白对照产物；泳道5.鼠单抗VH基因PCR产物1；泳道6.鼠单抗VH基因PCR产物2；泳道7.分子量标准品,λDNA/HindIII。图2.扩增获得的9F10鼠单抗VL、VH基因的核苷酸序列、氨基酸序列及抗体可变区(抗体可变区(CDRs)用下划线表示)。SEQIDNO:1ArgAlaSerThrSerGlyAsnSerTyrLeuHis；SEQIDNO:2TyrAlaSerAsnLeuGlnSer；SEQIDNO:3LeuHisSerSerGlyTrpProLeuProThr；SEQIDNO:4SerTyrTrpMetSer；SEQIDNO:5AsnIleArgAsnAsnAlaAsnGlyTyrTyrSerAlaSerValPheLys；SEQIDNO:6ArgTyrTyrGlyGlyAspMetAspTyr。图3.设计的抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因的氨基酸序列(抗体可变区(CDRs)用下划线表示)。图4.抗Mac-2BP人源化单克隆抗体的完整氨基酸序列。SEQIDNO:7，轻链，恒定区为人抗体Cκ；SEQIDNO:8，重链，恒定区为人抗体Cγ1。图5.抗Mac-2BP人源化抗体轻链真核表达载体pSRNC-Cκ-Mac-2BP结构示意图。图中缩写如下，Pw，弱化的真核启动子；Neo，氨基糖苷磷酸转移酶(neo)基因；PhCMV-IE，人巨细胞病毒立早启动子及增强子；VLgene，带有前导肽序列及5’内含子端剪接位点序列的轻链可变区基因片段；Cκgene，人抗体轻链κ链恒定区基因片段；BGHpolyA，牛生长激素polyA加尾位点；Ap，氨苄抗性基因。图6.抗Mac-2BP人源化抗体重链真核表达载体pSRDC-Cγ1-Mac-2BP结构示意图。图中缩写如下，Pw，弱化的真核启动子；dhfr，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因；PhCMV-IE，人巨细胞病毒立早启动子及增强子；VHgene，带有前导肽序列及5’内含子端剪接位点序列的重链可变区基因片段；Cγ1gene，人抗体重链γ1链恒定区基因片段；BGHpolyA，牛生长激素polyA加尾位点；Ap，氨苄抗性基因。图7.采用免疫荧光分析抗Mac-2BP人源化抗体的抗原特异性。具体实施方式本发明所涉及的抗Mac-2BP人源化抗体基因的抗体CDR区来自于我们以往以人肺癌细胞免疫小鼠制备获得的一株鼠单克隆抗体9F10(未发表)，后经质谱鉴定，该鼠单抗的靶抗原为Mac-2BP。前期研究证明该鼠单克隆抗体可与Mac-2BP结合，动物体内抑瘤实验证明，采用该抗体干扰阻断Mac-2BP体内功能，可显著抑制体内人Mac-2BP阳性的肺癌裸鼠移植瘤的生长，抑瘤率达83.35％；治疗中动物体重未见显著下降，初步提示其治疗的毒副作用不明显或很低，将所有实验动物脏器进行组织切片HE染色，镜下观察对各脏器是否有毒副作用，结果所有动物的所有正常脏器均未见到病理改变，直接证明了该抗Mac-2BP抗体治疗人Mac-2BP阳性的恶性肿瘤具有很高的安全性，证明该抗Mac-2BP鼠单抗具有进一步开发作为抗肿瘤靶向治疗药物的重要价值，其人源化改造消除其鼠单抗的免疫原性毒性后有望用于临床有效地治疗肿瘤。定义单克隆抗体如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即包含除了可能以很小量存在的天然发生的突变之外是相同的各个抗体。单克隆抗体是针对单一靶位点的高度特异性的抗体。另外，与常规的(多克隆)抗体制备物(其典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体均针对靶上的一个单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势是可以通过杂交瘤培养而合成，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体得自基本上同质的抗体群的这一特征，而不是指需要通过任何特殊方法产生该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过使用熟知的技术分离自噬菌体抗体文库。根据本发明使用的亲代单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein,Nature256,495(1975)首先描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组方法产生。