检测人类EGFR基因突变的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒。
背景技术：
：肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80～85％的患者为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancers，NSCLC)在所有的肿瘤类别中，肺癌发病率和死亡率在我国高居第一，其中以表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)为靶点的酪氨酸激酶抑制剂在非小细胞肺癌治疗中日渐突出(2,3)。EGFR作为癌症治疗的靶点，靶向药物主要有两类：一类是作用于受体胞内的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitorTKI)主要包括吉非替尼、埃罗替尼、EKB-569,PKI-166,GW-2016及CI-1033；另一类是作用于受体胞外区的单克隆抗体(MAb)，包括西妥昔单抗(cetuximab),ABX-EGF及EMD72000。这些药物通过阻断EGFR的活性抑制其磷酸化和信号传导，从而起到抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，主要集中在18-21外显子上。因此，建立快速检测NSCLC瘤组织EGFR基因突变的方法，有助于筛选患者进行治疗。目前，突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，可检测出样品中含量低至0.1-1.0％的突变基因；该方法在设计上使PCR的引物之一或者两个引物被设计成在序列变异的位点处退火，使其能够区分同一基因的不同等位基因，这些等位基因类型包括碱基的替换、插入和缺失。使引物的3’端碱基与突变模板完全匹配，而野生型模板由于3’端碱基错配导致延伸困难，PCR扩增减少，因此很容易通过检测区分突变。为了增强ARMS技术的特异性，有时候会在ARMS引物3’-末端起第2或第3个碱基位置加入错配，以抑制野生型模板的扩增，因此ARMS技术具有很好的SNP检测能力；可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点；该方法结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物的污染。但是在实际应用中仍存在着以下限制性及不足之处：①有时即使在引物3’端的第2、3位引入错配碱基，但是仍然避免不了野生型及其他突变型的干扰；②样本选择肿瘤病人的血液时，由于突变基因含量较低，血液中含有的干扰成分较多会直接影响到分析结果；③若突变的位点为弱错配碱基序列，该方法的特异性将受到影响。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，可以精确检测18号外显子上是哪种单碱基发生突变，并且主要适用于外周血的样本检测。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测EGFR基因18号外显子G719S突变的引物对A1和探针B1、用于检测EGFR基因18号外显子G719C突变的引物对A2和探针B2以及用于检测EGFR基因18号外显子G719A突变的引物对A3和探针B3，其中，引物对A1由5′-TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA-3′(SEQIDNO：1)所示的上游引物、5′-GGGTCAGCACTTTGATCTTTTTGAA-3′(SEQIDNO：2)所示的竞争引物和5′-GATGATGGAAATATACAGCTTGC-3′(SEQIDNO：3)所示的下游引物组成，探针B1为5′-ACCTTACCTTATACACCGTGCCGAACG-3′(SEQIDNO：4)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的GGG尾巴。引物对A2由5′-TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT-3′(SEQIDNO：5)所示的上游引物、5′-CCCACAGCACTTTGATCTTTTTGAA-3′(SEQIDNO：6)所示的竞争引物和5′-GATGATGGAAATATACAGCTTGC-3′(SEQIDNO：3)所示的下游引物组成，探针B2为5′-ACCTTACCTTATACACCGTGCCGAACG-3′(SEQIDNO：4)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的CCC尾巴。