专利名称：来自蜱的树突状细胞抑制蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及树突状细胞(DC)调节蛋白。具体而言，本发明涉及调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和/或成熟的蛋白，还涉及对此类蛋白的可能对其结构和功能重要的基序和特征的鉴定。此类蛋白可以从节肢动物唾液、且更具体为蜱(tick)唾液中分离。本发明还涉及此类蛋白在治疗中的应用，并具体涉及此类蛋白在治疗自身免疫性疾病、过敏、自身炎症性疾病及其他免疫相关的敏感症(也称超敏性疾病)、移植反应(例如移植排斥及移植物抗宿主疾病)、传染病(包括由蜱传染的传染病)、癌症(包括血液学恶性肿瘤)和急性及慢性炎症性疾病(包括与上述疾病相关的炎症)中的应用。
背景技术：
哺乳动物特别是人类的免疫系统由两部分组成，即固有免疫系统和适应性免疫系统。固有免疫系统的细胞以一般方式识别并应答传染原。虽然固有免疫系统是抵御感染的重要直接屏障，但其并不提供特异性的、持久的保护来抵御外来实体(例如侵入性病原体)。与此相反，适应性免疫系统的细胞识别特定的外来实体，并且在宿主体内诱发对这些特定实体的免疫记忆。在被病原体感染后，DC很快与固有免疫系统的组成部分相互作用，而且还形成哺乳动物适应性免疫应答的核心部分。DC从前体细胞分化为未成熟DC。身体各处都存在未成熟DC ;虽然免疫系统的其他细胞也参与此功能，但是未成熟DC是主要通过其触发T细胞活化的能力来负责启动适应性免疫应答的主要细胞类型。未成熟DC通过诸如Toll样受体(TLR)等模式识别受体(PRR)持续地从其周边环境中针对诸如病毒、细菌和寄生物等传染原进行取样，所述模式识别受体识别外来实体表面(例如病原体表面)上的特定化学信号。一旦将实体(例如病原体)鉴定为外来实体，未成熟DC即内化该实体或 其片段，从而将蛋白抗原和脂类抗原降解为肽及糖肽或脂类片段并将其提呈至DC的表面。在应答对外来实体的识别和/或细胞环境内的其他信号(例如炎性细胞因子)时，未成熟DC经历若干变化(统称为“成熟”)并且开始发育为成熟DC。成熟中的DC上调主要组织相容性复合体(MHC)和MHC相关分子(例如⑶I)的表达，其中，MHC与源自外来实体的肽和糖肽结合并使其呈现在DC表面，而MHC相关分子与源自外来实体的脂或糖脂结合并使其呈现在DC表面。与此同时，DC上调以下细胞表面受体的表达所述受体是在T淋巴细胞活化中担任协同受体的协同刺激分子(包括⑶80、⑶86和⑶40)。此外，DC开始跟随趋化信号向淋巴组织(例如淋巴结和/或脾)迁移。当处于淋巴组织中时，DC通过向T淋巴细胞提呈源自外来实体的肽和糖肽或脂片段并传递适当的协同刺激信号来活化T淋巴细胞。由此活化的T淋巴细胞负责传播适应性免疫应答。所述外来实体可以是病原体、过敏原、移植抗原(例如主要移植抗原或次要移植抗原)、血型抗原或在自身免疫应答情况下被身体误鉴定为外来抗原的自身抗原。除了具有通过抗原提呈和协同刺激来触发T细胞活化的作用外，成熟DC还参与T细胞调节，例如，将辅助性T细胞极化为Thl、Th2、Thl7或调节性(Treg)细胞、细胞毒性T细胞的活化和对T细胞归巢(例如，进入皮肤或肠及其他粘膜部位)的调节。DC在适应性免疫应答中所起的核心作用已经引起了对以治疗为目的的DC功能调节的兴趣，而且动物模型已表明DC调节因子可以用于治疗自身免疫性疾病和其他炎症性疾病(Subklewe 等,Human Immunology, 2007, 68 (3), 147-155)。此外据表明，DC调节因子可以用于治疗癌症(Banchereau, J.等，Ann N Y Acad Sci, 2003，987，180-187 和 Figdor, C.G.等，Nature medicine, 2004, 10 (5)，475-480)。蜱和其他一些吸血节肢动物附着于其宿主(包括诸如人等哺乳动物)上并长期进行吸食。吸血节肢动物传递给宿主的成分、包括唾液中的成分，能够潜在地诱发宿主免疫应答。此类应答可能对节肢动物有害，因此该节肢动物可能需要抑制这些应答。鉴于DC在触发免疫性中的核心作用，对该节肢动物而言产生抑制DC功能的蛋白可以是有益的。吸血节肢动物，特别是蜱，可以通过对宿主接种多种抗炎成分和免疫调节成分来抑制宿主的免疫系统(Ribeiro等，Infectious Agents andDisease, 1992，4(3)，143-152)。