用于识别滤泡辅助T(TFH)细胞的表观遗传学方法与流程

发明领域

本发明涉及一种用于识别滤泡辅助t细胞的方法，尤其是一种用于识别滤泡辅助t细胞的体外方法，包括分析哺乳动物中白血病抑制因子(lif)基因区域中至少一个cpg位点的甲基化状态，其中，与非滤泡辅助t细胞相比，该基因区域的去甲基化指示出滤泡辅助t细胞。根据本发明的分析可以在表观遗传学的水平上识别出滤泡辅助t细胞并将它们区别于复杂样本中的其他所有细胞，例如其他血细胞。本发明还提供一种改善的用于对复杂样本中滤泡辅助t细胞进行定量的方法。该方法可以实施而无需纯化和/或富集细胞的步骤，优选在全血和/或非胰蛋白酶处理的组织中实施。

此外，本发明涉及一种用于实施上述方法的试剂盒及其相应用途。本发明的一个目的是提供一种新的更加稳健的方法来在哺乳动物的任何固体器官或组织的血中或任何体液中定量地检测并测量滤泡辅助t细胞。

背景技术：

t细胞对b细胞的帮助是获得性免疫和生成免疫记忆的重要方面。滤泡b辅助t细胞(也称为滤泡辅助t细胞或tfh)是在外周的次级淋巴器官例如淋巴结、脾脏和派尔集合淋巴结的滤泡b细胞中发现的抗原刺激的cd4+t细胞，并且通常通过它们对b细胞滤泡归巢受体cxcr5的组成性表达而进行识别(fazilleauetal.；mark,l；mcheyzer-williams,lj；mcheyzer-williams,mg(march2009).“follicularhelpertcells:lineageandlocation”.immunity30(3):324–35)。

t(fh)细胞依赖于主调控转录因子bcl6的表达。t(fh)的其他区别特征为诸如pd-1、sap(sh2d1a)、il-21和icos，以及缺乏blimp-1(prdm1)。t(fh)细胞对于生发中心的形成较为重要。一旦形成生发中心，需要t(fh)细胞来维持它们，并调节生发中心b细胞分化为浆细胞和记忆b细胞。

即使一个个体中几乎所有的细胞包含完全相同的dna编码互补体，高级生物必须呈现出并维持在多种组织中的不同基因表达形式。大多数基因调控是暂时性的，取决于细胞的当前状态和在外部刺激中的变化。另一方面，持续的调控是表观遗传学的主要作用，表观遗传即为不改变dna基本遗传编码的可遗传形式。dna甲基化是表观遗传调控的典型形式；其作为细胞的稳定记忆并在保持多种细胞类型的长期识别性中发挥重要作用。最近，发现了其他形式的表观遗传调控。除“第五个碱基”5-甲基胞嘧啶(mc)外，还可以找到第六个(5-羟甲基胞嘧啶，hmc)、第七个(5-甲酰基胞嘧啶，fc)和第八个(5-羧基胞嘧啶，cc)(michaelj.boothetal.quantitativesequencingof5-methylcytosineand5-hydroxymethylcytosineatsingle-baseresolutionscience18may2012,vol.336no.6083pp.934-937)。

提及的dna修饰的主要靶标是二核苷酸序列胞嘧啶-鸟嘌呤(”cpg位点”)；在该情况中，胞嘧啶(c)可以进行简单的化学修饰而变成甲酰化、甲基化、羟甲基化、或羧基化。在人类基因组中，cg序列比预期的要少得多，除了在一些称为”cpg岛”的相对密集簇中外。cpg岛常常与基因启动子相关，且预计多于一半的人类基因具有cpg岛(antequeraandbird,procnatlacadsciusa90:11995-9,1993)。

