用于检测含有mecC的甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌的组合物和方法与流程

文档序号：11633021阅读：449来源：国知局

本发明涉及细菌诊断领域，且更具体地涉及含有mecc核酸序列的甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）(mrsa)的检测。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(“s.aureus”或“sa”)是一种兼性厌氧性的革兰氏阳性细菌，其天然储库包括人皮肤和鼻子，并且也可以栖居于创伤。大多数携带金黄色葡萄球菌的人不会表现出感染的迹象；但是，如果正常屏障被攻破，金黄色葡萄球菌可以变成侵袭性的并在体内造成感染。金黄色葡萄球菌可以造成许多疾病，范围从微小皮肤感染（诸如丘疹、疮和脓肿）至重大疾病（诸如肺炎、脑膜炎和脓毒症）。当屏障被攻破时可以感染除了皮肤和鼻子以外的组织，例如，皮肤或粘膜衬里，这会导致疖和痈。金黄色葡萄球菌感染可以通过与被感染者的皮肤接触或与被感染者使用过的物体的接触而在人之间传播。

金黄色葡萄球菌具有产生对包括青霉素(甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林和氟氯西林)的主要抗生素的抗性的惊人能力，这已经为它赢得了标签“超级细菌（superbug）”。甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(mrsa)是一种已经变得耐受青霉素的细菌，并且它会引起几种难以治疗的人感染。mrsa还可以被称作苯唑西林抗性的金黄色葡萄球菌(orsa)和多抗性的金黄色葡萄球菌，而金黄色葡萄球菌的非-甲氧西林抗性株有时被称作甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(mssa)。

葡萄球菌中甲氧西林抗性所需的基因meca编码低亲和力青霉素结合蛋白2a(pbp2a)(niemeyer等人,j.bacteriol.,(1996),178(18):5464-5471)。最近在来自人类和动物的金黄色葡萄球菌分离物中鉴别出了meca的一种新变体(mecalga251)，其已经被重新命名为mecc(harrison等人,antimicrob.agentschemother.,(2013),57(3):1524-1528)。该同系物与meca基因具有70%核苷酸同一性，并且它的存在会造成可能被误诊为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的诊断问题(paterson等人,trendsmicrobiol.,(2014),22(1):42-47)。因而，本领域需要一种快速的且可靠的方法以敏感方式特异性地检测含有mecc的mrsa。

发明概况

本发明中的某些实施方案涉及在生物或非生物样品中快速检测含有mecc的金黄色葡萄球菌(mecc-mrsa)的存在或不存在的方法，例如，在单个试管中通过实时聚合酶链式反应对mecc-mrsa的多路检测。实施方案包括检测mecc-mrsa的方法，所述方法包括执行至少一个循环步骤，所述循环步骤可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括被设计成在单个试管中检测mecc-mrsa的引物、引物对、探针和试剂盒。将检测方法设计成靶向mecc基因，这允许人们在单个测试中检测mecc-mrsa。

本发明提供了检测mecc-mrsa在来自个体的生物样品中的存在或不存在的方法。这样的方法通常包括执行至少一个循环步骤，所述循环步骤包括扩增步骤和染料结合步骤。通常，所述扩增步骤包括使所述样品与多个mecc-mrsa引物对接触以产生一种或多种mecc-mrsa扩增产物（如果mecc-mrsa核酸分子存在于所述样品中），且所述染料结合步骤包括使所述mecc-mrsa扩增产物与双链dna结合染料接触。这样的方法还包括检测所述双链dna结合染料向所述扩增产物中的结合的存在或不存在，其中所述结合的存在指示mecc-mrsa在所述样品中的存在，且其中所述结合的不存在指示mecc-mrsa在所述样品中的不存在。一种代表性的双链dna结合染料是溴化乙锭。另外，这样的方法也可以包括确定所述mecc-mrsa扩增产物和所述双链dna结合染料之间的解链温度，其中所述解链温度证实mecc-mrsa的存在或不存在。

在一个方面，提供了一种检测在样品中的含有mecc的金黄色葡萄球菌(mecc-mrsa)的方法，所述方法包括：执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与orfx寡核苷酸引物和mecc-mrsa寡核苷酸引物接触，如果mecc-mrsa存在于所述样品中，则产生扩增产物；执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的mecc-mrsa寡核苷酸探针接触；和检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示mecc-mrsa在所述样品中的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示mecc-mrsa在所述样品中的不存在；其中所述mecc-mrsa寡核苷酸引物包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物。在所述方法的一些实施方案中，所述杂交步骤包括：使所述扩增产物与探针接触，所述探针用供体荧光部分和对应的受体荧光部分标记，且所述检测步骤包括：检测探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(fret)的存在或不存在，其中所述荧光的存在或不存在指示mecc-mrsa在所述样品中的存在或不存在。在一些实施方案中，所述可检测的mecc-mrsa寡核苷酸探针包含seqidno:10的序列或其互补物或者由seqidno:10的序列或其互补物组成。在一些实施方案中，所述可检测的mecc-mrsa寡核苷酸探针具有40个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，扩增采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，所述供体荧光部分和对应的受体荧光部分是在探针上彼此不超过8个核苷酸内。在一些实施方案中，所述受体荧光部分是猝灭剂。在一些实施方案中，所述orfx寡核苷酸引物包含seqidno:9的序列或者由seqidno:9的序列组成。在一些实施方案中，所述orfx寡核苷酸引物和所述mecc-mrsa寡核苷酸引物具有40个或更少的核苷酸。

