本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种NK细胞的体外扩增培养方法。
背景技术：
：自然杀伤细胞(Naturalkillercells,NK细胞)，作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员。NK细胞除了参与先天性免疫应答之外，还在适应性免疫的免疫调节中起着重要的调控作用。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此，NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。综上，NK细胞的离体扩增和激活时促进临床频繁应用的关键，而目前NK细胞的扩增方法主要包括在培养前分离NK前体或CD56以及使用饲养细胞等步骤，不仅需要饲养细胞、操作较繁琐，而且NK细胞的扩增效果不明显，且所获得的NK细胞杀伤活性较差。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术扩增NK细胞存在NK细胞扩增率低且杀伤活性差等缺陷，提供一种能够提高NK细胞扩增率及杀伤活性的NK细胞的体外扩增方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种NK细胞的体外扩增培养方法，所述培养方法包括以下步骤：获取NK细胞；在含有胰岛素样生长因子-l的培养基中对所述NK细胞进行体外扩增培养。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，所述培养基中，胰岛素样生长因子-1的浓度为50-150ng/ml。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，获取NK细胞的过程，包括以下步骤：获取CD34+造血干细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行刺激分化成NK细胞。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞生长因子包括干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和白介素-15。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，所述干细胞培养基中，干细胞因子的浓度为10-50ng/ml、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为20-80ng/ml，以及白介素-15的浓度为20-80ng/mI。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，对所述NK细胞进行体外扩增培养的步骤为：将所述胰岛素样生长因子-l加入所述含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行培养20-50天。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，所述CD34+造血干细胞的获取过程，包括以下步骤：从血细胞中分离出单个核细胞，经磁珠分选出CD34+造血干细胞。在本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，所述血细胞采集自外周血、脐带血、蜕膜组织和/或淋巴结。实施本发明提供的NK细胞体外扩增培养方法，可以达到以下有益效果：本发明通过采用胰岛素样生长因子-l代替饲养细胞对NK细胞进行扩增培养，不仅简化了NK细胞扩增培养的步骤，而且通过胰岛素样生长因子-l能够提高NK细胞的细胞活性和扩增率以及NK细胞的杀伤活性，同时胰岛素样生长因子-l还能够刺激NK细胞分泌内源性的胰岛素样生长因子-l，以进一步提高NK细胞的杀伤活性，从而解决了现有技术中，通过饲养细胞对NK细胞进行扩增培养存在NK细胞扩增率低、杀伤活性差等缺陷。具体实施方式为解决现有技术中通过饲养细胞进行NK细胞扩增培养的方式存在扩增率低、NK细胞杀伤活性差等缺陷，本发明的创新点在于提供一种NK细胞的扩增培养方式，通过采用胰岛素样生长因子-1使得NK细胞能够一直处于增殖状态，并能够提高其细胞活性及功能特性，提高NK细胞的杀伤活性等，而无需采用饲养细胞即可达到NK细胞的扩增，从而解决了现有技术中采用饲养细胞培养NK细胞存在的操作复杂、NK细胞扩增率低且杀伤活性差等缺陷。具体地，本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：S1、获取NK细胞；S2、将NK细胞接种于含有胰岛素样生长因子-1的培养基中进行体外扩增培养。进一步地，在步骤S1中，NK细胞可来自于外周血、脐带血、蜕膜组织和/或淋巴结。