一种猪圆环病毒2型的LAMP可视化快速检测试剂盒的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型的lamp可视化快速检测试剂盒，更具体涉及一种检测猪圆环病毒2型的lamp引物、检测方法及其lamp可视化快速检测试剂盒。

背景技术：

猪圆环病毒2型(pcv2)属于圆环病毒科圆环病毒属，为单股负链环状dna病毒，无囊膜，是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(pmws)的主要病原。目前该病在世界范围内广泛流行，使养猪生产遭受到重大的经济损失。此外，pcv2还与猪的传染性先天性震颤肉芽肿性肠炎皮炎、肾病综合征猪呼吸综合征猪繁殖障碍渗出性表皮炎和坏死性淋巴结炎等疾病有相关性。

国内外pcv2现有常用诊断技术主要包括：临床诊断、病原诊断、血清学诊断，分子生物学诊断等。临床诊断主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病种类，难以做到确诊。病原分离是最经典和可靠的病原诊断方法，特异性高，可直接确诊，但病毒分离所需时间较长，成本较高。

血清学诊断技术主要包括：血清中和试验(neutralizationtest,nt)、凝集性试验(agglutinationtest,at)、荧光抗体技术(fluorescent-labelledabtibodytechnic,fa)、酶联免疫吸附试验(elisa)、斑点金免疫渗滤法、胶体金免疫层析法(colloidalgoldimmimochromatographyassay,cgica)等。应用最多的血清学方法主要是elisa，该方法具有灵敏、特异性强、快速、简便等特点，常被用于大规模的血清学检查，且目前己经建立了检测pcv2的elisa方法。但，由于pcv2已经在猪场广泛存在，所以elisa的检测结果不能作为判定猪群发生猪圆环病毒相关疾病的决定性依据。

分子生物学诊断技术包括聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)、反转录-聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechain reaction,rt-pcr)、实时荧光定量pcr(real-timefluorescencequantitativepcr,fq-pcr)、实时荧光定量rt-pcr(real-timefluorescencequantitativert-pcr,rq-rt-pcr)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术、依赖于核酸序列扩增(nucleicacidsequence-basedamplification,nasba)技术、核酸探针技术、基因芯片检测技术等。核酸探针技术特异性强，准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定，但诊断费用较高。基因芯片包括cdna芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片等，主要目标是用于dna序列的测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。它们都是比较理想的检测方法，但是也存在耗时费力、设备要求特殊等局限性。

lamp技术是在2000年由日本学者notomi等发明的一种恒温扩增方法，它通过针对靶基因的6个区域而设计4条特异性引物，只有在引物与靶序列结合扩增反应才能进行，特异性很高。在等温条件下(60-65℃)利用链置换dna聚合酶催化几十分钟就可扩增出109靶序列拷贝。相对于传统核酸扩增方法，lamp法扩增克服了需要昂贵仪器的特点，整个检测过程在等温条件下只需1-2h就可完成；且具有很高的敏感性和特异性。该技术自产生之后已经在转基因食品检测、动物疫病诊断及动物胚胎的性别鉴定等领域得到的广泛的推广及应用。

lamp方法原理复杂，但实际操作简单。因此，建立lamp快速诊断方法有利于疫病的监测和控制，同时特别适合基层、养殖户及出入境检疫的病原快速检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型的lamp可视化快速检测试剂盒，在猪圆环病毒2型(pcv2)特异性检测中，使用lamp检测试剂盒完成对pcv2的特异性检测，通过反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有pcv2。

为达到上述目的，本发明的主要技术方案是：

一种检测猪圆环病毒2型的lamp引物，具体是根据猪圆环病毒2型(pcv2)orf2基因序列3’端的f3c、f2c和flc区以及5’端的bl、b2 和b3区设计4条特异性引物：上游内部引物fip、上游外部引物f3、下游内部引物bip、下游外部引物b3，以及设计一对环引物：lf和lb，具体序列如下所示：

f3：5’-cacttcgtaatggtttttattattta-3’；

b3：5’-tccactattgattacttccaac-3’；

fip：5’-caggaatacaatatccgtgtaaccattttggttaagtggggggtctt-3’；

bip：5’-gaggcctacgtggtctacatttttcaaacaacaaaagaaatcagctatg-3’；

lf：5’-aaccatgtatgtacaattcagagaatttaatc-3’；

lb：5’-ttccagcagtttgtagtctcagc-3’；

一种含有上述6条特异性引物的猪圆环病毒2型的lamp可视化快速检测试剂盒。

本发明所述lamp可视化快速检测试剂盒，还包含lamp反应体系，按反应总体积为25μl为例，包含：ddh2o4.5μl，1×dntp3.0μl，10×buffer2.5μl，引物fip2μl，引物bip2μl，引物f30.5μl，引物b30.5μl，引物lf2μl，引物lb2μl，甜菜碱4μl，模板1μl，bst酶1μl。