互补决定区(CDR)如本文所用，术语“互补决定区”是指结合分子如免疫球蛋白的可变区中的序列，其通常主要提供在形状和电荷分布方面与抗原上被识别的表位互补的抗原结合位点。CDR区可以特异于线性表位、不连续表位或者蛋白质或蛋白质片段的构象表位，这些表位以其天然构象存在于蛋白质上或者在一些情况中作为例如通过在SDS中增溶而变性的形式存在于蛋白质上。表位也可以由翻译后修饰的蛋白质组成。多核苷酸如本文所用，“多核苷酸”包括脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其具有天然核糖核苷酸的必需性质的类似物，只要其在严格杂交条件下，与天然核苷酸一样和基本上相同的核苷酸序列杂交和/或与天然核苷酸一样可以翻译成相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构或调节基因的全长或亚序列。除非特别指出，该术语包括特异的序列以及其互补序列。因此，本文中术语“多核苷酸”包含具有为了稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA。多肽本文中使用的术语“多肽”可与“肽”和“蛋白质”互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人造化学类似物，以及用于天然氨基酸聚合物。这种天然氨基酸的类似物的必需性质是当其掺入蛋白质中时，该蛋白质特异与由相同的但是完全由天然氨基酸组成的蛋白质引发的抗体反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，包括但不限于磷酸化、糖基化、脂质附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。特异性结合如本文所用，针对抗体与其结合配偶体例如抗原之间的相互作用而提及的术语“特异性结合”，是指所述相互作用依赖于结合配偶体上特定结构的存在，例如抗原决定簇或表位的存在。换句话说，甚至当所述结合配偶体存在于其它分子或生物体的混合物中时，所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。所述结合可以由共价或非共价相互作用或者这两种作用介导。再换句话说，术语“特异性结合”是指免疫特异性结合抗原或其片段及非免疫特异性结合其它抗原。免疫特异性结合抗原的结合分子可以以较低亲和性结合其它肽或多肽，根据例如放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或者本领域已知的其它测定法确定。免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段可以与相关抗原交叉反应。优选地，免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段与其它抗原不交叉反应。变体如本文所用，术语“变体”是指包含与亲代结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比改变了一或多个CDR区外的核苷酸和/或氨基酸的核苷酸序列和/或氨基酸序列但仍能竞争性结合亲代结合分子的结合配偶体例如Mac-2BP的结合分子。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可具有保守的序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如定点诱变和随机PCR介导的诱变，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守的氨基酸取代包括氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基置换。本领域已经明确了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。本领域技术人员清楚也可以应用除了上述之外的其它氨基酸残基家族分类。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如将氨基酸残基用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基置换。相似的小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或者这两者。确定氨基酸残基可以被取代、插入、或缺失而不消除其免疫学活性的指导可以使用本领域熟知的计算机程序发现。