已经在蜱唾液中鉴定出若干种免疫调节分子，其中包括巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的一种同源物(Jaworski 等，Insect Molecular Biology, 2001，10 (4)，323-331)、白细胞弹性蛋白酶抑制剂(其由人类巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞分泌)的一种同源物(Leboulle 等,The Journal of Biological Chemistry,2002，277 (12)，10083-10089)、糖基化的蛋白p36(据信其抑制丝裂源所促进的鼠脾细胞体外增殖)(Bergman等，Journalof Parasitology, 2000，86，516-525)、B 细胞抑制蛋白(BIP) (Hannier 等，Immunology,2004, 113, 401-408)和 B 细胞抑制因子(BIF) (Yu 等，Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 2006, 343, 585-590)。Salpl5是一种存在于蜱唾液中的蛋白，已发现其作用于未成熟的人DC(Anguita 等，Immunity,2002, 16,849-859 ；Hovius 等，Vector borne and Zoonoticdiseases, 2007，7 (3)，296-302)。然而，涉及到在免疫刺激物存在的情况下将未成熟的人DC与Salpl5温育的测定已表明，Salpl5并不抑制协同刺激分子(如⑶86)的上调。因此Salpl5并不抑制人DC的成熟。前列腺素E2 (PGE2)是一种存在于蜱唾液中的非蛋白分子，其可以调节未成熟的鼠DC的活性,但是对这些鼠DC的成熟影响甚微(Sa-Nunes等,The Journal of Immunology,2007，179，1497-1505)。PGE2能够增进人DC的成熟，但是尚无证据表明其能够起到抑制人DC的分化和成熟的作用。另外已据表明，蜱唾液和唾液腺提取物(SGE)可能具有调节鼠DC的分化和成熟的能力(Cavassani 等，Immunology, 2005，114，235-245 ;Skallova 等，Journal ofImmunology,2008, 180, 6186-6192)。已从蜱物种具尾扇头蜱中分离出了一种DC调节分子， 且已显示出其调节哺乳动物DC的分化和成熟(PCT/GB2009/002219)。特别的是，已显示该分子通过抑制CDla的上调和CD14的下调(分化为DC的标志)来改变分化培养物的发育，并抑制T细胞增殖。该分子称为Japanin (SEQ ID NO: 8)，并且在其他蜱物种中已鉴定出有限的几种Japanin同源物(SEQ ID NO: 10、12、14和16)。出于治疗目的，鉴定出作为DC调节因子的其他Japanin同源物将是有益的。此外，鉴定出此类DC调节蛋白的负责其功能的关键基序和特征也将是有益的。
发明内容
出人意料的是，本发明人现已鉴定出与Japanin同源的多种其他蝶蛋白，意味着保守性功能。通过对这些蛋白的鉴定，发明人已能够确定这些DC调节蛋白的可能对其在DC调节中的功能重要的基序和特征。因此，本发明提供DC调节蛋白，其中，所述蛋白调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和/或成熟，且所述蛋白优选包含在多种此类蛋白基础上鉴定出的多个保守基序和特征中的至少一个，并认为这些保守基序和特征对此类蛋白的功能是重要的。本发明的蛋白在第一方面，本发明包含一种DC调节蛋白，其中，所述蛋白调节DC的分化和/或成熟,并且包含i)SEQ ID NO: 2 (RaA), SEQ ID NO: 4 (RaB)或 SEQ ID NO: 6 (Rsl)中任何一个的氨
