核酸合成技术的制作方法

文档序号:12140367阅读:来源:国知局

技术特征:

1.合成核酸的方法,其包括:

提供具有重叠序列的多个核酸片段,其中所述多个核酸片段具有所述多个核酸片段中的至少一个其它片段的互补序列,其中所述多个核酸片段的第一片段包含第一可切割的衔接子序列和位于所述第一可切割的衔接子序列下游的靶序列的5’端,并且其中所述多个核酸片段的最后一个片段包含位于第二可切割的衔接子序列上游的靶序列的3’端;

用与所述第一可切割的衔接子序列互补的第一固定化引物使所述第一片段固定在基底上;

经由互补序列的杂交将所述多个核酸片段组装成组装的多核苷酸分子,其中所述组装的多核苷酸分子经由所述第一固定化引物被固定在所述基底上;

扩增在所述基底上的所述组装的多核苷酸分子以产生扩增簇,所述扩增簇包含在所述基底上的组装的多核苷酸分子的扩增子;以及

对所述扩增簇进行测序。

2.如权利要求1所述的方法,其中提供所述多个核酸片段包括在体外合成所述核酸片段。

3.如权利要求2所述的方法,其中所述多个核酸片段包含靶序列的已知部分。

4.如权利要求1所述的方法,其中组装的双链多核苷酸通过所述多个核酸片段的组装形成,并且其中所述方法还包括使所述组装的双链多核苷酸分子变性以产生从所述第一固定化引物延伸的单链多核苷酸分子的步骤。

5.如权利要求1所述的方法,其中通过所述多个核酸片段的组装形成的所述组装的多核苷酸分子为部分双链的,由此所述组装的多核苷酸分子在至少一条链中包含空位。

6.如权利要求5所述的方法,其中所述方法还包括通过聚合酶的延伸填补所述组装的多核苷酸分子的链中的所述空位的步骤。

7.如权利要求1所述的方法,其中所述扩增包括对所述基底上的所述组装的多核苷酸分子进行桥式扩增。

8.如权利要求1所述的方法,其中所述多个核酸片段为单链核酸。

9.如权利要求1所述的方法,其包括如果所述簇的序列包含靶序列或者与所述靶序列互补,则收获所述扩增簇。

10.如权利要求9所述的方法,其中如果所述簇的序列没有错误,则所述扩增簇包含所述靶序列或者与所述靶序列互补。

11.如权利要求9所述的方法,其中如果所述簇的序列具有小于预定阈值的序列错误率,则所述扩增簇包含所述靶序列或者与所述靶序列互补。

12.如权利要求9所述的方法,其中收获所述扩增簇包括切割所述第二可切割的衔接子和/或所述第一可切割的衔接子。

13.如权利要求9所述的方法,其中收获所述扩增簇包括光学、化学、磁力、电力、电磁地或它们的任何组合切割所述第二可切割的衔接子和/或所述第一可切割的衔接子。

14.如权利要求1所述的方法,其包括产生所述多个扩增簇的每个的序列准确分数或度量。

15.如权利要求1所述的方法,其中所述多个核酸片段各自的长度小于200个核苷酸。

16.如权利要求1所述的方法,其中所述多个核酸片段的重叠序列的长度为20至30个核苷酸。

17.如权利要求1所述的方法,其中所述组装包括在DNA重组酶、β蛋白、DNA聚合酶、DNA连接酶、circligase或它们的任何组合的存在下组装所述多个核酸片段。

18.如权利要求1所述的方法,其中所述基底包括珠、磁珠、载玻片、微芯片、纳米微滴、电润湿盒或它们的任何组合。

19.合成多个核酸的方法,其包括进行权利要求1所述的方法以使多个不同的第一片段固定在基底上,使得对多个不同的单链片段进行组装,产生多个不同的扩增簇以及对多个不同的扩增簇进行测序。