异常的dna甲基化常常与健康细胞-癌细胞的转化相关。在观察到的影响中，为全基因组的低甲基化、肿瘤抑制基因的增加的甲基化、以及很多原癌基因的低甲基化(例如由jonesandlaird,naturegenetics21:163-167,1999；esteller,oncogene21:5427-5440,2002；andlaird,naturereviews/cancer3:253-266,2003综述的)。甲基化图谱已经被认为是肿瘤特异性的(即，特定基因或者甚至个别cpg的甲基化形式的改变可以诊断为特定肿瘤类型)，且存在用于膀胱癌、乳癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌的诊断标记物(例如由laird,naturereviews/cancer3:253-266,2003总结的)。

对于一种新近记载的胞嘧啶的修饰，即5-羟甲基化，使用氧化重亚硫酸盐测序来对cpg岛上的5hmc进行比对和定量(michaelj.boothetal.quantitativesequencingof5-methylcytosineand5-hydroxymethylcytosineatsingle-baseresolutionscience18may2012,vol.336no.6083pp.934-937)。在与转录调控因子相关的cpg岛以及长散在重复序列(longinterspersednuclearelement)中发现了高水平的5hmc。表明这些区域可能经历胚胎干细胞中的表观遗传水平的重组。

halejs等人(distinctmemorycd4+tcellswithcommitmenttotfollicularhelper-andthelper1-celllineagesaregeneratedafteracuteviralinfection.immunity.2013apr18；38(4):805-17)基于基因表达图谱、表观遗传学、以及表型和功能分析发现，存在不同的记忆cd4(+)t细胞群，归为tfh细胞系或th1细胞系。粒酶b基因座的表观遗传修饰将tfh记忆cd4+t细胞区别于th1记忆cd4+t细胞。

kashiwakuma等人(bandtlymphocyteattenuatorsuppressesil-21productionfromfollicularthcellsandsubsequenthumoralimmuneresponses.jimmunol.2010sep1；185(5):2730-6)公开了，滤泡th(tfh)细胞也表达淋巴细胞衰减蛋白(btla)，滤泡th(tfh)细胞是表达cxcr5并向b细胞提供帮助来产生ig的非th1、非th2效应t细胞。

wo02/083162记载了一种治疗、抑制或防止受体中由免疫驱动的移植组织排斥或细胞排斥的方法，通过施用药学有效量的cd8+t细胞抑制剂。

us2012-0177597公开了一种用于在受试者中促进初始cd4+t细胞发展为产生il-21的滤泡辅助t细胞(tfh)的方法，包括以下步骤：提供一个或多个初始cd4+t细胞；使该一个或多个初始cd4+t细胞与选自il-6/tgf-b/il-12；或il-12；或tgf-b和il-12的细胞因子或细胞因子组合接触；以及使一个或多个初始cd4+t细胞分化为一个或多个产生il-21的tfh细胞。

技术实现要素：

鉴于以上情况，本发明的目的是提供一种基于dna甲基化分析的改善且尤其是稳健的方法，以作为更加方便且可靠地检测、识别、区分并定量滤泡辅助t细胞的较好工具。

本发明通过提供识别样本中滤泡辅助t细胞的方法来完成上述目标，该方法包括分析哺乳动物白血病抑制因子(lif)基因区域中至少一个cpg位点的甲基化状态，其中，与非滤泡辅助t细胞相比，该基因区域的去甲基化指示出滤泡辅助t细胞。

这个蛋白，即白血病抑制因子(lif，或cdf；dia；hilda；mlpli)，具有在白血病细胞中诱导终末分化的能力。其作用包括，在正常和骨髓白血病细胞中诱导造血分化、诱导神经元细胞分化、以及在肝细胞中刺激急性期蛋白合成。人类lif基因在染色体22，nc_000022.11上(30240447。。30257381，互补体)。

本发明还基于发明人对于lif基因区域作为特异的表观遗传学标记物的惊人识别以及该分析在临床上的常规应用，将lif基因区域识别为特异的表观遗传学标记物，使得可以识别滤泡辅助t细胞。