在某些方面，提供了一种用于检测样品中含有mecc的金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括：执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与orfx寡核苷酸引物和mecc-mrsa寡核苷酸引物接触，如果mecc-mrsa存在于所述样品中，则产生扩增产物；执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的mecc-mrsa寡核苷酸探针接触；和检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示mecc-mrsa在所述样品中的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示mecc-mrsa在所述样品中的不存在；其中所述orfx寡核苷酸引物包含seqidno:9的序列或其互补物或者由seqidno:9的序列或其互补物组成，且所述mecc-mrsa引物包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物或者由选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物组成；且其中所述可检测的mecc-mrsa探针包含seqidno:10的序列或其互补物或者由seqidno:10的序列或其互补物组成。

在一些实施方案中，扩增可以采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。因而，所述第一荧光部分和第二荧光部分可以沿着所述探针的长度在彼此的不超过8个核苷酸内。在另一个方面，所述mecc-mrsa探针包括允许二级结构形成的核酸序列。这样的二级结构形成通常导致第一荧光部分和第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，在所述探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。

本发明也提供了用于检测mecc-mrsa的一种或多种核酸的试剂盒。所述试剂盒可以包括一组或多组对mecc基因靶标的扩增特异性的mecc-mrsa引物；和一种或多种可检测的、对mecc-mrsa扩增产物的检测特异性的mecc-mrsa探针。

在一个方面，提供了一种用于检测含有mecc的金黄色葡萄球菌(mecc-mrsa)的核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：第一寡核苷酸引物，其包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物或者由选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物组成；第二寡核苷酸引物，其被构造成与orfx基因的一部分杂交；和第三可检测地标记的寡核苷酸探针，其被构造成与由所述第一寡核苷酸引物和所述第二寡核苷酸引物产生的扩增子杂交。在一些实施方案中，所述第三可检测地标记的寡核苷酸探针包含供体荧光部分和对应的受体荧光部分。在一些实施方案中，所述供体荧光部分和对应的受体荧光部分是在探针上彼此不超过8个核苷酸内。在一些实施方案中，所述受体荧光部分是猝灭剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含核苷三磷酸、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶的功能所必需的缓冲液。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸引物包含seqidno:9的序列或者由seqidno:9的序列组成。在一些实施方案中，所述可检测的寡核苷酸探针是mecc-mrsa寡核苷酸探针，且包含seqidno:10的序列或其互补物或者由seqidno:10的序列或其互补物组成。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物和/或所述寡核苷酸探针具有40个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括关于使用所述引物、探针和荧光团部分检测mecc-mrsa在样品中的存在或不存在的包装说明书和指导。

在一个方面，提供了一种寡核苷酸，其包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的核酸序列或其互补物或者由选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的核酸序列或其互补物组成。在另一个方面，提供了一种寡核苷酸，其包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的核苷酸序列或其互补物或者由选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的核苷酸序列或其互补物组成。在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种寡核苷酸，其包括与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12之一或其互补物具有至少70%序列同一性(例如，至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。通常，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在这些实施方案的某些中，所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，所述寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称的“保守变异”表示这样的核酸：其编码相同的或基本上相同的氨基酸序列，或者，在所述核酸不编码氨基酸序列的情况下，表示基本上相同的序列。技术人员会认识到，改变、添加或删除编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%)的各种置换、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或化学上类似的氨基酸对氨基酸的置换。

在一个方面，提供了一对用于扩增mecc-mrsa基因靶标的寡核苷酸引物，包括：包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物的第一寡核苷酸引物，和被构造成与orfx基因的一部分杂交的第二寡核苷酸引物。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸引物包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8或其互补物的核酸序列或者由选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8或其互补物的核酸序列组成，且所述第二寡核苷酸引物包含seqidno:9的核酸序列或其互补物或者由seqidno:9的核酸序列或其互补物组成。在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种寡核苷酸，其包括与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9之一或其互补物具有至少70%序列同一性(例如，至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在这些实施方案的某些中，所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35或更少的核苷酸、30或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，提供了一组用于扩增mecc-mrsa基因靶标的寡核苷酸引物，包括一种或多种各自包含选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7和8的序列或其互补物的第一寡核苷酸引物和被构造成与orfx基因的一部分杂交的第二寡核苷酸引物。

在另一个方面，提供了一组用于扩增和检测mecc-mrsa基因靶标的寡核苷酸，包括seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8和9中的至少一个核酸序列或其互补物和可检测的探针，所述探针用于检测mecc-mrsa扩增产物，包括seqidno:10的核酸序列。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明的主题，下面描述了合适的方法和材料。另外，所述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的，无意成为限制性的。

在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从附图和详细描述以及从权利要求会明白本发明的其它特征、目的和优点。

附图说明

图1显示了与对含有meca的mrsa特异性的引物（re2）相比，使用几种对meccmrsa特异性的引物的实验的pcr生长曲线。

图2显示了使用三种不同引物的实验的pcr生长曲线，所述引物对meccmrsa是特异性的。两种引物（ahremecc01和ahremecc03）表现出就荧光和转弯值（elbowvalue）而言类似的生长曲线表现。第三种引物（ahremecc02）具有减少的荧光和延迟的转弯值。

图3显示了使用几种对meccmrsa特异性的引物的实验的pcr生长曲线，都具有类似的生长曲线表现。

图4显示了基于re（sccmec的右端（rightextremity））分类的mrsa分类的一种示意图。

发明详述

通过核酸扩增对mecc-mrsa感染的诊断提供了一种快速地和准确地检测细菌感染的方法。本文描述了一种用于检测样品中的mecc-mrsa的实时测定。提供了用于检测mecc-mrsa的引物和探针，还提供了含有这样的引物和探针的制品或试剂盒。用于检测mecc-mrsa的实时pcr相对于其它方法增加的灵敏度以及实时pcr的改善特征（包括样品围堵和扩增的产物的实时检测）使得该技术在临床实验室中用于mecc-mrsa感染的常规诊断的实现成为可行。