20.如权利要求19所述的方法,其包括与所述多个不同的扩增簇中的其它扩增簇相比选择性收获靶扩增簇,其中相对于所述其它扩增簇,所述靶扩增簇具有最高的序列准确性。

21.如权利要求19所述的方法,其包括与所述多个不同的扩增簇中的其它扩增簇相比选择性收获靶扩增簇,其中相对于所述其它扩增簇,所述靶扩增簇具有低的序列准确性。

22.如权利要求19所述的方法,其包括产生所述多个扩增簇中的每个的序列准确分数或度量。

23.合成核酸片段的方法,其包括:

提供多个寡核苷酸,所述寡核苷酸经由与多个第一固定化引物的杂交被固定在基底上,所述第一固定化引物与所述寡核苷酸的5’端互补,其中各个寡核苷酸在5’端包含第一衔接子序列;

延伸所述寡核苷酸以产生对应于片段序列的延伸的多核苷酸,其中所述延伸包括将多个单独的核苷酸或核酸掺入至所述多个寡核苷酸的各个寡核苷酸的3’端,以产生具有所述片段序列的延伸的多核苷酸;

在具有所述片段序列的延伸的多核苷酸的3’端连接第二衔接子序列;

经由多个第二固定化引物使所述延伸的多核苷酸的3’端与所述基底退火以形成桥,所述第二固定化引物与所述延伸的多核苷酸的3’端互补;

扩增所述桥以形成多个扩增簇;

对所述多个扩增簇进行测序以确定所述多个扩增簇中的一个或多个是否包含所述核酸片段的序列;

如果所述多个扩增簇中的一个或多个的序列包含所述核酸片段的序列或者与所述核酸片段的序列互补,则收获所述多个扩增簇中的一个或多个以产生收获的具有所述片段序列的扩增簇;以及

将所述收获的具有所述片段序列的扩增簇与第二多个扩增簇合并,其中所述第二多个扩增簇中的至少一部分包含仅与所述片段序列的一部分互补的序列。

24.如权利要求23所述的方法,其中所述延伸通过第一聚合酶进行,所述第一聚合酶将所述多个单独的核苷酸掺入所述多个寡核苷酸的各个寡核苷酸的3’端以产生具有所述片段序列的所述延伸的多核苷酸。

25.如权利要求23所述的方法,其中所述延伸通过连接酶进行,所述连接酶将所述多个单独的核酸掺入所述多个寡核苷酸的各个寡核苷酸的3’端以产生具有所述片段序列的所述延伸的多核苷酸。

26.如权利要求23所述的方法,其中所述连接酶包括circligase。

27.如权利要求23所述的方法,其中所述第二多个扩增簇包含第二片段序列,其中所述第二片段序列包含仅与所述片段序列的一部分互补的序列。

28.如权利要求23所述的方法,其中如果所述多个扩增簇中的一个或多个的序列具有小于预定阈值的序列错误率,则所述多个扩增簇中的一个或多个包含所述核酸片段的序列或者与所述核酸片段的序列互补。

29.如权利要求23所述的方法,其中收获所述多个扩增簇中的一个或多个包括切割所述第二衔接子序列和/或所述第一衔接子序列。

30.如权利要求23所述的方法,其中收获所述多个扩增簇中的一个或多个包括光学、化学、磁力、电力、电磁地或它们的任何组合切割所述第二衔接子序列和/或所述第一衔接子序列。

31.如权利要求23所述的方法,其包括收获相对于所述多个扩增簇中的其它簇具有最高序列准确性的所述多个扩增簇之一。

32.如权利要求23所述的方法,其包括产生所述多个扩增簇中的每个的序列准确分数或度量。

33.如权利要求24所述的方法,其中所述第一聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。

34.如权利要求23所述的方法,其中所述基底包括珠、磁珠、载玻片、微芯片、纳米微滴、电润湿盒或它们的任何组合。

35.合成核酸的方法,其包括:

基于所述核酸的序列提供多个靶序列,其中所述多个靶序列的组合形成所述核酸的序列;

提供多个被固定在基底上的引物寡核苷酸;