在本发明的背景下，seqidno.5的基因组区域使得可以识别滤泡辅助t细胞。令人惊讶地，重亚硫酸盐可转化和不可转化胞嘧啶的差异模式特别地、甚至专门地限于的根据seqidno.5的滤泡辅助t细胞的基因组区域，优选seqidno.1的区域，例如使用seqidno.1所示的扩增子。

优选地，在本发明中分析的基因组区域包括根据seqidno.1的扩增子，且任选地包括在扩增子amp2305上游的另外的约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个碱基，或甚至1500或2000个碱基，最多为约2200个额外的碱基，和/或任选地包括另外的下游的约100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个碱基，或甚至1500、2000、或2500个碱基，最多为约2600个额外的碱基。换言之，所分析的包括扩增子amp2305(约500个碱基)的基因组区域的长度可以为约600、700、800、900、1000、或1500个碱基，最多为约5300个碱基。

更优选的是包括amp2305序列的基因组区域，以及包括其上游三个cpg和其下游10个cpg的序列(如图3所示)。更加优选地，基因组区域下游包括如图3所示的所有cpg。

在本发明上下文中的”约”表示所指示数值+/-10％。

发明人表明，在滤泡辅助t细胞中，cpg几乎完全地去甲基化(即，多于70％，优选80％，优选地，多于90％，最优选多于95％)，其中相同的基序在所有其他免疫细胞中均完全地甲基化。

在上述区域内的cpg基序的差异甲基化是有价值的用于识别滤泡辅助t细胞的工具，例如为识别并定量自身免疫疾病、移植排斥、癌症、过敏、原发性和继发性免疫缺陷例如hiv感染和aids、移植物抗宿主(gvh)、恶性血液病、类风湿关节炎、多发性硬化、或在任何可预见诊断情况下的细胞毒t细胞相关的免疫状态中的所述细胞所需/或至少有一些价值。检定使得可以测量滤泡辅助t细胞而无需纯化或任何染色过程。

根据本发明的方法的另一优选方面还包括滤泡辅助t细胞的相对量的定量，基于所分析区域中甲基化频率的相对量与对照基因例如gapdh的甲基化频率的相对量的比较。因而，该定量基于本发明所述并分析的lif的基因组区域(例如，seqidno.5或1)中重亚硫酸盐可转化dna与不可转化dna的比率。最优选的是，滤泡辅助t细胞的相对量的定量是基于lif的细胞特定区域的重亚硫酸盐可转化dna的相对量分析、以及细胞非特定基因的重亚硫酸盐可转化dna的相对量分析(优选地称为”对照基因”或”对照区域”，例如gapdh基因)，优选分析是平行或同时的。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方式中，重亚硫酸盐可转化性的分析包括，用可基于seqidno.5或1而适当设计的合适引物对的至少一个引物进行扩增，引物优选为根据seqidno.2～4中任意的寡聚物。

与facs和mrna测量不同，使用本发明的方法，测量和分析可以不依赖于纯化、储存，以及在一定程度上不依赖组织质量而进行。

优选地，扩增涉及聚合酶、pcr或化学扩增反应、或其他本领域技术人员所知的如下所述的其他扩增方法，例如，在msp、重甲基(heavymethyl)、scorpion、ms-snupe、methyllight、重亚硫酸盐测序、甲基特异性限制检定和/或数字pcr情况下的(参见，例如kristensenandhansenpcr-basedmethodsfordetectingsingle-locusdnamethylationbiomarkersincancerdiagnostics,prognostics,andresponsetotreatmentclinicalchemistry55:81471–1483(2009))。

随着扩增的进行，产生lif基因区域的扩增子，其为特别优选的用于实施本发明方法的”工具”。因而，seqidno.2～4中任意的寡聚物或通过基于上述seqidno.2～4的引物对扩增的扩增子构成本发明的优选实施方式。因此，seqidno.2～4的序列(以及，如果需要的话，其互补序列)可以用来设计扩增用引物，即，用作相关序列中的”指示物”。类似地，可以基于seqidno.1扩增子设计其他的引物。扩增可以在基因组dna序列和/或重亚硫酸盐(即，”转化的”)dna序列中进行。