一种检测猪圆环病毒2型的lamp方法，其包括如下步骤：

1)提取待测样品总dna作为反应模板；

2)配制lamp检测体系：按反应总体积为25μl为例，包含：ddh2o4.5μl，1×dntp3.0μl，10×buffer2.5μl，引物fip2μl，引物bip2μl，引物f30.5μl，引物b30.5μl，引物lf2μl，引物lb2μl，甜菜碱4μl，bst酶1μl；

3)取1μl步骤1)提取的样品总dna加入到步骤2)配制的lamp检测体系中，混匀，放入pcr仪进行pcr反应，pcr反应程序为：59℃45min，80℃3min；

4)步骤3)pcr反应结束后，向反应物中加入sygree1染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有猪圆环病毒2型；不发生颜色变化的样品为阴性，不含猪圆环病毒2型。

进一步，所述lamp检测体系的配制过程为：

1)将ddh2o4.5μl，1×dntp3.0μl，10×buffer2.5μl，引物fip2μl，引物bip2μl，引物f30.5μl，引物b30.5μl，引物lf2μl，引物lb2μl，甜菜碱4μl加入离心管中，涡旋混匀，瞬离；

2)将步骤1)离心后得到的混合物在95℃水浴锅中加热5min；再放置冰上冰浴5min；

3)将1μlbst酶添加到离心管中，搅拌均匀即得到lamp检测体系。

本发明的有益效果：

本发明根据猪圆环病毒2型(pcv2)orf2基因序列，设计合成3对引物，通过对lamp条件的优化，以及敏感性、特异性试验，建立猪圆环病毒2型的lamp诊断方法，为猪圆环病毒2型的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，该方法具有反应条件简单、结果读判方便、敏感性高、特异性强、快速等优点。

本发明的优势还在于已经将这种lamp检测方法研制成试剂盒，并进行推广应用。本发明所提供的pcv2的lamp可视化快速检测试剂盒，操作简单，且直接通过产物加入荧光染料后的颜色变化进行判定，实现了可视化，反应结果易判定，非常易于临床推广。

附图说明

图1为本发明实施例1中lamp扩增中第1扩增阶段示意图。

图2为本发明实施例1中lamp扩增中第2扩增阶段示意图。

图3为本发明实施例4中lamp检测试剂盒检测的可视化结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1检测猪圆环病毒2型的lamp引物设计

本发明根据genbank中的猪圆环病毒2型(pcv2)orf2基因序列上6个不同区域(3’端的f3c、f2c和flc区以及5’端的bl、b2和b3区) 设计4条特异性引物，以及根据靶基因设计一对环引物：lf和lb，具体序列如表1所示。

表1

本发明所述fip引物为上游内部引物(forwardinnerprimer)，由f2区和f1c区域组成，f2区与靶基因3’端的f2c区域互补，f1c区与靶基因5’端的flc区域序列相同。f3引物为上游外部引物(forwardouterprimer)，由f3区组成，并与靶基因的f3c区域互补。bip引物为下游内部引物(backwardinnerprimer)，由b1c和b2区域组成，b2区与靶基因3’端的b2c区域互补，b1c域与靶基因5’端的blc区域序列相同。b3引物为下游外部引物(backwardouterprimer)，由b3区域组成，和靶基因的b3c区域互补。

本发明利用6条特异引物依靠一种高活性链置换dna聚合酶，使得链置换dna合成在不停地自我循环，扩增分两个阶段，lamp扩增方法原理图如图1-图2所示：

第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链dna的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物fip的f2序列首先与模板f2c区域结合，如图1所示，在链置换型dna聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物f3与模板f3c区域结合并延伸，置换出完整的fip连接的互补单链，如图1所示。引物fip上的f1c区域与此单链上的fl区域为互补结构，自我碱基配对形成环状结构，以此 链为模板。下游引物bip与b3先后启动类似于fip和f3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的fl区段为起点.以自身为模板，进行dna合成延伸形成茎环状结构，该结构是lamp基因扩增循环的起始结构，如图1所示。