在第一聚合酶的存在下,基于所述多个靶序列以单链方式延伸所述引物寡核苷酸以产生多个片段多核苷酸;

在第二聚合酶的存在下,向所述多个片段多核苷酸提供第一测序试剂,其中所述第一测序试剂包含一种或多种核苷酸单体,并且其中所述一种或多种核苷酸单体形成多个与所述多个片段多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸;

向所述多个片段多核苷酸提供第二测序试剂,其中所述第二测序试剂包含至少一种核苷酸单体,其中所述第二测序试剂的至少一种核苷酸单体包含可逆终止部分,并且其中在提供所述第一测序试剂之后提供所述第二测序试剂,由此获得所述多个片段多核苷酸各自的序列;

基于所述多个片段多核苷酸各自的序列与相应靶序列的比较收获所述多个片段多核苷酸;以及

组装所述多个片段多核苷酸以产生组装的多核苷酸。

36.如权利要求35所述的方法,其包括提供被固定在所述基底上的多个扩增寡核苷酸,以及扩增所述多个片段多核苷酸,其中所述扩增包括使所述多个固定化扩增寡核苷酸中的一个或多个与所述多个片段多核苷酸中的一个或多个退火。

37.如权利要求35所述的方法,其包括扩增所述组装的多核苷酸,其中所述扩增包括使所述多个固定化扩增寡核苷酸中的一个或多个与所述组装的多核苷酸中的一个或多个退火。

38.如权利要求35所述的方法,其包括:

在第三聚合酶的存在下,向所述组装的多核苷酸提供第三测序试剂,其中所述第三测序试剂包含一种或多种核苷酸单体,并且其中所述一种或多种核苷酸单体形成多个与所述组装的多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸;以及

向所述组装的多核苷酸提供第四测序试剂,其中所述第四测序试剂包含至少一种核苷酸单体,其中所述第四测序试剂的至少一种核苷酸单体包含可逆终止部分,并且其中在提供所述第三测序试剂之后提供所述第四测序试剂,由此获得所述组装的多核苷酸的序列信息。

39.如权利要求35所述的方法,其中如果所述多个片段多核苷酸各自的序列包含相应靶序列或者与相应靶序列互补,则收获所述多个片段多核苷酸。

40.如权利要求36所述的方法,其中如果所述多个片段多核苷酸各自的序列具有小于预定阈值的序列错误率,则所述多个片段多核苷酸各自的序列包含相应靶序列或者与相应靶序列互补。

41.如权利要求35所述的方法,其中收获所述多个片段多核苷酸包括从所述多个引物寡核苷酸切割所述多个片段多核苷酸。

42.如权利要求35所述的方法,其包括产生所述多个片段多核苷酸中的每个的序列准确分数或度量。

43.如权利要求35所述的方法,其中所述第一聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。

44.如权利要求35所述的方法,其中所述基底包括珠、磁珠、载玻片、微芯片、纳米微滴、电润湿盒或它们的任何组合。

45.合成核酸的系统,其包括:

基底,其包含多个流道,所述多个流道中的每个包含多个固定化引物寡核苷酸;

基于处理器的装置,其存储可执行的指令并且与所述基底连接,其中所述可执行的指令被配置为:

接收指示第一聚合酶的存在下基于多个靶序列之一产生相应的多个单链片段多核苷酸的各个流道的一个或多个合成信号;

基于所述一个或多个合成信号,控制第一测序试剂、第二测序试剂和第二聚合酶进入所述流道,其中所述第一测序试剂包含一种或多种核苷酸单体,其中所述一种或多种核苷酸单体形成多个与所述多个片段多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸,其中所述第二测序试剂包含至少一种核苷酸单体,并且其中所述第二测序试剂的至少一种核苷酸单体包含可逆终止部分;

接收指示在第二聚合酶的存在下所述第一测序试剂和所述第二测序试剂存在的各个流道的一个或多个测序信号;