本领域技术人员还将能够选择cpg位点的特异子集，以将要分析的位点的数量最小化，例如选自在seqidno.1的扩增子中的cpg位点，优选选自在seqidno.1的扩增子no.2305中的cpg位点1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23中的至少一个cpg位点。这些位点从生成并分析的扩增子的5’端开始计数。优选的是3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个位点的组合，其分析会生成充足的数据和/或信息，以提供在本发明背景下的信息。

本领域技术人员还可以选择cpg位点中的特定子集，以将要分析的位点数量降至最低，例如lif特定重亚硫酸盐可转化区域(seqidno.1)的扩增子no.2305中的cpg位点9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20中的至少一个，或者在seqidno.1的重亚硫酸可转化区域上存在的所有位点。

为分析cpg位点的重亚硫酸盐可转化性，可以使用任何已知的用于分析dna甲基化的方法。在本发明方法的优选实施方式中，甲基化状态的分析包括选自甲基化特定酶切、重亚硫酸盐测序的方法，选自启动子甲基化、cpg岛甲基化、msp、重甲基、methylight、ms-snupe的分析，或其他依赖所扩增dna的检测的方法。这些方法为本领域技术人员所熟知，且能够在各文献中找到。

在本发明方法的优选实施方式中，方法适于常规应用，例如在dna芯片上。基于上述信息和各文献，本领域技术人员将能够把方法如上调整为这些设置。

在本发明方法的另一优选实施方式中，实施方法而无需纯化和/或富集要识别的细胞的步骤，优选地使用全血和/或未经胰蛋白酶处理的组织进行实施。

在本发明方法的另一实施方式中，识别包括将滤泡辅助t细胞区别于所有主要的外周血细胞类型和/或非血细胞，以及得自除血以外的其他器官的细胞类型，主要的外周血细胞类型和/或非血细胞优选但不限于b细胞、细胞毒t细胞、粒细胞、单核细胞、nk细胞和辅助t细胞。

在本发明方法的另一个优选实施方式中，样本选自哺乳动物体液、或组织、器官、或白细胞样本，或这些组织、器官或白细胞或细胞类样本的纯化或分离的一部分，哺乳动物体液包括人血样本。优选地，该哺乳动物是小鼠、大鼠、猴或人。如果需要的话，可以合适地使样本集合在一起。

本发明方法的另一个优选方面还包括基于所述滤泡辅助t细胞推断该哺乳动物免疫状态的步骤。滤泡辅助t细胞可以定量，并用作基准来相对地定量其他特定的子群体(例如但不限于cd4、th1、th2、th9、th17、th22、treg)，或者可以用作预测因子和/或筛选因子和/或诊断因子和/或预后因子和/或恶性事件检测因子，或者可以用来最终检测细胞群以确定总的免疫活动状态。

在本发明方法的另一个优选实施方式中，哺乳动物遭受或很可能遭受自身免疫疾病、移植排斥、感染疾病、癌症、和/或过敏，例如但不限于克氏锥虫感染、疟疾和hiv感染；恶性血液病，例如但不限于慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、慢性淋巴细胞白血症、移植物抗宿主病和宿主抗移植物病、蕈样肉芽肿、鼻型结节外nk/t細胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤，和其他t细胞、b细胞和nk细胞肿瘤，t细胞缺陷，例如但不限于淋巴细胞减少(症)、重症联合免疫缺陷(scid)、欧门氏症候群、软骨毛发发育不良、获得性免疫缺陷综合症(aids)，以及遗传疾病，例如迪格奥尔格综合征(dgs)、染色体断裂综合症(cbs)、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症、系统性硬化病、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、牛皮癣、白癫风、大疱性类天疱疮、斑秃、特发性扩张型心肌病、1型糖尿病、甲状腺机能亢进、淋巴瘤性(样)甲状腺肿、假麻痹性重症肌无力、iga肾病、膜性肾病、和恶性贫血；以及b细胞和t细胞复合疾病，例如但不限于共济失调毛细血管扩张症(at)和威斯科特-奥尔德里奇综合征(was)；以及癌症，例如但不限于乳癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、肝胆管型肝癌、黑素瘤、和头颈部癌。