引物对A3由5′-TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC-3′(SEQIDNO：7)所示的上游引物，5′-GGGGCCAGCACTTTGATCTTTTTGAA-3′(SEQIDNO：8)所示的竞争引物和5′-GATGATGGAAATATACAGCTTGC-3′(SEQIDNO：3)所示的下游引物组成，探针B3为5′-ACCTTACCTTATACACCGTGCCGAACG-3′(SEQIDNO：4)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的GGG尾巴。优选的，所述试剂盒还包含用于检测EGFR基因20号外显子T790M突变的引物对A4和探针B4以及用于检测EGFR基因20号外显子S768I突变的引物对A5和探针B5，其中，引物对A4由5′-CACCGTGCAGCTCATCAT-3′(SEQIDNO：9)所示的上游引物、5′-CCCATGATGAGCTGCACGGTG-3′(SEQIDNO：10)所示的竞争引物和5′-AGTTGAGCAGGTACTGGGAGC-3′(SEQIDNO：11)所示的下游引物组成，探针B4为5′-TGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCA-3′(SEQIDNO：12)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的CCC尾巴。引物对A5由5′-AGCCTACGTGATGGCCAT-3′(SEQIDNO：13)所示的上游引物、5′-CCCATGGCCATCACGTAGGCT-3′(SEQIDNO：14)所示的竞争引物和5′-AGTTGAGCAGGTACTGGGAGC-3′(SEQIDNO：11)所示的下游引物组成，探针B5为5′-TGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCA-3′(SEQIDNO：12)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的CCC尾巴。优选的，所述试剂盒还包含用于检测EGFR基因21号外显子L858R突变的引物对A6和探针B6以及用于检测EGFR基因21号外显子L861Q突变的引物对A7和探针B7，其中，引物对A6由5′-CAAGATCACAGATTTTGGGCG-3′(SEQIDNO：15)所示的上游引物、5′-CGGCGCCCAAAATCTGTGATCTTG-3′(SEQIDNO：16)所示的竞争引物和5′-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGC-3′(SEQIDNO：17)所示的下游引物组成，探针B6为5′-ACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAA-3′(SEQIDNO：18)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的CGG尾巴。引物对A7由5′-TTTTGGGCTGGCCAAACA-3′(SEQIDNO：19)所示的上游引物、5′-CGCTGTTTGGCCAGCCCAAAA-3′(SEQIDNO：20)所示的竞争引物和5′-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGC-3′(SEQIDNO：17)所示的下游引物组成，探针B7为5′-ACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAA-3′(SEQIDNO：18)所示的Taqman探针；竞争引物5′端的下划线部分表示加入的CGC尾巴。优选的，所述试剂盒还包含用于检测β-actin内参基因的引物对A8和探针B8，其中，引物对A8由5′-TGCCAAGGCACGAGTAACAAG-3′(SEQIDNO：21)所示的上游引物和5′-TCCAAATTCCCAAGGACCAC-3′(SEQIDNO：22)所示的下游引物组成，探针B8为5′-TCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACT-3′(SEQIDNO：23)所示的Taqman探针。探针B8的5′端用荧光基团HEX修饰，3′端用猝灭基团BHQ1修饰。