NK细胞表面表达CD56抗原，不表达CD3抗原，根据CD56抗原的不同表达，NK细胞可分为CD56dimCD16bright和CD56brightCD16dim/neg两大亚群；CD56brightCD16dim/negNK细胞则主要存在于淋巴结以及蜕膜组织中，以分泌细胞因子如干扰素-γ为主要功能，杀伤功能较弱；而CD56dimCD16brightNK细胞则主要存在于外周血中，有丰富的胞内穿孔素，杀伤功能较强，因此，在本发明中，优先采用从外周血中获取NK细胞。NK细胞主要是由CD34+造血干细胞在造血干细胞生长因子的刺激下分化发育为成熟的NK细胞，NK细胞的发育阶段为：从CD34+造血干细胞先分化为共同淋巴样前提细胞，共同淋巴样前提细胞再生成NK前体细胞，NK前体细胞发育为不成熟NK细胞，最后，不成熟NK细胞获得活化性和抑制性受体，并获得功能发育为成熟的NK细胞。进一步地，获取NK细胞的过程，包括以下步骤：获取CD34+造血干细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行培养。其中，用于将CD34+造血干细胞分化发育成NK细胞的造血干细胞生长 因子，包括干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体和白介素-15；且优选地，在干细胞培养基中，干细胞因子的浓度为10-50ng/ml、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为20-80ng/ml、白介素-15的浓度为20-80ng/mL。干细胞因子(stemcellfactor,SCF)是一种通过锚定并表达于所有造血干细胞表面的酪氨酸受体c-Kit而发挥作用的因子，避免c-Kit表达缺陷导致造血干细胞扩增数量的减少。FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)作用于CD34+造血干细胞，通过在细胞表面与TKR结合而发挥造血调控作用，对造血干细胞的体外扩增有明显的促进作用。SCF与Flt-3L同属于酪氨酸激酶受体TKR家族，具有扩增原始造血干细胞的协同作用，通过与特异性TKR结合，向细胞内传递信号，启动早期造血干细胞的分裂和增殖，使细胞走出G0期，开始扩增，抑制凋亡。白介素-15不仅能够促进造血干细胞的增殖与分化，而且能够促进NK细胞NKG2D这一活化性受体的表达，增强NK细胞杀伤相关性基因如穿孔素的表达，从而增强NK细胞的杀伤功能。在这些生长因子的刺激下，造血干细胞数量增加，并且造血干细胞随着分化其表型也发生变化，发育早期阶段，干细胞上的IL-2/IL-15R-β细胞因子受体，即CD122的表达出现上调，干细胞随之分化为NK前体细胞，NK前体细胞具有定向发育为成熟NK细胞的能力，但NK前体细胞表面不表达CD56抗原；同时，NK前体细胞因表达CD122分子即IL-2/IL-15受体β上调，所以对白介素-15的刺激增强非常敏感，白介素-15可以促进NK细胞的发育，白介素-15主要来自于骨髓微环境中；此外，IL-15可以使NK细胞前体扩增并分化为表达各种抑制性受体和活化性受体的成熟NK细胞。进一步地，步骤S1中还包括获取CD34+造血干细胞的过程，而CD34+造血干细胞则是从外周血血细胞中分离出单个核细胞后，经磁珠分选出的。步骤S2中，培养基为干细胞培养基，可以与培养CD34+造血干细胞所采用的干细胞培养基保持一致；优选地，培养基为SCGM(GMPSerum-freeStem CellGrowthMedium)培养基，购自于德国CellGenix公司。胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactors-1,简称IGF-1)能够促进NK细胞的发育及扩增，并且能够促进NK细胞的杀伤活性，且能够促进NK细胞本身分泌IGF-1，这种内源性的IGF-1对NK细胞的杀伤功能至关重要；优选地，培养基中IGF-1的浓度为50-150ng/ml。进一步地，在本发明中，更为简化的过程步骤为：从外周血中分离出CD34+造血干细胞，然后接种于添加有造血干细胞生长因子和IGF-1的干细胞培养基中进行培养20-50天，即可收获扩增后的NK细胞；其中，造血干细胞生长因子包括干细胞因子、FLT-3配体和白介素-15。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。具体实施方式为：实施例1本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：S1a、获取NK细胞；S11a、单个核细胞的分离；采集100ml人外周血的血样，或80mL新生儿脐带血的血样，用1-2倍体积的PBS溶液稀释血样，充分混匀后，得到PBS血样混合液，然后在每个50ml离心管中先加入15ml的Ficoll分离液，Ficoll分离液的密度为1.077g/mL；再缓慢加入20-30ml的PBS血样混合液，室温离心，离心机升降速均调为0，于20℃、400g，离心30min，中间层为单个核细胞；用巴斯德吸管小心吸取，之后用1×PBS加满离心管，充分离心洗涤单个核细胞(400g，离心l0min)，重悬细胞，备用。