本发明方法的另一个优选方面涉及上述的方法，还包括测量和/或监控应答于提供给哺乳动物的化学和/或生物物质(即，应答于患者治疗)的滤泡辅助t细胞的量。该方法包括上述的步骤，并将识别的细胞的相对量与从同一哺乳动物在之前或平行取得的样本进行比较，和/或将识别的细胞的相对量与对照样本进行比较。基于由本发明方法提供的结果，主治医生将能够推断患者的免疫状态，并从而调整对当下疾病的治疗。

优选地，实施该方法而无需纯化和/或富集细胞的步骤，优选地在全血和/或未经胰蛋白酶处理的组织中实施，或在潜在地包含滤泡辅助t细胞的任何其他生物样本中实施，例如用于将细胞移植至患者的样本。

本发明方法的另一个优选方面涉及上述的方法，还包括将识别的滤泡辅助t细胞配置用于移植到患者中。用于这些目的的药物制剂以及用于其制备的方法均根据移植药物领域中所示的方法进行。

本发明方法的另一个优选方面涉及根据seqidno.2～4中任意的寡聚物，或根据seqidno.1的扩增子。

本发明的另一个优选方面涉及用于在哺乳动物中基于lif基因区域中cpg位点重亚硫酸盐的可达性分析而识别、定量和/或监控滤泡辅助t细胞的试剂盒，包括用于实施本发明方法的组分，特别是包含有a)重亚硫酸盐试剂、以及b)用于分析cpg位点的甲基化状态的材料，例如选自选自根据seqidno.2～4序列的寡聚物，cpg位点选自根据seqidno.5和/或1的区域中的cpg位点，。

本发明还包括使用本发明的寡聚物或扩增子或试剂盒来识别和/或监控哺乳动物中的滤泡辅助t细胞，如本文所述。

如上所述，最近发现了三种新的胞嘧啶修饰。因而，预期将来的科学发现将修正过去所述的表观遗传学修饰形式。过去的胞嘧啶修饰形式包括重亚硫酸盐可转化(非甲基化、非修饰的)和不可转化(甲基化、修饰的)胞嘧啶。如上所述，两个界标均需要修正。根据新的科学发现，(i)重亚硫酸盐不可转化胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶(mc)和5-羟甲基胞嘧啶(hmc)，以及(ii)重亚硫酸盐可转化(即，重亚硫酸盐可转化性)胞嘧啶包括5-甲酰基胞嘧啶(fc)、5-羧基胞嘧啶(cc)、以及未修饰的胞嘧啶。

此外，之前的发明是基于(i)重亚硫酸盐可转化胞嘧啶与全部染色质的量的比率(与细胞类型无关，100％重亚硫酸盐可转化dna基因座)，或(ii)重亚硫酸盐可转化胞嘧啶(fc、cc、未修饰的胞嘧啶)与重亚硫酸盐不可转化胞嘧啶(hmc和mc)的比率。这些比率表征细胞类型、细胞分化、细胞期以及病理细胞期。因此，新技术将引起新的、更加特异的比率，并可能补偿当前细胞的特异性、细胞状态的特异性以及表观遗传修饰的病理形态，并因而定义出潜在的新的生物标记物。发现成为生物标记物的新比率可以定义为：

生物标记物比率＝a/b

a＝∑(c和/或mc和/或hmc和/或fc和/或cc)

b＝＝∑(c和/或mc和/或hmc和/或fc和/或cc)