核苷酸序列中的突变可以是在基因座产生的单一改变(点突变)，如转换或颠换突变，或者可以在一个单基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核苷酸序列内的任意数目的基因座中产生一或多个改变。突变可以通过本领域已知的合适方法进行。人源化抗体非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2片段或者其它结合靶的亚序列)。一般而言，人源化抗体包含基本上全部的至少一个、通常为两个可变区，其中所有或者基本上所有CDR区域均相应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或者基本上所有FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体也可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的至少一部分免疫球蛋白恒定区。载体术语“载体”是指一种核酸分子，其中可以插入另一种核酸分子以用于将其导入宿主中以便其复制、在一些情况中表达。换句话说，载体能转运与其连接的核酸分子。克隆以及表达载体均涵盖在本发明所用术语“载体”中。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)及衍生自噬菌体或植物或动物(包括人)的病毒的载体。载体包含由指定宿主识别的复制起源，在表达载体情况中还包含由宿主识别的启动子及其它调节区。含有另一种核酸分子的载体通过转化、转染，或者通过利用病毒进入机制而导入细胞中。某些载体能在其被导入的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起源的载体可以在细菌中复制)。其它载体可以在导入宿主时整合进宿主基因组中，从而与宿主基因组一起复制。宿主如本文所用，术语“宿主”是指其中已经导入载体如克隆载体或表达载体的细胞。所述细胞可以是原核或真核生物体或细胞。应理解这个术语不仅是指特定对象细胞，也是指这种细胞的后代。由于突变或环境影响导致在后续的世代中可以发生某些修饰，因此这种后代实际上与亲代细胞不相同，但仍包括在本文所用术语“宿主”范围内。药物学可接受的赋形剂“药物学可接受的赋形剂”是指与活性分子如药物、活性物质(agent)或结合分子组合的用以制备合适或方便的剂量形式的任何惰性物质。“药物学可接受的赋形剂”是在应用剂量和浓度对于受体无毒性并且与包含药物、药剂或结合分子的配制品的其它成分相容的赋形剂。治疗有效量术语“治疗有效量”是指本发明所述抗体有效预防、改善和/或治疗癌症的量。治疗术语“治疗”是指用以治愈疾病或阻止或者至少延迟疾病进展的治疗性处理和预防措施。需要治疗的对象包括已经患有癌症以及需要防止癌症的对象。从癌症部分或全部痊愈的对象也需要治疗。预防包括抑制或减慢癌症进展或者抑制或降低与癌症相关的一或多种症状的发生、发展或进展。在本说明书中，术语“包含”是指包含所述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或者其它要素、整数或步骤组。首先，本发明提供了一种具有特定序列的可与Mac-2BP蛋白特异结合，并可特异识别细胞膜表面表达Mac-2BP蛋白的肿瘤细胞的单克隆抗体的CDR区序列。该CDR序列是通过扩增、克隆、分析一株具有肿瘤靶向性和体内治疗肿瘤作用的抗Mac-2BP鼠单抗的可变区基因得来的。已经成为本领域内的公知，单克隆抗体与抗原结合的特异性及亲合力均主要由其轻、重链的6个CDR序列决定，在获得完整的CDR序列的基础上，很容易根据成熟、公知的现有各项技术构建、生产具有完全相同的CDR序列的各种单克隆抗体变体，并且这些改造后的变体具有相类似的生物活性和治疗作用。因此，根据本发明所提供的特定的、完整的CDR氨基酸序列，本发明所涉及的发明内容可以通过以下方式实现。一方面，本发明提供一种抗Mac-2BP的人源化单克隆抗体，其特征在于中所述单克隆抗体的重链包含SEQIDNO1-3所示的CDR区，所述单克隆抗体的轻链包含SEQIDNO:4-6所示的CDR区，凡是具有以上特定的、完整的CDR序列的单克隆抗体将针对Mac-2BP的相同表位，并具有相类似的生物活性和治疗作用。另一方面，具体的，本发明还具体地提供一种特定的抗Mac-2BP人源化抗体，其中该抗抗体的轻链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQIDNO:7组成，重链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQIDNO:8组成。