类似于meca，同系物甲氧西林-抗性基因mecc编码改变的甲氧西林抗性的青霉素结合蛋白(pbp2a或pbp2')，即一种具有降低的对β-内酰胺环的亲和力的青霉素结合蛋白(β-内酰胺抗生素诸如青霉素、头孢菌素和碳青霉烯的主要活性位点)(guignard等人,2005,curropinpharmacol5(5):479-89)，其不存在于敏感菌株中，且被认为已经得自远亲物种。mecc被携带在可动遗传元件（即mrsa菌株的葡萄球菌染色体盒mec（sccmec））上。scc元件也存在于敏感的金黄色葡萄球菌中，但是不携带mecc基因或携带无功能的mecc基因。这样的菌株可以是假阳性结果的来源，因为它们可能具有相同的右端连接部。

但是，由于不同量的非抗性的金黄色葡萄球菌和甲氧西林抗性的凝固酶阴性葡萄球菌(mrcons)的存在，通过检测mecc基因和金黄色葡萄球菌特异性基因对来自鼻样本的mrsa检测会导致低阳性预测值(ppv)。因为两种靶标的存在，那些的组合不可与mrsa区分开。取决于mrsa的普遍，该情形导致多达30%假阳性结果。对于更好的ppv，选择的靶标需要是mrsa独有的。目前已知的唯一靶标是葡萄球菌染色体盒(sccmec)，其扩增携带mecc基因的遗传元件的转座子整合位点。

sccmec，即mrsa的scc元件(具有功能性mecc基因)，是一种高度可变长度(16kb-67kb)的转座子，其整合进来自含有mecc基因的金黄色葡萄球菌(orfx)的开放阅读框x的3'部分。orfx在金黄色葡萄球菌中不具有确定的功能，并且是金黄色葡萄球菌独有的。sccmec的整合会建立mrsa独有的标签。

sccmec元件具有两个基本组分：ccr基因复合体(ccr)和mec基因复合体(mec)。ccr基因复合体由ccr基因和周围的开放阅读框(orf)组成，且mec基因复合体由mecc基因、调节基因和在mecc的上游或下游的插入序列组成。

mrsa的分类可以是基于mrsa的不同基因型。基于基因型的mrsa检测和分类的一种靶标可以是sccmec的右端连接部(re)。该mrsa分类联系方法因此被称作re(sccmec的右端)分类。该分类方法利用在不同类型的sccmec中在整合位点附近的sccmecdna的右端处的多态性。

含有mecc的金黄色葡萄球菌(mecc-mrsa)的检测利用一种策略在金黄色葡萄球菌orfx基因和携带mecc基因（其赋予对甲氧西林的抗性）的sccmec之间的re连接部处产生扩增子。为此，将一种引物锚定在金黄色葡萄球菌的orfx基因的高度保守区中(orfx引物)，并且第二种引物位于sccmec的非保守re连接部内(re引物或mecc-mrsa引物)。从两种引物得到的扩增子跨orfx基因的部分和sccmec的部分。由于sccmec在re连接部处的不同源性质，为了实现携带mecc基因的独特mrsa菌株的最大覆盖度，几种不同的re引物是必要的。在本发明中，针对14种独特mecc菌株确定携带mecc的mrsa的re区域的具体序列，并从用于携带mrsa菌株的mecc的包含性检测的那些序列设计re引物。为了检测得到的扩增子，可以利用一种或多种可检测的mecc-mrsa探针，其中所述mecc-mrsa探针包括可以在含有orfx基因的高保守区的位置处与扩增子的一部分部分地或完全地杂交的序列。所述引物可以用在用于检测mecc-mrsa的试剂盒中，所述试剂盒还可以包括用于携带meca或mecc基因的mrsa的包含性检测的多路。

公开的方法可以包括执行至少一个循环步骤，所述循环步骤包括使用一个或多个mecc-mrsa引物对扩增来自样品的mecc-mrsa核酸分子基因靶标的一个或多个部分。本文中使用的“mecc-mrsa引物”表示这样的寡核苷酸引物：其在sccmec的非保守re连接部中与编码mrsa中的mecc的核酸序列特异性地退火，并在适当的条件下开始从其dna合成。每种讨论的mecc-mrsa引物在各种mecc-mrsa靶核酸分子内或附近与靶标退火，使得每种扩增产物的至少一部分含有与靶标对应的核酸序列。产生了一种或多种mecc扩增产物，前提条件是，一种或多种mecc核酸存在于样品中，因而一种或多种mecc扩增产物的存在指示mecc-mrsa在所述样品中的存在。所述扩增产物应当含有与针对mecc-mrsa的一种或多种可检测的探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与针对mecc-mrsa的一种或多种可检测的探针接触用于检测mecc-mrsa在所述样品中的存在或不存在。

本文中使用的术语“扩增”表示合成与模板核酸分子(例如，mecc)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物的解链温度的温度使引物与模板核酸退火，和酶促地从引物延伸以产生扩增产物。扩增通常需要脱氧核糖核苷三磷酸、dna聚合酶(例如，platinum®taq)和对于所述聚合酶的最佳活性而言适当的缓冲液和/或辅因子(例如，mgcl2和/或kcl)的存在。

术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知的使用，且表示寡聚体化合物，主要表示寡核苷酸，但是也表示能够通过模板依赖性的dna聚合酶“引发”dna合成的经修饰的寡核苷酸，即，例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-oh基团，模板依赖性的dna聚合酶可以与其连接其它“核苷酸”，从而建立3’至5’磷酸二酯键，其中使用脱氧核苷三磷酸且其中释放焦磷酸盐。因此，除了对于预期的功能而言可能以外，在“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间不存在根本差异。

术语“杂交”表示一个或多个探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针的解链温度的温度，但是其避免了探针的非特异性杂交。

术语“5’至3’核酸酶活性”表示核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成有关，其中从核酸链的5’末端除去核苷酸。