基酸序列；ii)i)中定义的蛋白的同源物，且所述同源物与i)中定义的蛋白的同一性为至少20% ;或 iii)上述i)中定义的蛋白或上述ii)中定义的同源物的活性片段。在另一方面，本发明包含一种树突状细胞(DC)调节蛋白，其中，所述蛋白调节哺乳动物DC的分化和/或成熟，并且包含i)下述a)、b)或c)中任何一个的氨基酸序列a) SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 28 (RaA) ；b) SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 26 或SEQ ID NO: 29 (RaB) ；c) SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:24 或 SEQ ID NO:27(Rsl)；ii)i)中定义的蛋白的同源物，且所述同源物与i)中定义的蛋白的同一性为至少40% ;或iii)上述i)中定义的蛋白或上述ii)中定义的同源物的活性片段。在一个实施方式中，本发明的蛋白可以由下述a)、b)或c)中任何一个的氨基酸序列构成a) SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 25 或 SEQ ID NO: 28 (RaA) ；b)SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 26 或 SEQ ID NO: 29 (RaB) ；c)SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 24 或 SEQ ID NO: 27 (Rsl)。在一个实施方式中，本发明的蛋白可以由SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中任何一个的氨基酸序列构成。本发明的蛋白的活性本发明的蛋白“调节”(即改变)或“抑制”(即减少)哺乳动物DC的分化和/或成熟。在一些实施方式中，本发明的蛋白“调节”(即改变)或“抑制”(即减少)哺乳动物DC的分化和成熟。在一个实施方式中，这些DC可以是人DC。在另一个实施方式中，除哺乳动物DC外，本发明的蛋白还可以调节或抑制爬行动物DC和/或鱼DC的分化和/或成熟。下文描述了用于评估对DC分化和成熟的调节或抑制的适合测定。对技术人员显而易见的是，本文所述的用于评估对分化和成熟的调节或抑制的标志物仅是以实例方式提供，而并不试图进行限制。在一个实施方式中，通过例如下文讨论的测定测得，本发明的蛋白使DC的分化和成熟都减少了至少20%。在另外的实施方式中，对DC分化和/或成熟的抑制可以是 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。“DC分化”的意思是细胞前体(例如源自骨髓的祖细胞或血液单核细胞)发育为未成熟DC。可以使用本领域已知的标准测定来在表型上并最终在功能上评估对DC分化的调节(例如抑制)。这些测定包括对在DC分化过程中受到调控的CD14和CDla的表达进行评估。评估对DC分化的抑制的其他方法将是本领域技术人员已知的。可以使用细胞标志物来评估前体向未成熟DC的表型分化所受到的抑制，在前体细胞分化为未成熟DC时这些细胞标志物的表达发生变化。例如，单核细胞是呈CD14阳性和⑶Ia阴性的DC前体。未成熟DC具有低水平⑶14 (且在一些实施方式中呈⑶14阴性)并且呈⑶Ia阳性。因此，凭借⑶14的减少和⑶Ia的增加，可以检测出单核细胞向未成熟DC的分化。凭借具有高水平⑶14 (且在一些实施方式中呈⑶14阳性)并且呈⑶Ia阴性的前体细胞的持续存在，可以检测出本发明的蛋白抑制了前体细胞向未成熟DC的分化。可以使用根据活性将前体细胞和已分化的DC区分开的任何测定来评估前体细胞和发育完全的DC的功能分化。举例而言，与前体细胞不同，发育完全的DC(特别是在进行下文所述的刺激之后)在体外测定中能够触发T细胞的增殖。常见的T细胞增殖测定包括同种异基因混合白细胞反应(MLR)和氧化性有丝分裂发生。“DC成熟”是指在前体细胞已分化为未成熟DC后发生的过程。具体而言，该术语涉及在分化的未成熟DC遭遇刺激物并转化为成熟DC时发生的变化。所述刺激物可以是通过PRR(例如TLR)被感知的传染原(例如病原体)的成分，通过细胞因子受体而起作用的某些细胞因子，和/或其他细胞类型的特化细胞表面分子(例如活化的T细胞的CD154)。与未成熟DC的成熟有关的变化通常包括协同刺激分子(例如⑶80和⑶86)的表达上调以及DC表面的抗原提呈，所述抗原来自源于病原体的成分，且其形式通常为肽-MHC复合体和脂-⑶I复合体。未成熟DC的成熟还可以与DC向二级淋巴组织的迁移关联。本发明的蛋白可以调节或抑制与未成熟DC的成熟有关的这些变化中的任何一种。因此可以通过本发明的分子使⑶86和/或⑶80和/或MHC分子的表达下降的能力，来评估其抑制未成熟DC成熟的能力。可以通过本发明的蛋白使TNF α的表达和/或分泌下降的能力，来评估其抑制未成熟DC成熟的能力。可以通过本发明的蛋白使Β7同源物I (Β7-Η1或C274)的表达水平升高的能力，来评估其调节DC成熟的能力。