在本发明所述的具体实施例中，该抗Mac-2BP人源化抗体是一种具有特定的轻、重链氨基酸序列的重组单克隆抗体，由于该特定抗体的框架区及恒定区均来自于人，又可称为重组人源化抗体。在本申请中，术语“本发明的抗体”指的是本发明所述的抗Mac-2BP人源化单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的重链包含SEQIDNO:1-3所示的CDR区，所述单克隆抗体的轻链包含SEQIDNO:4-6所示的CDR区。而在具体实施例中，所述的抗Mac-2BP人源化抗体则是由上述抗体概念包含的、特定的、轻链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQIDNO:7组成，重链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQIDNO:8组成的一种特定完整序列的抗Mac-2BP人源化单克隆抗体，该特定抗Mac-2BP人源化单克隆抗体的完整序列是由本发明所提供的CDR区序列嵌入拼接到特定人抗体FR区序列和恒定区序列构成的。在另一个方面，本发明涉及编码本发明的抗体的核酸，其包含编码本发明的抗体多肽的多核苷酸或其互补序列。所述的核酸可为DNA。本领域公知，即使改变核苷酸的序列，只要最后按照三联密码子遗传法则可翻译出含氨基酸序列SEQIDNO:7和氨基酸序列SEQIDNO:8的抗体蛋白质，均为编码该抗Mac-2BP人源化抗体的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了可用于制备该抗Mac-2BP人源化抗体的重组表达载体，所述载体包含编码本发明的抗体的核酸。按照本领域内的公知和通用技术，只要知道所需表达的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列，业界人员很容易构建出可表达出该抗体的多种形式的表达载体。载体可衍生自质粒如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌体如λ、lambdoid、M13、Mu、P1、P22、Q、T-even、T-odd、T2、T4、T7等；植物病毒；或者动物病毒。载体可用于克隆和/或表达目的及基因治疗目的。包含与一或多种调节表达的核酸分子可操纵地连接的编码本发明的抗体的一或多种核酸分子的载体也包括在本发明内。载体的选择依赖于重组程序及使用的宿主。在宿主细胞中导入载体可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或电穿孔实现。载体可以自主复制或者可以与其已经整合进其中的染色体一起复制。优选地，所述载体含有一或多种选择标记。所述标记的选择可依赖于选择的宿主细胞，其对于本发明不是关键的并且已经为本领域技术人员所熟知。所述标记包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。具体地，本发明将编码该抗Mac-2BP人源化嵌合抗体的轻链和重链的多核苷酸分别重组克隆入含有真核启动子的两种载体中，并将所得的表达载体导入真核宿主细胞，通过筛选获得高产量表达本发明的抗体的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量其所分泌的该抗Mac-2BP人源化抗体蛋白，根据本领域公知的技术方法可以从中方便地提取并制备该抗Mac-2BP人源化抗体蛋白。在实施例中，所述表达载体分别是特定的含有该抗Mac-2BP人源化抗体基因和氨甲喋呤加压扩增表达选择标志基因(dhfr)并且可在中国仓鼠卵巢细胞中表达的载体pSRNC-Cκ-Mac-2BP和pSRDC-Cγ1-Mac-2BP。本发明还提供了含有一或多个拷贝的上述载体的宿主。所述宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。使用哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表达系统通常是是本发明优先考虑的。在实施例中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞CHO。具体地，本发明将pSRNC-Cκ-Mac-2BP和pSRDC-Cγ1-Mac-2BP导入真核宿主细胞CHO中，通过筛选获得高产量表达本发明的抗体的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量其所分泌的该抗Mac-2BP人源化抗体蛋白，根据本领域公知的技术方法可以从中方便地提取并制备该抗Mac-2BP人源化抗体蛋白。