术语“热稳定的聚合酶”表示热稳定的聚合酶，即，所述酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当遭受升高的温度持续实现双链模板核酸的变性所需的时间时不会不可逆地变性。通常，合成在每种引物的3’末端处开始，并且沿着模板链在5’至3’方向前进。热稳定的聚合酶已经分离自黄栖热菌（thermusflavus）、红栖热菌（t.ruber）、嗜热栖热菌（t.thermophilus）、水生栖热菌（t.aquaticus）、乳栖热菌（t.lacteus）、红色栖热菌（t.rubens）、嗜热脂肪芽孢杆菌（bacillusstearothermophilus）和炽热甲烷嗜热菌（methanothermusfervidus）。尽管如此，非热稳定的聚合酶也可以用在pcr测定中，只要补充所述酶即可。

术语“其互补物”表示与给定的核酸具有相同长度且刚好互补的核酸。

术语“延伸”或“伸长”当关于核酸使用时表示，此时另外的核苷酸(或其它类似的分子)掺入核酸中。例如，任选地用掺入核苷酸的生物催化剂（诸如通常在核酸的3’末端端部添加核苷酸的聚合酶）延伸核酸。

在两个或更多个核酸序列的背景下，术语“相同”或百分比“同一性”表示，当为了最大对应对比和比对时，两个或更多个序列或子序列是相同的或指定百分比的核苷酸是相同的，例如，如使用技术人员可得到的序列对比算法之一或通过目检所测量的。适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法是blast程序，其描述在，例如，altschul等人(1990)“basiclocalalignmentsearchtool”,j.mol.biol.215:403-410,gish等人(1993)“identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch”,naturegenet.3:266-272,madden等人(1996)“applicationsofnetworkblastserver”,meth.enzymol.266:131-141,altschul等人(1997)“gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”,nucleicacidsres.25:3389-3402,和zhang等人(1997)“powerblast:anewnetworkblastapplicationforinteractiveorautomatedsequenceanalysisandannotation”,genomeres.7:649-656中。

在寡核苷酸的背景下，“修饰的核苷酸”表示一种改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同核苷酸替代，所述不同核苷酸给所述寡核苷酸提供期望的性质。在本文描述的寡核苷酸中可以被置换的示例性的修饰的核苷酸包括，例如，c5-甲基-dc、c5-乙基-dc、c5-甲基-du、c5-乙基-du、2,6-二氨基嘌呤、c5-丙炔基-dc、c5-丙炔基-du、c7-丙炔基-da、c7-丙炔基-dg、c5-炔丙基氨基-dc、c5-炔丙基氨基-du、c7-炔丙基氨基-da、c7-炔丙基氨基-dg、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-du、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基ribo-u、2'-0-甲基ribo-c、n4-乙基-dc、n6-甲基-da等。在寡核苷酸中可以被置换的许多其它修饰的核苷酸在本文中被提及或是本领域中以其它方式已知的。在某些实施方案中，与对应的未修饰的寡核苷酸的解链温度相比，修饰的核苷酸置换会改变寡核苷酸的解链温度(tm)。为了进一步举例说明，在一些实施方案中，某些修饰的核苷酸置换可以减少非特异性的核酸扩增(例如，使引物二聚体形成最小化等)，增加预期的靶扩增子的收率等。这些类型的核酸修饰的实例描述在例如美国专利号6,001,611中。

含有mecc的金黄色葡萄球菌(mecc-mrsa)

本发明提供了通过扩增例如mecc核酸序列的一部分来检测mecc-mrsa的方法。mecc-mrsa的不同亚型的sccmec的核酸序列是可得到的(例如，genbank登记号fr823292)。具体地，本发明中的实施方案提供了用于扩增和检测mecc-mrsa核酸分子靶标的引物和探针。

为了检测mecc-mrsa，提供了用于扩增mecc-mrsare连接部的引物和探针。除了本文中举例的那些以外的mecc-mrsa核酸也可以用于检测样品中的mecc-mrsa。例如，本领域技术人员使用常规方法可以针对特异性和/或灵敏度来评价功能变体。代表性的功能变体可以包括，例如，在本文公开的mecc-mrsa核酸中的一个或多个缺失、插入和/或置换。

更具体地，寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的核酸，其基本上相同的变体，其中所述变体与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10之一或seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的互补物和变体具有至少例如80%、90%或95%序列同一性。

在一个实施方案中，使用上述的mecc-mrsa引物和探针集合以便提供疑似含有mecc-mrsa的生物样品中的mecc-mrsa的检测。所述引物和探针集合可以包含对mecc-mrsare连接部核酸序列特异性的引物和探针或由其组成，其包含seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的核酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，针对mecc-mrsa靶标的引物和探针包含seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的引物和探针中的任一种的功能活性变体或者由其组成。

通过使用公开的方法中的引物和/或探针，可以鉴别seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的引物和/或探针中的任一种的功能活性变体。seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任一个的引物和/或探针的功能活性变体涉及与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的各个序列相比在所述的方法或试剂盒中提供类似的或更高的特异性和灵敏度的引物和/或探针。

所述变体可以通过一个或多个核苷酸添加、缺失或置换从例如seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列变化，诸如在seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的各个序列的5’末端和/或3’末端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或置换。如上面详述的，可以对引物(和/或探针)进行化学修饰，即，引物和/或探针可以包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然的“核苷酸”差别在于一些修饰，但是仍然由碱基或碱基样化合物、呋喃型戊糖基糖或呋喃型戊糖基糖-样化合物、磷酸酯部分或磷酸酯样部分或它们的组合组成。例如，“标记”可以连接至“核苷酸”的碱基部分，由此得到“修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可以被例如7-脱氮杂(desaza)嘌呤替代，由此也得到“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中互换使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然的核苷差别在于如上面关于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)所述的方式进行的一些修饰。