其中a和b由于1～4种修饰而相互不同。对于新dna修饰的发现将扩充该列举。

出于定义本发明的目的，在dna序列中的“表观遗传修饰”是指术语(i)重亚硫酸盐可转化胞嘧啶(5-甲酰基胞嘧啶(fc)和/或5-羧基胞嘧啶(cc))和(ii)重亚硫酸盐不可转化胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶(mc)、5-羟甲基胞嘧啶(hmc))。由于两种甲基化，mc和hmc，都是重亚硫酸盐不可转化，无法在这两者之间区分。同样的，fc、cc以及非修饰的胞嘧啶是重亚硫酸盐可转化的，也同样无法相互区分开。术语“甲基化的”dna包括mc以及hmc。术语“非甲基化的”dna包括fc、cc和非修饰的dna。预期会在将来发现新的dna修饰变体。每一类型的修饰或是重亚硫酸盐可转化的或是重亚硫酸盐不可转化的。然而，由于本发明可靠地区分这两个组别，这些新的修饰也将可用作标记物。

此外，除dna的修饰外，组蛋白也经历会改变其与dna以及核蛋白的相互作用的翻译后修饰。修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、类泛素化、瓜氨酸化、和adp核糖基化。组蛋白h2a、h2b和h3的核也可以修饰。组蛋白修饰作用于多种生物过程例如基因调控、dna修复、染色体凝缩(有丝分裂)和精子发生(减数分裂)。对于这些修饰，特定的修饰形式对于不同细胞类型、细胞期、分化状态是特异的，且该形式可以用于分析重亚硫酸盐可转化性或相似的方法，以识别特定的细胞和细胞期。本发明还包括这些修饰的用途。

总而言之，使用lif遗传区域，特别是本文所述的扩增子，作为标记物，发明人非常特定地识别、定量以及特别是区分滤泡辅助t细胞，以及它们与样本中其他细胞类型的关系，例如与总的t淋巴细胞的关系。

本发明将基于以下实施例，并参照附图和序列表来进一步描述，然而本发明不限于实施例、附图和序列表。出于本发明的目的，本文引用的所有文献通过引用的方式全部并入。

附图说明

图1示出基因lif(白血病抑制因子)的染色体定位-染色体22，ensg00000128342:30,240,447-30,246,851反向链，以及lif遗传区域中本发明的扩增子amp2305的位置。

图2示出对本发明扩增子no.2305上cpg位点的分析。表格中的横向格对应于所分析扩增子中的cpg位置(例如，cpg1、2等)，纵栏对应于所分析的细胞类型。底部的缩写分别为：cytotox.＝细胞毒性；act.辅助t细胞＝激活的辅助t细胞；或者(peti.)tfh＝(外周)滤泡辅助t细胞。

图3示出根据本发明的seqidno.5，本发明的扩增子amp2305以粗体表示，且相关的cpg基序以下划线表示。

具体实施方式

seqidno.1示出根据本发明的扩增子amp2305的基因组序列。

seqidno.2～4示出根据本发明的特定寡聚物的序列。

seqidno.5示出本发明所关注区域的基因组序列，加上扩增子amp2305上游的约2200个碱基、以及下游的约2600个碱基。

实施例

为识别tfh细胞(滤泡辅助t细胞)，根据以下序列(amp2305，seqidno.1)，在得自人类基因组区域的重亚硫酸盐可转化样本上进行qpcr：

cttctgcccctcagtacacagcccagggggagccgttccccaacaacctggacaagctatgtggccccaacgtgacggacttcccgcccttccacgccaacggcacggagaaggccaagctggtggagctgtaccgcatagtcgtgtaccttggcacctccctgggcaacatcacccgggaccagaagatcctcaaccccagtgccctcagcctccacagcaagctcaacgccaccgccgacatcctgcgaggcctccttagcaacgtgctgtgccgcctgtgcagcaagtaccacgtgggccatgtggacgtgacctacggccctgacacctcgggtaaggatgtcttccagaagaagaagctgggctgtcaactcctggggaagtataagcagatcatcgccgtgttggcccaggccttctagcaggaggtcttgaagtgtgctgtgaaccgagggatctcaggagttgggtccagatgtgggggcctgtccaa