优选的，所述试剂盒由PCR反应液、dNTPs、引物对、Taqma探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应体系如下：所述上游引物包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：5、SEQIDNO：7、SEQIDNO：9、SEQIDNO：13、SEQIDNO：15、SEQIDNO：19和SEQIDNO：21所示的上游引物；所述下游引物包括SEQIDNO：3、SEQIDNO：11、SEQIDNO：17和SEQIDNO：22所示的下游引物；所述竞争引物包括SEQIDNO：2、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：14、SEQIDNO：16和SEQIDNO：20所示的竞争引物；所述探针包括SEQIDNO：4、SEQIDNO：12、SEQIDNO：18和SEQIDNO：23所示的Taqman探针。在本发明中，“引物”是指一种寡核苷酸，它可以作为在一定条件下又发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。上述引物设计的思路：上游特异性引物序列完全与突变型互补，并且引物3′末端的碱基与突变碱基位点互补，长度为16-25bp之间，TM值在50-60℃之间，上游特异性引物序列中无需引入错配碱基。竞争引物与上游特异性引物序列反向互补，并且为了提高与模板的竞争力需在该引物5′末端加上连续的G或C再或者是GC组合即GC尾，目的是提高TM值，增强与上游特异性引物的结合能力与持久度，可使上游特异性引物不轻易与模板结合，除非是匹配程度非常高的模板。这样就避免了非目的靶序列即使只有一个碱基的不同仍然会扩增的情况。其中竞争引物的GC尾，数量为2-4个，具体加入C或者G还是GC组合则根据上游特异性引物而定，优选为连续的G或者C。如果上游特异性引物中含有的C较多，那么竞争引物中则最好不要加入G，避免所加GC尾与其形成非特异性二聚体。下游引物无论是与野生型还是突变型均互补，长度为16-25bp之间，TM值为50-60℃之间。探针为Taqman探针，TM值为60-70℃之间，5′由荧光基团FAM修饰，3′端由猝灭基团BHQ1修饰。采用上述技术方案后，本发明具有以下积极效果：本发明的试剂盒，使上游特异性突变引物设计更加简单，无需考虑在何种位置引入错配和所引入的错配的强弱程度对于试剂盒检测结果的影响；由于竞争引物在原来与上游特异性引物反向互补的基础还加上了GC尾端，增强了TM值和结合力，即等于增加了该引物的非扩增靶序列的竞争能力，同时等于增强整个检测试剂盒的特异性，也正因为这种高特异性，使所述的试剂盒可以从复杂的临床样本中检测到突变基因，如：用于外周血等的检测，而不再局限于肿瘤细胞组织，并且在20ng/ul的高浓度背景下仍然可以检测到目的突变基因。本发明的试剂盒可以精确检测18、20、21号外显子上是哪种单碱基发生突变，也解决了现有试剂盒对于单碱基突变无法准确区分的弊端。本发明操作简单，成本低，对PCR反应的条件也很宽松，不会出现非特异扩增。附图说明图1为实施例1中单管检测临床样本目的突变型的扩增图；图2为实施例1中单管检测临床样本非目的突变的扩增图；图3为实施例2中本发明试剂盒单管检测非21外显子L858R突变临床样本扩增图；图4为实施例2中ARMS引物单管检测非21外显子L858R突变临床样本扩增图；图5为实施例3中本发明试剂盒在混有20ng/μL背景(非该突变的临床样本)下，三个浓度梯度扩增图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。人类EGFR基因位于基因组第7号染色体上，患者EGFR基因突变主要集中在外显子18-21号外显子上。由于EGFR基因19号外显子突变多以缺失突变为主并且缺失的碱基也较多，与野生型或是同位点的其它突变型区分起来也相对容易，而18、20、21号外显子上有大部分的单碱基突变，由于与野生型或是其他单基因突变型只有一个碱基的不同，差别较小区分起来也相对困难，现在许多试剂盒虽然单管可检测多个位点的突变，但是却无法准确的确定具体是哪种单碱基的突变。实施例1收集50例临床诊断为非小细胞肺癌患者外周血及组织切片，为保证实验的准确性，外周血用本发明试剂盒检测，组织切片用传统测序法测序验证。具体实施步骤为：1.本发明试剂盒的设计与制备所述试剂盒包含用于检测EGFR基因18号外显子G719S突变的引物对A1和探针B1、用于检测EGFR基因18号外显子G719C突变的引物对A2和探针B2、用于检测EGFR基因18号外显子G719A突变的引物对A3和探针B3、用于检测EGFR基因20号外显子T790M突变的引物对A4和探针B4、用于检测EGFR基因20号外显子S768I突变的引物对A5和探针B5、用于检测EGFR基因21号外显子L858R突变的引物对A6和探针B6、用于检测EGFR基因21号外显子L861Q突变的引物对A7和探针B7以及还包括用于检测β-actin内参基因的引物对A8和探针B8。