S12a、CD34+造血干细胞的分选；将步骤S11a中获得的单个核细胞以台盼蓝染色计数活细胞后调为2×108 个/m1的细胞悬液，按每毫升细胞悬液加入100μL抗体的比例，加入CD34抗体混合物，用移液器上下吹打充分混匀，室温孵育15分钟；然后按每毫升细胞悬液加入50μL磁珠的比例，加入CD34+磁珠充分吹打混匀，室温孵育10分钟后，将细胞转入聚苯乙烯试管(12×75rnm)，加PBS洗涤液(含2％FBS、0.01％EDTA)至2.5ml，在试管内用移液器上下轻轻吹打2～3次，混匀细胞。再将试管插入磁极中，静置五分钟；然后将磁极连试管一起拿起，以连续缓慢的动作倾倒磁极至倒置状态，倒出上清部分。磁性标记的细胞由于磁极磁场的吸引，仍然留在试管内。保持磁极及试管倒置2～3秒，然后使试管口恢复向上的位置。从磁极中取出试管，加入2.5ml洗涤液，用移液器轻轻吹打细胞悬液2～3次，混匀细胞，再将试管放回磁极中，静置五分钟。重复洗涤4次后，试管中保留的为CD34+造血干细胞，备用。S2a、将CD34+造血干细胞接种于含有造血干细胞生长因子及IGF-1的干细胞培养基中进行扩增培养；调整CD34+造血干细胞的细胞悬液密度为1×105个/ml，并接种于含有SCGM干细胞培养基(购自于德国CellGenix公司)的24孔板中，接种前做流式分析检测接种前CD34+造血干细胞含量，并保证CD34+造血干细胞在95％以上；再分别添加干细胞因子、FLT-3L和白介素-15以及IGF-1，并使得干细胞培养基中，干细胞因子的浓度为30ng/ml、FLT-3L的浓度为50ng/ml和白介素-15的浓度为50ng/mL以及IGF-1的浓度为100ng/mL；于37℃、5％CO2孵箱培养28天。实施例2与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子及IGF-1在干细胞培养基中的浓度分别为：干细胞因子的浓度为10ng/ml、FLT-3L的浓度为20ng/ml和白介素-15的浓度为20ng/mL以及IGF-1的浓度为50ng/mL。实施例3与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子及IGF-1在干细胞培养基中的浓度分别为：干细胞因子的浓度为50ng/ml、FLT-3L的浓度为80ng/ml和白介素-15的浓度为80ng/mL以及IGF-1的浓度为150ng/mL。为进一步验证本发明提供的NK细胞体外扩增培养方法的显著效果，通过以下实验进行检测验证。检测对象：对照组：与本发明实施例1不同之处在于，该组所采用角化细胞培养基和白介素-2以及饲养细胞进行NK细胞扩增培养所获得的细胞；检测组1-3：分别为本发明实施例1-3所获得的细胞。1、NK细胞的流式细胞仪分析应用BectonDickinson型流式细胞仪对扩增后的NK细胞进行计数，检测结果如下表1。表1由以上结果可以看出，随着培养天数的增加，检测组1-3中的细胞数量逐渐增加，且均远高于对照组中的细胞数量；由此可知，通过本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法所获得的NK细胞数量较多，提高了NK细胞的扩增率。2、NK细胞杀伤活性的检测收集对数生长期的K562细胞(人红白血病细胞系K562细胞，购得)，重悬于0.5ml的含10％FCS的RPMI1640培养基中，按100μCi/L×106细胞加入51Cr。于37°℃、5％CO2孵箱中孵育2h，每隔15min摇匀一次，标记完毕后洗涤3次，调整细胞浓度至1×105/mL加入圆底96孔板中，100μL/孔，作为杀伤实验中的靶细胞。按10:1、5:1和2.5:1等效IE比加入相应量的NK细胞，在37℃、5％CO2孵箱中孵育4h，每孔收集100μL上清，测γ射线cpm值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝(实验组cpm值-自然释放cpm值)/(最大释放cpm值-自然释放cpm值)×l00％，检测数据见下表2：表2效靶比E/T对照组检测组1检测组2检测组310∶127.7±1.950.2±2.948.5±2.152.5±2.75∶115.4±3.129.6±3.527.4±3.731.9±3.22.5∶19.3±1.817.3±3.115.7±3.619.6±3.3检测结果：由表2中数据可知，检测组1-3的细胞杀伤率均大于对照组，由此说明，本发明提供的NK细胞的扩增培养方法提高了NK细胞的杀伤活性。综上所述，本发明提供的NK细胞的体外扩增培养方法中，采用胰岛素样生长因子-l进行扩增培养NK细胞，不仅能够促进NK细胞的发育及扩增，提高NK细胞的细胞活性及扩增率，而且还能够促进NK细胞自身分泌IGF-1，以提高NK细胞的杀伤活性，对于NK细胞的临床应用具有重要的意义，解决了现有技术中，通过饲养细胞扩增培养NK细胞存在的操作流程复杂、NK细胞扩增率低，杀伤活性差等问题。以上结合本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保 护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。当前第1页1 2 3