根据本发明的一个方面，该抗Mac-2BP人源化抗体蛋白可用于制备治疗人类Mac-2BP表达阳性肿瘤的药物。通过本发明的抗Mac-2BP人源化抗体可与肿瘤细胞膜表面的Mac-2BP蛋白特异结合，并且可以直接在体内发挥阻断Mac-2BP生物学功能的作用，从而抑制Mac-2BP表达阳性肿瘤在体内的生长，因此该抗体可用于直接制备抗Mac-2BP表达阳性肿瘤的靶向治疗抗体药物。已经成为领域内公知，在获得抗Mac-2BP人源化抗体蛋白的情况下，通过加入通用的适当的稳定剂、保护剂、pH调节剂、盐平衡剂、赋形剂等，即可制备成为可直接用于人体治疗的抗体药物。在实施例中，本发明的抗体可用于治疗Mac-2BP表达阳性的裸鼠移植肿瘤，在具体实施方案中，所采用是直肠结肠癌模型。所述抗Mac-2BP人源化嵌合抗体可以作为药物通过常规给药途径给予患者，所述的给药途径例如但不限于经胃肠外给药，例如经静脉、经输注、局部给药等。合适的剂量依赖于若干个参数，包括给药的方法和所治疗的对象及耐受程度。可以明确的是抗Mac-2BP人源化抗体能明显抑制Mac-2BP表达阳性的人结直肠癌的生长，并呈剂量依赖关系。本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。实施例实施例1抗Mac-2BP单克隆抗体基因的克隆、测序、分析采用基因克隆的方法，克隆抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的轻、重链可变区基因，并进行核苷酸序列分析。抗Mac-2BP鼠单克隆抗体可变区基因的扩增方法：鼠单克隆抗体杂交瘤细胞9F10总RNA的提取按Trizol试剂(Gibco公司)说明书进行，收集1×107鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，10000rpm离心1min，吸弃上清。加入1mlTrizol充分溶解细胞，室温静置3-5min后加入0.2ml氯仿，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心10min，转移上清约0.6ml在新的离心管中。加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置5-10min，4℃下12000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤一次，空气干燥，加入50μlddH2O溶解沉淀物。鼠单克隆抗体杂交瘤细胞cDNA第一条链的合成利用MMLV-反转录酶(Gibco公司)按照厂商提供的说明书进行：在20μl的体系中加入5×缓冲液4μl，10mMDDT(Promega公司)，10μg总RNA，终浓度0.5mM的dNTP(Promega公司)，终浓度10μg/ml的Oligod(T)15(Promega公司)，40uRNasin(Promega公司)，200u(U)MMLV-反转录酶(Gibco公司)，混匀。37℃水浴1h，沸水浴5min灭活反转录酶。鼠单克隆抗体轻重链可变区基因的扩增使用高精度DNA聚合酶Taq(Promega公司)+PfuDNA聚合酶(Promega公司)，在100μl的反应体系中含有：10×缓冲液10μl，10mMdNTP2μl，cDNA20μl，扩增引物各50pmol，混匀后表面覆盖石蜡油。95℃水浴5min后，透过石蜡油加入1-2u的Taq+PfuDNA聚合酶，开始以下循环，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，最后一个循环72℃10min。PCR引物：扩增轻链可变区用的引物：PVL5：5'-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3'；PVL3：5'-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'。扩增重链可变区用的引物：PVH5：5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(S＝C/G,M＝A/C,R＝A/G,W＝A/T)；PVH3：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'。采用0.7％非变性琼脂糖凝胶电泳分析从亲本抗Mac-2BP鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株中提取的总RNA，18SRNA和28SRNA大小正确，亮度比约1:2，泳道清晰。