使用例如计算机程序诸如oligo(molecularbiologyinsightsinc.,cascade,colo.)，可以设计扩增编码mecc-mrsare连接部核酸序列的核酸分子（例如，编码mecc-mrsare连接部的替代部分的核酸）的寡核苷酸（包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物）。当设计要用作扩增引物的寡核苷酸时重要的特征包括、但不限于：适当大小的扩增产物以促进检测(例如，通过电泳)，对于一对引物的成员而言类似的解链温度，和每种引物的长度(即，引物需要足够长以序列特异性地退火和开始合成，但是不会长至在寡核苷酸合成过程中降低保真度)。通常，寡核苷酸引物是8-50个、特别是10-40个或12-40个核苷酸的长度(例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸的长度)。

除了一组引物以外，所述方法可以使用一种或多种探针以便检测mecc-mrsa的存在或不存在。术语“探针”表示合成地或生物地产生的核酸（dna或rna），其通过设计或选择而含有特异性的核苷酸序列，所述序列允许它们在限定的预定严格性下与“靶核酸”（在本发明的情况下，与mecc-mrsa（靶）核酸）特异性地（即，优先地）杂交。“探针”可以被称作“检测探针”，这意味着它检测靶核酸。

在一些实施方案中，所述的mecc-mrsa探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中，所述mecc-mrsa探针可以用供体荧光部分（例如，荧光染料）和对应的受体荧光部分（例如，猝灭剂）标记。在一个实施方案中，所述探针包含荧光部分或者由荧光部分组成，且所述核酸序列包含seqidno:10(在没有标记的情况下显示)或由其组成。

设计要用作探针的寡核苷酸可以以与引物设计类似的方式进行。实施方案可以使用单个探针或探针对，用于检测扩增产物。取决于实施方案，探针应用可以包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。与引物一样，探针经常具有类似的解链温度，且每个探针的长度必须足以发生序列特异性的杂交，但是不会长至在合成过程中降低保真度。寡核苷酸探针通常具有40个或更少的核苷酸，且具体地是12-40、15-40和15-30(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸的长度。

构建体可以包括载体，每个载体含有mecc-mrsare连接部引物和探针核酸分子(例如，seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10)之一。可以使用构建体例如作为对照模板核酸分子。适合使用的载体是商购可得的和/或通过本领域的常规重组核酸技术方法生产。可以例如，通过化学合成、从mecc-mrsa直接克隆或通过pcr扩增得到mecc-mrsa核酸分子。

除了mecc-mrsa核酸分子(例如，含有seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的一个或多个序列的核酸分子)以外，适合用在所述方法中的构建体通常包括编码用于选择期望的构建体和/或转化体的可选择标记物(例如，抗生素抗性基因)的序列和复制起点。载体系统的选择经常取决于几个因素，包括、但不限于，宿主细胞的选择、复制效率、可选择性、可诱导性和回收容易性。

可以在宿主细胞中繁殖含有mecc-mrsa核酸分子的构建体。本文中使用的术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌（e.coli）、鼠伤寒沙门氏菌（salmonellatyphimurium）、粘质沙雷氏菌（serratiamarcescens）、和枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）。真核宿主包括酵母诸如酿酒酵母（s.cerevisiae）、裂殖酵母（s.pombe）、巴斯德毕赤酵母（pichiapastoris）、哺乳动物细胞诸如cos细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞、昆虫细胞和植物细胞诸如拟南芥（arabidopsisthaliana）和烟草（nicotianatabacum）。使用本领域普通技术人员通常已知的任意技术，可以将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是用于将核酸引入宿主细胞中的常见方法。另外，可以将裸露dna直接递送至细胞(参见，例如，美国专利号5,580,859和5,589,466)。

聚合酶链式反应(pcr)

美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规pcr技术。pcr通常采用两种结合选定的核酸模板(例如，dna或rna)的寡核苷酸引物。在一些实施方案中可以使用的引物包括能够在所述的mecc-mrsa核酸序列(例如，seqidno:1、2、4、5、7、8和9)内充当核酸合成的起始点的寡核苷酸。可以通过常规方法以限制酶切消化来纯化引物，或可以合成地产生它。为了在扩增中的最大效率，所述引物优选地是单链的，但是所述引物可以是双链的。首先将双链引物变性，即，处理以分离所述链。一种使双链核酸变性的方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，在可以将它用作pcr中的模板之前需要分离两条链。链分离可以通过任意合适的变性方法完成，所述方法包括物理方式、化学方式或酶促方式。一种分离核酸链的方法包括加热核酸直到它显著地变性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%发生变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及正在变性的核酸的长度和核苷酸组成，但是通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，所述时间取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性通常执行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒或1.5分钟)。

如果通过热使双链模板核酸变性，允许反应混合物冷却至促进每种引物与它在所述mecc-mrsa核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度经常是约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可以是约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调至促进或优化聚合酶活性的温度，即，足以使延伸从退火的引物发生以产生与模板核酸互补的产物的温度。所述温度应当足以从每个与核酸模板退火的引物合成延伸产物，但是不应当高至使来自它的互补模板的延伸产物变性(例如，用于延伸的温度通常范围为约40℃至约80℃(例如，约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可以是约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。

pcr测定可以采用mecc-mrsa核酸诸如rna或dna(cdna)。模板核酸不需要纯化；它可以是复杂混合物的次要级分，诸如在人细胞中所含的mecc-mrsa核酸。通过常规技术诸如在diagnosticmolecularmicrobiology:principlesandapplications(persing等人(编),1993,americansocietyformicrobiology,washingtond.c.)中描述的那些，可以从生物样品提取mecc-mrsa核酸分子。核酸可以得自多种来源，诸如质粒或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物诸如植物或动物。