引物对A1由SEQIDNO：1所示的上游引物、SEQIDNO：2所示的竞争引物和SEQIDNO：3所示的下游引物组成，探针B1为SEQIDNO：4所示的Taqman探针。引物对A2由SEQIDNO：5所示的上游引物、SEQIDNO：6所示的竞争引物和SEQIDNO：3所示的下游引物组成，探针B2为SEQIDNO：4所示的Taqman探针。引物对A3由SEQIDNO：7所示的上游引物、SEQIDNO：8所示的竞争引物和SEQIDNO：3所示的下游引物组成，探针B3为SEQIDNO：4所示的Taqman探针。引物对A4由SEQIDNO：9所示的上游引物、SEQIDNO：10所示的竞争引物和SEQIDNO：11所示的下游引物组成，探针B4为SEQIDNO：12所示的Taqman探针。引物对A5由SEQIDNO：13所示的上游引物、SEQIDNO：14所示的竞争引物和SEQIDNO：11所示的下游引物组成，探针B5为SEQIDNO：12所示的Taqman探针。引物对A6由SEQIDNO：15所示的上游引物、SEQIDNO：16所示的竞争引物和SEQIDNO：17所示的下游引物组成，探针B6为SEQIDNO：18所示的Taqman探针。引物对A7由SEQIDNO：19所示的上游引物、SEQIDNO：20所示的竞争引物和SEQIDNO：17所示的下游引物组成，探针B7为SEQIDNO：18所示的Taqman探针。引物对A8由SEQIDNO：21所示的上游引物、SEQIDNO：22所示的下游引物组成，探针B8为SEQIDNO：23所示的Taqman探针。本发明的7个突变位点在检测反应管中分布如下表1所示：表1突变位点分布管号突变名称1G719S2G719C3G719A4T790M5S768I6L858R7L861Q8内参2.样本基因组DNA的提取外周血基因组DNA的提取用的是QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒，每次提取全血200UL，测所得DNA的OD值，以保证所提取的DNA样品浓度在10ng/μL，取2μL(即20ng/μL)进行荧光PCR反应。组织切片基因组DNA用的是QIAGEN公司的石蜡组织DNA提取试剂盒，具体操作方法按照该试剂盒的常规操作步骤操作。3.PCR反应体系的配制1×PCR缓冲液、双蒸馏水(ddH2O)所述上游引物包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：5、SEQIDNO：7、SEQIDNO：9、SEQIDNO：13、SEQIDNO：15、SEQIDNO：19和SEQIDNO：21所示的上游引物；所述下游引物包括SEQIDNO：3、SEQIDNO：11、SEQIDNO：17和SEQIDNO：22所示的下游引物；所述竞争引物包括SEQIDNO：2、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：14、SEQIDNO：16和SEQIDNO：20所示的竞争引物；以上序列的竞争引物均在5′端含有GC尾，所述GC尾均由G或C再或者是GC组合，目的是提高TM值，增强与上游特异性引物的结合能力与持久度，可使上游特异性引物不轻易与模板结合，除非是匹配程度非常高的模板。这样就避免了非目的靶序列即使只有一个碱基的不同仍然会扩增的情况。其中所述的竞争引物的GC尾，数量为2-4个，具体加入C或者G还是GC组合则根据上游特异性引物而定，优选为连续的G或者C。所述探针包括SEQIDNO：4、SEQIDNO：12、SEQIDNO：18和SEQIDNO：23所示的Taqman探针。4.反应条件的设置(1)95℃预变性10分钟；(2)95℃变性30秒、60℃退火40秒、72℃延伸10秒，共10个循环；(3)95℃变性30秒、60℃退火40秒、72℃延伸10秒，共35个循环。5.结果判定采用ABI7500实时定量PCR扩增仪，根据表2的Ct值判定结果：表2Ct值判定6.结果及分析图1为单管检测临床样本目的突变型的扩增图，图2为单管检测临床样本非目的突变的扩增图。检测50例样本中，有1例为18号外显子G719C突变；有1例为20号外显子T790M突变；还有3例为21号外显子突变，其中1例L858R突变，2例L861Q突变。与传统测序结果一致。由此可见，本发明的试剂盒测得的结果和传统测序法测得的结果具有高度一致性。