以Oligod(T)15为引物合成cDNA第一条链，并以此cDNA为模板，采用轻链引物PVL5、PVL3进行PCR，扩增出320bp大小左右的轻链可变区基因片段；采用重链引物PVH5、PVH3进行PCR，扩增出360bp大小左右的重链可变区基因片段；未加模板的空白对照无扩增带(图1)。扩增出的可变区基因片段大小与一般抗体可变区基因的大小相符。抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的轻、重链可变区基因的克隆、测序、基因结构分析：大量扩增抗Mac-2BP鼠单克隆抗体轻链可变区基因片段，采用玻璃奶吸附法分离回收后以PvuII和BglII双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWL的相应位点，共有341个转化克隆，随机挑取24个克隆筛选，获得7个重组克隆。选取3个VL基因重组克隆进行核苷酸序列分析，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列如图2所示，3个克隆的序列完全相同，说明所克隆的抗体轻链可变区基因确实为真正的抗Mac-2BP鼠单克隆抗体轻链可变区基因。从这3个克隆中随机挑选一个克隆命名为pRGWL-M1。与Kabat的数据比较可知，抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的VL轻链CDR1-3序列(SEQIDNO:1-3)如图2中所示。大量扩增抗Mac-2BP鼠单克隆抗体重链可变区基因片段，采用玻璃奶法分离回收后以PstI和BstEII双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWH的相应位点，共有389个转化克隆，随机挑取24个克隆筛选，获得16个重组克隆。选取3个VH基因重组克隆进行核苷酸序列分析，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列如图2，3个克隆的序列完全相同，证明所克隆的抗体重链可变区基因确实为真正的抗Mac-2BP鼠单克隆抗体重链可变区基因，从中随机挑选一个克隆命名为pRGWH-M1。与Kabat的数据比较可知，抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的VH重链CDR1-3序列如图2中所示(SEQIDNO:4-6)。具体地，SEQIDNO:1-6的序列为:SEQIDNO:1ArgAlaSerThrSerGlyAsnSerTyrLeuHis；SEQIDNO:2TyrAlaSerAsnLeuGlnSer；SEQIDNO:3LeuHisSerSerGlyTrpProLeuProThr；SEQIDNO:4SerTyrTrpMetSer；SEQIDNO:5AsnIleArgAsnAsnAlaAsnGlyTyrTyrSerAlaSerValPheLys；SEQIDNO:6ArgTyrTyrGlyGlyAspMetAspTyr。实施例2抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的人源化抗体基因及表达载体的构建采用基因合成的方法，将抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的可变区基因的框架区替换为人抗体的框架区，采用全合成法合成抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因片段，重组入含有调控序列和人抗体恒定区基因的载体中，构建抗Mac-2BP人源化抗体的完整基因及包含所述基因的真核表达载体。抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因的合成：以发表的人源化4D5单抗的可变区为模板，采用CDR移植法，将其CDR区替换为相应的9F10单抗的CDR区，保留两端的酶切克隆位点序列，所设计的抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的人源化抗体可变区基因所翻译的氨基酸序列如图3所示，轻、重链基因采用分段合成+重叠PCR连接法，通过商业公司直接合成，采用实施例1的相同方法，PCR扩增抗Mac-2BP鼠单克隆抗体的人源化抗体的轻、重链可变区基因后回收产物酶切，重新克隆回pRGWL和pRGWH载体，测序鉴定克隆序列与原设计的序列相同，分别挑取1个克隆命名为pRGWL-hM1和pRGWH-hM1，作为下面扩增构建表达载体的模板。