基于所述一个或多个测序信号测定所述多个片段多核苷酸各自的序列;以及

提供与所述多个片段多核苷酸各自的序列与相应靶序列的比较有关的指示;以及

组装单元,其被配置成聚集来自所述多个流道中的每个的所述多个片段多核苷酸中的每个并且组装所述多个片段多核苷酸中的每个以产生组装的多核苷酸。

46.如权利要求45所述的系统,其中所述多个流道中的每个被配置成使多个扩增寡核苷酸固定在所述基底上,并且其中所述可执行的指令还包含通过使所述片段多核苷酸与所述多个固定化扩增寡核苷酸中的一个或多个退火来扩增所述多个片段多核苷酸的指令。

47.如权利要求45所述的系统,其中所述可执行的指令还包含通过在所述组装单元中使所述多个固定化扩增寡核苷酸中的一个或多个退火来扩增所述组装的多核苷酸的指令。

48.如权利要求45所述的系统,其中所述可执行的指令还包含在第三聚合酶的存在下于所述组装单元中接收第三测序试剂以及接收第四测序试剂的指令,其中所述第三测序试剂包含一种或多种核苷酸单体,其中所述一种或多种核苷酸单体形成多个与所述组装的多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸,其中所述第四测序试剂包含至少一种核苷酸单体,其中所述第四测序试剂的至少一种核苷酸单体包含可逆终止部分,并且其中在提供所述第三测序试剂之后提供所述第四测序试剂,由此获得所述组装的多核苷酸的序列信息。

49.如权利要求45所述的系统,其中所述可执行的指令还包含以下指令:如果所述多个片段多核苷酸各自的序列被鉴定为包含相应靶序列或者与相应靶序列互补,则收获所述多个片段多核苷酸。

50.如权利要求49所述的系统,其中所述可执行的指令还包含以下指令:如果所述多个片段多核苷酸各自的序列具有小于预定阈值的序列错误率,则收获所述多个片段多核苷酸。

51.如权利要求45所述的系统,其中所述可执行的指令还包含通过从所述多个引物寡核苷酸切割所述多个片段多核苷酸来收获所述多个片段多核苷酸的指令。

52.如权利要求45所述的系统,其包含处理器,所述处理器被配置成产生所述多个片段多核苷酸中的每个的序列准确分数或度量。

53.如权利要求45所述的系统,其中所述第一聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。

54.如权利要求45所述的系统,其中所述基底包含珠、磁珠、载玻片、微芯片、纳米微滴、电润湿盒或它们的任何组合。

55.合成核酸的方法,其包括:

提供包含靶序列的起始多核苷酸序列;

基于所述靶序列接收或获取代表多个重叠核酸片段的序列的信息,其中设计所述片段使得包含所述靶序列的片段在5’至3’方向中包含不连续,并且其中当所述核酸片段在与所述靶序列的互补链上杂交时,核酸片段之间出现所述不连续;

接收来自扩增簇的测序信息,其中所述扩增簇从桥扩增,所述桥由具有所述多个核酸片段的序列的合成片段产生;以及

基于所述测序信息测定所述多个扩增簇中的一个或多个的质量。

56.如权利要求55所述的方法,其中所述不连续包括空位,由此当与所述互补链杂交时,核酸片段被至少一个核苷酸的距离隔开。

57.如权利要求55所述的方法,其中所述不连续包括缺口,由此当与所述互补链杂交时,核酸片段在所述缺口处并列。

58.如权利要求55所述的方法,其包括如果所述扩增簇具有大于预定阈值的靶序列的错误率,则重新设计所述多个核酸片段。

59.如权利要求58所述的方法,其中重新设计所述多个核酸片段包括设计具有不同的不连续区的序列。

60.如权利要求55所述的方法,其包括接收关于所述多个核酸片段的所述合成片段各自的产率的信息,并且如果所述合成片段中的一个或多个的产率低于预定阈值,则重新设计所述多个单链片段。

61.如权利要求55所述的方法,其包括如果所述簇的序列包含靶序列或者与所述靶序列互补,则选择性收获扩增簇。

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