第2阶段是扩增循环阶段，如图2所示：以茎环状结构为模板，引物fip与茎环的f2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的b1区段为起点，以自身为模板，进行dna合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的dna，bip引物上的b2区域与其杂交，启动新一轮扩增，且产物dna长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物lf和lb，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度dna的混合物，且产物dna为扩增靶序列的交替反向重复序列。

实施例2猪圆环病毒2型的lamp快速检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品总dna作为反应模板。

2)配制lamp检测体系：反应总体积为25μl，包含：ddh2o4.5μl，1×dntp3.0μl，10×buffer2.5μl，引物fip2μl，引物bip2μl，引物f30.5μl，引物b30.5μl，引物lf2μl，引物lb2μl，甜菜碱4μl，bst酶1μl，检测体系的具体配制如下：

将除了bst酶之外的物质加入1.5ml离心管中，涡旋混匀，瞬离；将离心后的混合物在95℃水浴锅中加热5min，再放置冰上冰浴5min。把1μlbst酶加到离心管里，使用漩涡混合器将离心管里的各种物质搅拌均匀，然后放在离心机上进行瞬时离心，得到lamp检测体系。

3)取1μl步骤1)提取的样品总dna加入到步骤2)配制的lamp检测体系中，混匀，放入pcr仪进行pcr反应，pcr反应程序为：59℃45min，80℃3min；

4)判定：步骤3)pcr反应结束后，向反应物(经验证：扩增产物片段长度是223bp)中加入1μl的sygree1染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有猪圆环病毒2型；不发生颜色变化的样品为阴性，不含猪圆环病毒2型。

实施例3猪圆环病毒2型的lamp可视化快速检测试剂盒的组装

1、包装规格：200次

2、试剂盒组成如表2：

表2

*：内含buffer、dntpmix和甜菜碱。

3、运输及保存方法：

低温运输，短期使用放至4℃避光保存，长期保存请置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。

4、使用注意事项：

(1)全部的物品，凡是接触过病毒材料的，都需要合理处理，为了不让其把实验室给污染，弄脏，对人员造成不利影响。

(2)把整个实验分区域进行操作。严禁器材和试剂倒流。

(3)显色剂低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套。

(4)注意不要让试剂盒中的各个成分受到污染。

(5)操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。严格遵守操作说明可以获得最好的结果。

实施例4猪圆环病毒2型的lamp可视化快速检测试剂盒的使用

第一房间里放置除模板外的其余试剂，如buffer、引物、探针、双蒸水等等，不放置阳性参照等pcr反应模板。首先在第一房间里完成总体系的配置，具体是将除bst酶和模板外的其余物质加入1.5ml离心管中，涡旋混匀，瞬离，然后将配置好的总体系分为阴性对照所需量和阳性对照所需量，阳性对照所需量放置在冰上先不进行操作。在阴性对照所需量中加入相应的阴性对照模板(ddh2o)，涡旋混匀，瞬离，将该混合物在95℃水浴锅中加热5min，再放置冰上冰浴5min；把bst酶加到离心管里，使用漩涡混合器将离心管里的各种物质搅拌均匀，然后放在离心机上进行短暂的离心。将离心后的反应体系分装在pcr管中，每管25μl。至此，该组操作结束，把盖子盖紧，放入pcr仪里进行反应，pcr程序：59℃45min，80℃3min。

将在第一房间里配置好的阳性对照所需量带入第二房间，然后加入相应的阳性模板，可将每种阳性对照模板三次量先放在一个离心管中，使用漩涡混合器将离心管里的各种物质搅拌均匀，然后放在离心机上进行短暂的离心。将这个混有很多物质的离心管在95℃水浴锅中加热5min，再放置冰上冰浴5min；把bst酶加到管子里，使用漩涡混合器将管里的各种物质搅拌均匀，然后放在离心机上进行短暂的离心；最后分装在pcr管中，每管25μl。至此，这组操作结束，把盖子盖紧，放入pcr仪里进行反应。pcr程序：59℃45min，80℃3min。

反应结束后，将上述两个pcr仪里的产物带入第三房间，开盖，向每管反应物里加入1μl的sygree1染料，观察颜色变化。

阳性反应管颜色变为绿色，阴性反应管不发生颜色变化，仍为橘红色，显色结果如图3所示。

由此可见，本发明研制的猪圆环病毒2型的lamp检测试剂盒直接通过颜色变化进行判定，实现了可视化，反应结果易判定，非常易于临床推广。