通过PCR扩增带调控序列的可变区基因片段：以经测序鉴定过的实施例1中所获得的重组克隆质粒pRGWL-hM1和pRGWH-hM1为模板，使用含两端克隆位点BamHI和NotI酶切位点的引物PVLS、PVNP(轻链)和PVHS、PVNP(重链)，采用PCR技术，扩增带有引导肽和5'-端剪接位点的人源化的VL和VH。通过PCR反应从轻链的重组质粒中扩增出带有引导肽和5'-端剪接位点的人源化的VL片段，大小约500bp；从重链的重组质粒中扩增出带有引导肽和5'-端剪接位点的人源化的VH片段，大小约700bp。具体地，使用高精度DNA聚合酶Taq+PfuDNA聚合酶，其中在100μl的反应体系中含有：10×缓冲液10μl，10mMdNTP2μl，质粒(pRGWL-hD1或pRGWH-hD1)1μg，扩增引物(PVLS、PVNP(轻链)和PVHS、PVNP(重链))各50pmol，混匀后表面覆盖石蜡油。95℃水浴5分钟后，透过石蜡油加入1-2u的Taq+PfuDNA聚合酶，开始以下循环，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共20个循环，最后一个循环72℃10分钟。扩增引物：PVLS:5'-CTCGGAATTCGGATCCATGGGATGGAGCTGTATCATCC-3'PVHS:5'-GGTCCAGCTTGCGGCCGCAACTGAGGAAGCAAAGTTTAAATTCTACTCACGTTTGATCACCA-3'PVNP:5'-GGTCCGAATTCGCGGCCGCTATAAATCTCTGGCCATGAAG-3'抗Mac-2BP人源化抗体真核表达载体的构建和鉴定：上述PCR产物采用玻璃奶法分离回收后以BamHI和NotI酶切。按《分子克隆》所述进行常规DNA重组操作，将VL克隆入pSRNC-Cκ，VH克隆入pSRDC-Cγ1中的相应位点，构建成完整的抗Mac-2BP人源化抗体基因的真核表达载体。在分别将VL和VH连入表达载体pSRNC-Cκ和pSRDC-Cγ1后，分别挑取12个克隆进行筛选，经酶切鉴定得到9个轻链和10个重链重组克隆。经BamHI和NotI酶切后可切出相应的VL、VH片段，证明构建成功完整的抗Mac-2BP人源化单克隆抗体基因及其真核表达载体。经2次重复的核苷酸序列测定证明，抗Mac-2BP人源化单克隆抗体真核表达载体pSRNC-Cκ-Mac-2BP和pSRDC-Cγ1-Mac-2BP中的可变区基因序列分别与原设计的人源化可变区基因序列完全相同。该套表达载体产κ的抗Mac-2BP人源化单克隆抗体的氨基酸序列如图4的SEQIDNO:7(轻链，恒定区为人抗体Cκ)和SEQIDNO:8(重链，恒定区为人抗体Cγ1)所示。SEQIDNO:7(轻链序列)如下：SEQIDNO:8(重链序列)如下：抗Mac-2BP人源化单克隆抗体真核表达载体的结构：抗Mac-2BP人源化单克隆抗体真核表达载体分别采用了轻链真核表达载体(pSRNC-Cκ-Mac-2BP)和重链真核表达载体(pSRDC-Cγ1-Mac-2BP)这2个轻、重链的表达载体，其结构示意图如图5，6所示。实施例3抗Mac-2BP人源化抗体表达载体转染CHO细胞进行表达CHO-dhfr-细胞(本室保存)采用含10％FBS、0.03mmol/l次黄嘌呤(H)、0.003mmol/l胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0.1mmol/l脯氨酸(Pro)、0.1mmol/l甘氨酸(Gly)、100u/ml青链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM完全培养液在5％CO2、37℃的条件下培养，常规按1:10传代，大约3-4天传一代。上述细胞培养试剂购自Gibco公司。采用基因转染的方法，用LipofectAMINE试剂(Gibco公司)转染，将抗Mac-2BP人源化抗体的轻、重链表达载体共转染细胞，并采用不含H、T、Gly的培养基培养进行筛选，待克隆形成后再采用含200μg/ml的G418(Gibco公司)的选择培养基培养进行筛选。结果，各取4μg轻、重链抗体基因表达载体转染CHO-dhfr-细胞，约10天后可见克隆生长，计数共约633个克隆。以用山羊抗人κ链多克隆抗体包被，山羊抗人IgG-HRP为二抗的间接ELISA法测得抗性克隆混合物培养上清OD490＝1.899，而阴性对照CHO-dhfr-上清OD490仅为0.071，表明转染细胞的上清中有抗Mac-2BP人源化抗体的表达。实施例4加压扩增表达，筛选抗Mac-2BP人源化嵌合抗体高表达株转染后的CHO细胞采用含10％FBS、100u/ml青链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM(Gibco公司)完全培养液在5％CO2、37℃的条件下培养，常规按1:10传代，大约3-4天传一代。