在诱导引物延伸的反应条件下将寡核苷酸引物(例如，seqidno:1、2、4、5、7、8和9)与pcr试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mmkcl、10mmtris-hcl(ph8.3)、15mmmgcl2、0.001%(w/v)明胶、0.5-1.0µg变性的模板dna、50pmol的每种寡核苷酸引物、2.5u的taq聚合酶和10%dmso)。所述反应经常含有150-320µm的datp、dctp、dttp、dgtp中的每一种或它们的一种或多种类似物。

新合成的链形成了可以在反应的后续步骤中使用的双链分子。可以根据需要经常重复链分离、退火和延伸的步骤以产生期望的量的与靶mecc-mrsa核酸分子对应的扩增产物。在反应中的限制因素是存在于反应中的引物、热稳定的酶和核苷三磷酸的量。优选地将循环步骤(即，变性、退火、和延伸)重复至少一次。对于在检测中的应用，循环步骤的数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，将需要更多的循环步骤来扩增足够用于检测的靶序列。通常，将循环步骤重复至少约20次，但是可以重复多达40、60或甚至100次。

荧光共振能量转移(fret)

fret技术(参见，例如，美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)是基于这样的概念：当供体荧光部分和对应的受体荧光部分被置于一定相互距离之内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，其可以被目测或以其它方式检测和/或定量。当供体被适当波长的光辐射激发时，供体通常向受体转移能量。受体通常将转移的能量以不同波长的光辐射的形式重新发射。在某些系统中，通过包括基本上非荧光的供体部分的生物分子，可以在供体和受体部分之间转移非荧光能量(参见，例如，美国专利号7,741,467)。

在一个实例中，寡核苷酸探针可以含有供体荧光部分和对应的猝灭剂，所述猝灭剂可以是或不是荧光的，且将转移的能量以光以外的形式消散。当探针完整时，能量转移通常发生在两个荧光部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被淬灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤中，与扩增产物结合的探针通过例如taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性被切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再被淬灭。用于此目的的示例性探针描述在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中。常用的供体-受体对包括fam-tamra对。常用的猝灭剂是dabcyl和tamra。常用的暗猝灭剂包括blackholequenchers™(bhq)(biosearchtechnologies,inc.,novato,cal.)、iowablack™(integrateddnatech.,inc.,coralville,iowa)、blackberry™quencher650(bbq-650)(berry&assoc.,dexter,mich.)。

在另一个实例中，两种寡核苷酸探针（各自含有荧光部分）可以在特定位置处与扩增产物杂交，所述特定位置由寡核苷酸探针与mecc-mrsa靶核酸序列的互补性决定。寡核苷酸探针与扩增产物核酸在适当位置杂交后，产生fret信号。杂交温度可以在约35℃至约65℃范围内持续约10秒至约1分钟。

可以使用例如光子计数表面荧光显微镜系统（含有用于监测在特定范围的荧光发射的适当分色镜和过滤器）、光子计数光电倍增系统或荧光计进行荧光分析。用氩离子激光器、高强度汞（hg）弧光灯、导光纤维光源或针对在期望范围内的激发适当地过滤的其它高强度光源，可以进行激发以引发能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文中关于供体和对应的受体荧光部分使用的，“对应”表示受体荧光部分具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱。受体荧光部分的发射光谱的波长最大值应当比供体荧光部分的激发光谱的波长最大值大至少100nm。因此，它们之间可以产生有效的非辐射能量转移。

通常为了以下目的选择荧光供体和对应的受体部分：（a）高效率forster能量转移；（b）大的最终斯托克斯位移(>100nm)；（c）向可见光谱的红色部分(>600nm)尽可能远的发射位移；和（d）向比由供体激发波长处的激发所产生的拉曼水荧光发射更高的波长的发射位移。例如，可以选择这样的供体荧光部分：其具有它在激光线附近（例如，氦-镉442nm或氩488nm）的激发最大值、高消光系数、高量子产率以及其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可以选择这样的对应的受体荧光部分：其具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及可见光谱的红色部分（>600nm）中的发射。

可以在fret技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、b-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄vs、4-乙酰氨基-4’-异硫氰酰基均二苯乙烯-2,2’-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酰基苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯和4-乙酰氨基-4’-异硫氰酰基均二苯乙烯-2,2’-二磺酸衍生物。取决于所用的供体荧光部分，代表性的受体荧光部分包括lcred640、lcred705、cy5、cy5.5、丽丝胺罗丹明b磺酰氯、异硫氰酸四甲基罗丹明、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸藻红、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯或镧系元素离子(例如，铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光部分可以得自例如molecularprobes(junctioncity,oreg.)或sigmachemicalco.(st.louis,mo.)。

可以将供体和受体荧光部分通过连接臂连接至适当的探针寡核苷酸。每个连接臂的长度是重要的，因为连接臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。连接臂的长度可以是以埃(å)计的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。一般而言，连接臂是约10å至约25å。连接臂可以属于在wo84/03285中描述的种类。wo84/03285也公开了用于将连接臂连接至特定核苷酸碱基以及还用于将荧光部分连接至连接臂的方法。

可以将受体荧光部分（诸如lcred640）与含有氨基接头(例如，c6-氨基氨基亚磷酸酯，可得自abi(fostercity,calif.)或glenresearch(sterling,va))的寡核苷酸结合以产生例如lcred640-标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分（诸如荧光素）与寡核苷酸偶联的接头包括硫脲接头（fitc衍生的，例如，来自glenresearch或chemgene(ashland,mass.)的荧光素-cpg）、酰胺接头（荧光素-nhs-酯衍生的，诸如来自biogenex(sanramon,calif.)的cx-荧光素-cpg）或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-nhs-酯的3’-氨基-cpg。

mecc-mrsa的检测

本发明提供了用于检测mecc-mrsa在生物或非生物样品中的存在或不存在的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。所述方法包括执行至少一个循环步骤和一个fret检测步骤，所述循环步骤包括使用多个mecc-mrsa引物对扩增来自样品的mecc-mrsa靶核酸分子的一部分。优选地在热循环仪中执行多个循环步骤。可以使用mecc-mrsa引物和探针执行所述方法以检测mecc-mrsa的存在，且mecc-mrsa的检测指示mecc-mrsa在所述样品中的存在。