对于该qpcr，使用以下引物和探针：

发现以下细胞类型特异性(由qpcr测量)：

在全血qpcr测量中，确定出/定量出以下量的tfh细胞。样本是全部11个不同(健康)供体的外周全血：

由于使用在扩增子amp2305(参见seqidno.5)的约2200上游碱基和/或约2600下游碱基内找到的cpg位点做了相似分析，从而识别出额外的能提供信息的cpg位点。

序列表

<110>艾芬特斯有限公司

<120>用于识别滤泡辅助t（tfh）细胞的表观遗传学方法

<130>e31776wo

<150>ep14196613.5

<151>2014-12-05

<160>5

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>496

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

cttctgcccctcagtacacagcccagggggagccgttccccaacaacctggacaagctat60

gtggccccaacgtgacggacttcccgcccttccacgccaacggcacggagaaggccaagc120

tggtggagctgtaccgcatagtcgtgtaccttggcacctccctgggcaacatcacccggg180

accagaagatcctcaaccccagtgccctcagcctccacagcaagctcaacgccaccgccg240

acatcctgcgaggcctccttagcaacgtgctgtgccgcctgtgcagcaagtaccacgtgg300

gccatgtggacgtgacctacggccctgacacctcgggtaaggatgtcttccagaagaaga360

agctgggctgtcaactcctggggaagtataagcagatcatcgccgtgttggcccaggcct420

tctagcaggaggtcttgaagtgtgctgtgaaccgagggatctcaggagttgggtccagat480

gtgggggcctgtccaa496

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>智人

<400>2

gtttaatgttattgttgatattttgt26

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>智人

<400>3

acatccacataacccaca18

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>智人

<400>4

tgtgttgtgttgtttgtgtagtaagtattat31

<210>5

<211>5531

<212>dna

<213>智人

<400>5

ctgaggatgggtcccatggggccaagtccaggctgggtgggagagcgactcagagccagg60

gccgcaaggtgggcctggcacagagctcccaagtccacagggagatgaggtgatgggcga120

gtcagccgggccccccgggtggaatcagcaactctggtttccagacaagtttgtctttct180

cgaagcccatcctgggggaatgcagccagccccaagctaagccggatgaagcaggaagga240

gaaggcagtccctgcatcctggacaagggtgagtgtggcccacatctcaacagccacatc300

ctcgtcttgctgttgggatggacagatggacaactccgggccgcaccctccaccccaacc360

ccaggcctcaggacctgcctgcacactgcccacgcgccatccaggtaaagtgcttagaga420

gcgacagggaaaggtgcaaagtgagtgaaaagtaccataattagtaccatcatcttgtcg480

gaggaacttggaggccggcagcccgctcagggtttgagaagaagccagaacactgctctg540

agcagctgccccaactctgctgcctccttccctcccctgctctcagactggagggcgttt600

ctccactcgcctggccccagcacaaaggaagagatcgggttccctgcctgggagcccaga660

catgggtgggagtgggatgggggtggagcaggagggcccacagcttcctggtctgagtcc720

caggcatctgcagcctccctctcctcctcttgggagcaatgggcagctgatccccccagt780

ctaccccaccttcctggggtctggcccagccaggccccccgcaccgtctatgggtgtccg840

ggccacaggaggagcttccctgctgtgtcggagcatgctgggtgcaggggcagggttgtt900

ccagggcgctatttcagaggcagcatggggacacagaaacaaggacagggtgggccacaa960

ggactgtcttgcccactgctccagggggcacaatatctgccaggaacagtgcgcctcaca1020

acacaatgctggggcgcccaagaacagtgtgaaccagccccctggaatcaagacagaaag1080

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