采用氨甲喋呤(MTX)加压扩增表达筛选方法，筛选高表达株。上清中有抗Mac-2BP人源化抗体的表达的细胞克隆依次采用含3×10-8M和10-7M的氨甲喋呤(MTX)(Sigma公司)的完全培养基培养，进行加压扩增表达，每轮加压扩增表达后均采用有限稀释法进行亚克隆，筛选最高产量的克隆。将抗Mac-2BP人源化抗体表达载体转染CHO-dhfr-细胞后初次筛选获得的高效表达抗Mac-2BP人源化抗体的克隆10E4(抗体的产量可达0.21μg/ml)采用含3×10-8M的氨甲喋呤(MTX)(Sigma公司)的培养基培养，连续培养约30天后，观察细胞形态和生长速度恢复正常，已适应3×10-8M的MTX，抗体表达产量为10.1μg/ml，亚克隆后筛选出抗体产量最高的克隆7H3，其抗体的产量可达16.8μg/ml。克隆7H3继续在1:5传代后换含10-7MMTX的完全培养基培养，细胞适应后，抗体的产量可达39.4μg/ml，亚克隆后筛选出抗体产量最高的克隆5D4，其抗体的产量经检测就可达86.4μg/ml以上。实施例5抗Mac-2BP人源化抗体的特异性、人源性的鉴定(1)抗Mac-2BP人源化抗体的特异性鉴定：采用ELISA方法，以1μg/ml重组Mac-2BP蛋白包被酶标板，加样品反应后，再加羊抗人IgGFc片段-HRP酶标抗体(Sigma公司)(不与鼠Ig交叉反应)或羊抗鼠IgGFc片段-HRP酶标抗体(Sigma公司)(不与人Ig交叉反应)孵育，显色，测OD490值。从克隆5D4细胞上清中采用蛋白A亲和层析柱纯化的抗Mac-2BP人源化抗体可与包被的重组Mac-2BP蛋白结合，并被羊抗人IgGFc片段多克隆抗体所识别，呈现强阳性反应，而未转染CHO-dhfr-细胞培养上清和亲本鼠单克隆抗体9F10则呈阴性反应。在以羊抗鼠IgGFc片段-HRP作二抗时，则未转染CHO-dhfr-细胞培养上清和纯化的抗Mac-2BP人源化抗体均呈阴性，而亲本鼠单克隆抗体9F10则呈阳性反应。无关抗体人IgG1均为阴性。证明所表达的抗Mac-2BP人源化抗体可与重组Mac-2BP蛋白特异结合。表1.直接ELISA分析抗Mac-2BP人源化抗体的抗原结合特异性a,利用羊抗人IgGFc片段-HRP作为第二抗体。b,利用羊抗小鼠IgGFc片段-HRP作为第二抗体采用免疫荧光试验，以Mac-2BP高表达的人肺癌细胞Glc-82(购自中国医学科学院基础所细胞中心)的固定化细胞为靶细胞，加入抗Mac-2BP人源化抗体(10μg/ml)，37℃孵育后再加入羊抗人IgG-荧光二抗(Sigma公司)，反应后荧光显微镜下观察，同时设无关抗体对照。结果如图7显示，抗Mac-2BP人源化抗体可以识别Mac-2BP高表达的人肺癌细胞Glc-82所表达的Mac-2BP蛋白。(2)抗Mac-2BP人源化抗体的人源性鉴定：在ELISA实验中，用羊抗人κ链(Sigma公司)或羊抗人IgG多克隆抗体(Sigma公司)包被酶标板，以羊抗人IgGFc片段-HRP(Sigma公司)作酶标抗体的ELISA结果(表2)显示，纯化的抗Mac-2BP人源化抗体呈现强阳性反应，而抗Mac-2BP人源化抗体的亲本鼠单克隆抗体9F10则呈阴性反应。证明纯化的抗Mac-2BP人源化抗体含有人IgG的轻、重链恒定区。表2.通过ELISA检测抗Mac-2BP人源化抗体的人源性a,用羊抗人IgG包被。b,用羊抗人κ链包被实施例6抗Mac-2BP人源化抗体制备治疗药物用于体内治疗Mac-2BP表达阳性的人裸鼠移植肿瘤在荷人Mac-2BP表达阳性人肺癌细胞Glc-82移植瘤的小鼠(所述裸鼠右侧背部皮下注射100万Glc-82)体内进行抗Mac-2BP人源化抗体体内治疗人肺癌肿瘤的有效性研究，肿瘤接种后第3天开始腹腔给药治疗，抗Mac-2BP人源化抗体体内治疗分为3个剂量组，3mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重，同时设立PBS和30mg/kg体重人IgG对照组，每周给药2次。结果如表3所示，抗Mac-2BP人源化抗体可在体内显著抑制人Mac-2BP表达阳性的人肺癌的生长，并呈现明显的剂量依赖关系。与治疗同时进行的各实验动物血相分析及体重变化的初步毒理学研究表明，抗Mac-2BP人源化抗体体内治疗人结肠癌时，其血相各成分及小鼠体重在实验组和对照组之间均无显著差异，证明抗Mac-2BP人源化抗体并无明显的体内毒性。表3.抗Mac-2BP人源化抗体对人Mac-2BP表达阳性人肺癌细胞Glc-82的瘤重抑瘤率。