如本文中所述，使用利用fret技术的经标记的杂交探针，可以检测扩增产物。一种fret形式利用taqman®技术来检测扩增产物的存在或不存在，并从而检测mecc-mrsa的存在或不存在。taqman®技术利用一种单链杂交探针，所述探针被例如一种荧光染料和一种猝灭剂（其可以是或不是荧光的）标记。当第一荧光部分被合适波长的光激发时，所吸收的能量根据fret原理被转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在pcr反应的退火步骤中，经标记的杂交探针结合至靶dna（即，扩增产物）并在随后的延伸阶段中通过例如taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性被降解。所以，荧光部分和猝灭剂部分变得在空间上彼此分离。结果，在没有猝灭剂存在下激发第一荧光部分后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。作为实例，abiprism®7700序列检测系统(appliedbiosystems)使用taqman®技术，并且适合用于执行本文中所述的用于检测mecc-mrsa在所述样品中的存在或不存在的方法。

与fret结合的分子信标也可以用于使用实时pcr方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。所述第二荧光部分通常是猝灭剂，且所述荧光标记通常位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成（例如，发夹）的序列的探针寡核苷酸。由于在探针内的二级结构形成，当探针在溶液中时，两个荧光部分处于空间接近。在与靶核酸（即，扩增产物）杂交后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。

fret技术的另一种常见形式利用两种杂交探针。每种探针可以由不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶dna分子（例如，扩增产物）中彼此紧密接近地杂交。供体荧光部分（例如，荧光素）在470nm处被lightcycler®仪器的光源激发。在fret过程中，荧光素将其能量转移给受体荧光部分诸如lightcycler®-red640(lcred640)或lightcycler®-red705(lcred705)。受体荧光部分随后发射更长波长的光，其通过lightcycler®仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分处于直接局部接近时，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的fret才发生。发射信号的强度可以与原始靶dna分子的数目（例如，mecc-mrsa基因组的数目）关联。如果发生mecc-mrsa靶核酸的扩增并且产生扩增产物，则杂交步骤导致基于探针对的成员之间的fret的可检测信号。

通常，fret的存在指示mecc-mrsa在所述样品中的存在，且fret的不存在指示mecc-mrsa在所述样品中的不存在。但是，样本采集不足、运输延迟、不恰当的运输条件或某些采集拭子（藻酸钙或铝柄）的应用都是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内fret的检测指示mecc-mrsa感染。

可以用于实践所述方法的代表性生物样品包括、但不限于皮肤拭子、鼻拭子、创伤拭子、血液培养物、皮肤和软组织感染物。生物样品的采集和保存方法是本领域技术人员已知的。可以处理生物样品（例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒）以释放mecc-mrsa核酸，或在一些情况下，可以使生物样品与pcr反应组分和适当的寡核苷酸直接接触。

解链曲线分析是可以被包括在循环概况中的另外步骤。解链曲线分析是基于dna在被称为解链温度（tm）的特征温度解链的事实，所述解链温度被定义为使一半dna双链体已经分离成单链时的温度。dna的解链温度主要取决于它的核苷酸组成。因而，富含g和c核苷酸的dna分子具有比具有丰富a和t核苷酸的那些更高的tm。通过检测丧失信号时的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号时的温度，可以确定探针的退火温度。来自mecc-mrsa扩增产物的mecc-mrsa探针的解链温度可以证实mecc-mrsa在所述样品中的存在或不存在。

在每次热循环仪运行中，同样使对照样品循环。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针来扩增靶核酸对照模板（而非所述的靶基因的扩增产物）。阳性对照样品还可以扩增例如含有靶核酸分子的质粒构建体。使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针，这样的质粒对照可以在内部（例如，在样品内）扩增或在单独的样品中与患者的样品并排运行。这样的对照指示扩增、杂交和/或fret反应的成功与否。每次热循环仪运行还可以包含阴性对照，例如，其缺乏靶模板dna。阴性对照可以测量污染。这会确保所述系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以容易地确定，例如，引物的序列特异性地退火和开始延伸的能力以及探针的序列特异性地杂交和使fret发生的能力。

在一个实施方案中，所述方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-dna糖基化酶的酶促方法以减少或消除一次热循环仪运行与下一次之间的污染。

与fret技术结合的常规pcr方法可以用于实践所述方法。在一个实施方案中，使用lightcycler®仪器。下述专利申请描述了如在lightcycler®技术中所用的实时pcr：wo97/46707、wo97/46714和wo97/46712。

lightcycler®可以使用pc工作站运行并且可以利用windowsnt操作系统。当机器将毛细管依次置于光学单元上方时，获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间是10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，可以为所有样品不断地更新相对于循环次数的荧光定量显示。可以存储生成的数据用于进一步分析。

作为fret的替代，可以使用双链dna结合染料诸如荧光dna结合染料(例如，sybr®green或sybr®gold(molecularprobes))检测扩增产物。在与双链核酸相互作用后，这样的荧光dna结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链dna结合染料诸如核酸嵌入染料。当使用双链dna结合染料时，通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