本发明试剂盒可在20ng/μL浓度背景下检测突变基因，抗干扰能力强，特异性好。本发明的试剂盒是一种快速、简便、经济以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法，值得在临床上进一步验证和推广。实施例2本实施例主要为证明本发明试剂盒的特异性，以21号外显子上的L858R突变位点为例，专门设计AMRS引物，并引入错配。由于市场上利用AMRS技术检测EGFR基因突变的试剂盒的应用也很广泛，所以以此来进行比较分析。收集50例临床诊断为非小细胞肺癌患者外周血及组织切片，为保证实验的准确性，外周血用本发明试剂盒检测，组织切片用传统测序法测序验证。具体实施步骤为：1.AMRS引物及本发明试剂盒的设计实验组：取本发明试剂盒中的检测21号L858R突变位点的检测体系进行比较。本发明试剂盒中检测21号L858R位点的引物对A6由SEQIDNO：15所示的上游引物、SEQIDNO：16所示的竞争引物和SEQIDNO：17所示的下游引物组成，探针B6为SEQIDNO：18所示的Taqman探针。对照组：根据突变位点设计ARMS引物，并引入错配，其中选取特异性最好的一组作为对照组，ARMS引物上游序列如下：CAAGATCACAGATTTTGGTCG，倒数第三位引入错配，下游引物与探针与实验组一致。2.样本基因组DNA的提取外周血基因组DNA的提取用的是QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒，每次提取全血200UL，测所得DNA的OD值，以保证所提取的DNA样品浓度在10ng/μL，取2μL(即20ng/μL)进行荧光PCR反应。组织切片基因组DNA用的是QIAGEN公司的石蜡组织DNA提取试剂盒，具体操作方法按照该试剂盒的常规操作步骤操作。3.反应体系的配制1×PCR缓冲液、ddH2O4.反应条件的设置(1)95℃预变性10分钟；(2)95℃变性30秒、60℃退火40秒、72℃延伸10秒，共10个循环；(3)95℃变性30秒、60℃退火40秒、72℃延伸10秒，共35个循环。5.结果与判定采用ABI7500实时定量PCR扩增仪，根据表2的Ct值判定结果。6.结果及分析在20ng/μL浓度背景下检测21号外显子上的L858R突变位点，图3为本发明试剂盒单管检测非21号外显子L858R突变临床样本扩增图，结果表明，本发明试剂盒的检测体系除在目的突变位点呈阳性外，其他样品均为阴性。图4为ARMS引物单管检测非21号外显子L858R突变临床样本扩增图，由图4可知，引入错配的AMRS引物检测体系，除目的突变位点呈阳性外，其它样品仍然呈阳性。由此可知，本发明的试剂盒特异性好，对于单碱基突变能够准确判断区分，优异于AMRS引物检测方法。实施例3本实施例主要为证明本发明试剂盒的特异性，以18号外显子上的G719S突变为例，用G719S突变质粒DNA进行分析，共做3个浓度梯度，并在20ng/μL背景(非该突变的临床样本)下进行荧光检测，用来说明本发明试剂盒的高灵敏性。1.样本基因组DNA的提取外周血基因组DNA的提取用的是QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒，每次提取全血200UL，测所得DNA的OD值，以保证所提取的DNA样品浓度在10ng/μL，取2μL(即20ng/μL)进行荧光PCR反应，具体操作方法按照该试剂盒的常规操作步骤操作。2.突变质粒DNA的稀释将EGFR基因18号外显子上的G719S突变质粒，分别稀释为1000、100、10个拷贝三种浓度。然后与20ng/μL临床样本所提取的DNA基因组混合加入PCR体系中。3.PCR反应体系的配制1×PCR缓冲液、ddH2O4.反应条件的设置(1)95℃预变性10分钟；(2)95℃变性30秒、60℃退火40秒、72℃延伸10秒，共10个循环；(3)95℃变性30秒、60℃退火40秒、72℃延伸10秒，共35个循环。5.结果判定采用ABI7500实时定量PCR扩增仪，根据表2Ct值判定结果。6.结果与分析图5为本发明试剂盒在混有20ng/μL背景(非该突变的临床样本)下，三个浓度梯度扩增图，由图5可知，在20ng的高浓度复杂背景下仍然可检测到突变基因，其中20ng背景中除了野生型还含有其他突变型也不会对其进行干扰(尤其是18号外显子G719C突变与G719S是同位点突变，仅差一个碱基)，可检测到含量低至1-0.1％的突变基因。由此可知，本发明的试剂盒具有较高的灵敏度，在多种突变均存在的情况下，也能特异性检出突变位点。对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明要求的保护范围之内。当前第1页1 2 3