应当理解，本发明的实施方案不被一种或多种商购可得的仪器的构型限制。

制品/试剂盒

本发明的实施方案还提供了用于检测mecc-mrsa的制品或试剂盒。制品可以包括用于检测mecc-mrsa的引物和探针以及合适的包装材料。用于检测mecc-mrsa的代表性引物和探针能够与mecc-mrsa靶核酸分子杂交。此外，试剂盒还可以包括dna固定化、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料，如固体支持物、缓冲液、酶和dna标准品。本文中公开了设计引物和探针的方法，并提供了扩增和杂交mecc-mrsa靶核酸分子的引物和探针的代表性的实例。

制品还可以包括用于标记探针的一种或多种荧光部分，或可替换地，可以标记试剂盒所提供的探针。例如，制品可以包括用于标记mecc-mrsa探针的供体和/或受体荧光部分。上面提供了合适的fret供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。

制品还可以含有包装说明书或包装标签，其具有在其上面的关于使用mecc-mrsa引物和探针检测样品中的mecc-mrsa的指导。制品可以额外包括用于实施本文所公开的方法的试剂（例如，缓冲液、聚合酶、辅因子或防止污染的试剂）。这样的试剂可以专用于本文所述的商购可得的仪器之一。

将在以下实施例中进一步描述本发明的实施方案，以下实施例不会限制在权利要求中描述的本发明的范围。

实施例

提供以下实施例和附图以帮助理解主题，其真实范围阐述在所附权利要求中。应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下对所述程序进行修改。

实施例i

mecc-mrsa基因靶标

参考图1-3，用参照序列lga251登记号fr823292评价寡物组#1-8。

mecc-mrsa寡物组#1

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:1)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#1产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#2：

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基da)(seqidno:2)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#2产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#3：

上游引物:(j=叔丁基苄基da)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:3)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#3产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#4：

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基da)(seqidno:4)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#4产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#5：

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基da)(seqidno:5)

探针:(e=thhex(e=thfam,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#5产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#6：

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基da)(seqidno:6)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#6产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#7：

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基da)(seqidno:7)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#7产生的扩增子：

mecc-mrsa寡物组#8：

上游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:9)

下游引物:(j=叔丁基苄基dc)(seqidno:8)

探针:(e=thhex,q=bhq2,p=3'磷酸盐)(seqidno:10)

从寡物组#8产生的扩增子：

尽管为了清楚和理解的目的已经比较详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员通过阅读本发明将清楚，可以在形式和细节上做出各种变化。例如，上述的所有技术和设备可以用在不同的组合中。

序列表

<110>rochediagnosticsgmbh

f.hoffmann-larocheag

rochemolecularsystems,inc.

<120>用于检测含有mecc的甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌的组合物和方法

<130>p32322-wo-hs

<150>us14/558220

<151>2014-12-02

<160>18

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>1

tcttactatcaaaaagattgataactctcgc31

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>2

ctcttttagtttctatgtactttcttactatcaa34

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>3

gaatatcaagtaacatctcagcaatgatac30

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>4

atctgtataaaatagattagtcctttattgcgta34

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>5

tagtaagtgaggttgctgaaattgtacta29

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>6

caattctcataaacctcatacgtaaaga28

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>7

acggcaattctcataaacctca22

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>8

actctcgcaaaacataacggc21

<210>9

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>oligonucletoide

<400>9

gaaatacaaggaaagatgctatcttcc27

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>10

ttgaaccaacgcatgacccaagggc25

<210>11

<211>339

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>11

gaaatacaaggaaagatgctatcttccgaaggattggcccaagaattgaaccaacgcatg60

acccaagggcaaagcgactttgtattcgtcattggcggatcaaatggcctgcacaaggac120

gtcttacaacgcagtaactacgcactatcattcagcaaaatgacatttccacatcaaatg180

atgcgggttgtgttaattgagcaagtgtatagagcgtttaagattatgcgcggagaagcg240

tatcacaaatgatgcggtttttttaacctctttacgtatgaggtttatgagaattgccgt300

tatgttttgcgagagttatcaatctttttgatagtaaga339

<210>12

<211>361

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>12

gaaatacaaggaaagatgctatcttccgaaggattggcccaagaattgaaccaacgcatg60

acccaagggcaaagcgactttgtattcgtcattggcggatcaaatggcctgcacaaggac120

gtcttacaacgcagtaactacgcactatcattcagcaaaatgacatttccacatcaaatg180

atgcgggttgtgttaattgagcaagtgtatagagcgtttaagattatgcgcggagaagcg240

tatcacaaatgatgcggtttttttaacctctttacgtatgaggtttatgagaattgccgt300

tatgttttgcgagagttatcaatctttttgatagtaagaaagtacatagaaactaaaaga360

g361

<210>13

<211>454

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>13

gaaatacaaggaaagatgctatcttccgaaggattggcccaagaattgaaccaacgcatg60

acccaagggcaaagcgactttgtattcgtcattggcggatcaaatggcctgcacaaggac120

gtcttacaacgcagtaactacgcactatcattcagcaaaatgacatttccacatcaaatg180

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<210>14

<211>537

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>14

gaaatacaaggaaagatgctatcttccgaaggattggcccaagaattgaaccaacgcatg60

acccaagggcaaagcgactttgtattcgtcattggcggatcaaatggcctgcacaaggac120

gtcttacaacgcagtaactacgcactatcattcagcaaaatgacatttccacatcaaatg180

atgcgggttgtgttaattgagcaagtgtatagagcgtttaagattatgcgcggagaagcg240

tatcacaaatgatgcggtttttttaacctctttacgtatgaggtttatgagaattgccgt300

tatgttttgcgagagttatcaatctttttgatagtaagaaagtacatagaaactaaaaga360

gtatttttatctacaatagcatttataatttattctattattgtatactttattttaatt420

attagtatcattgctgagatgttacttgatattctatgtctattttttaggaaattctat480

actattaaaattatggtattttatacgcaataaaggactaatctattttatacagat537

<210>15

<211>614

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>15