可选的是，可以在进行聚(1:C)、LPS或IFNy刺激后评估本发明的蛋白抑制DC成熟的能力。可选的是，可以在进行CD40L、IFNa或者TLR7或TLR8配体(如CL097)刺激后评估本发明的蛋白抑制DC成熟的能力。评估未成熟DC的成熟所受到的抑制的其他方法将是本领域技术人员已知的。如上所述，本发明的蛋白调节并优选抑制前体细胞分化为未成熟DC，并且调节并优选抑制随后发生的未成熟DC成熟为成熟DC。如下文更详细描述的，这种对DC的分化和成熟的调节或抑制可能在整体上对免疫系统具有下游调节效果。在被抗原提呈细胞活化前，T淋巴细胞称为“初始”细胞。每个T淋巴细胞都对特定的抗原具备特异性，且只能由提呈同种抗原(cognate antigen)的“特化”抗原提呈细胞(例如DC)来活化。常规的T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)来识别抗原-MHC复合体，所述T细胞受体是包含α链和β链的异 源二聚结构体。然而，在无协同刺激的情况下，通过TCR进行的信号传递会导致抗原不应(antigen-unresponsiveness)或无能(anergy)状态，或者会导致中断性活化(abortive activation)和细胞死亡。所以，协同刺激分子对于T淋巴细胞的活化至关重要，协同刺激分子在未成熟DC表面在成熟过程中得到上调，并且被T淋巴细胞表面上的诸如⑶28 (对于⑶80和⑶86的情况)或⑶154 (对于⑶40)等受体分子识别。在本发明的一个方面中，本发明的蛋白所提供的对DC分化和/或成熟的抑制作用导致了 T淋巴细胞活化的下降。“T淋巴细胞活化”是指辅助性T细胞(包括Thl、Th2、Thl7或Treg细胞)的活化，并且可选地指细胞毒性T细胞的活化，其通常依赖于辅助性T细胞的事先活化。
可以用本领域的已知方法对T细胞活化的下降进行评估。可以通过以下方法来评估T细胞的活化，例如但不限于通过对细胞因子的分泌[例如白细胞介素(IL)-2的产生]或对DC触发的T细胞增殖进行体外测定(例如同种异基因的MLR和氧化性有丝分裂发生)，或通过使用对在抗原再次刺激之前和之后离体(ex vivo)分离出的T细胞的相似测定来对T细胞在正常或转基因动物中对模型抗原(例如卵清蛋白)的应答进行体内测定。在一个实施方式中，与在抑制DC分化和/或成熟的蛋白不存在的情况下进行的标准测定相比，本发明的蛋白使T淋巴细胞的活化下降了至少约20%。在其他实施方式中，对DC分化和成熟的抑制作用可以使T淋巴细胞的活化下降至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在本发明的一个方面中，本发明的蛋白所提供的对DC分化和/或成熟的调节或抑制作用导致了对T淋巴细胞调控的调节。特别而言，本发明的分子可以对T淋巴细胞向Thl细胞、Th2细胞、Thl7细胞、调节性T(Treg)细胞或滤泡样辅助性T (Thf)细胞的极化进行调节。通过在体外测定中测量通常与不同类型的⑶4和⑶8T淋巴细胞相关的源自T淋巴细胞的细胞因子，可以评估本发明的蛋白对T淋巴细胞极化的调节作用。对于Thl细胞，所述细胞因子包括IFN- Y ;对于Th2细胞，包括IL-4、IL5和IL-13 ;对于Thl7细胞，IL-17 ；对于 Treg 细胞，IL-10 和 TGF β。通过分别测量 T_bet、GATA-3、ROR- Y _t 或 ROR- Y _c 以及FoxP3的表达，或者通过测量Thf细胞的Bcl6的表达，还可以测定⑶4细胞的相应类型。作为另一选择，可以对不同细胞的表型进行表型评估，例如通过评估其所表达的趋化因子受体和其他表型标志物。T淋巴细胞是哺乳动物免疫应答中的主要促进因子之一。因此，如上所述，本发明的蛋白所致的T淋巴细胞活化的降低，或者该T淋巴细胞极化的变化，将会导致对免疫应答的整体调节，而且特别会导致与免疫应答相关的细胞因子的水平发生变化。例如，本发明的蛋白可以具有一般性免疫抑制效果。对本领域技术人员而言显而易见的是，使用本领域已知的多种方法中的任何一种都可以测量免疫应答中的调节(例如免疫抑制效果)。通过寻找在应答TLR刺激时最快产生的促炎细胞因子(例如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子α 0'即(1))、干扰素-(1、干扰素-β或通常在感染后在中间时段产生的细胞因子(例如IL-6或IL-12)的水平下降，可以测量整体免疫应答的下降或对其的调节。本发明的蛋白还可以使抗炎细胞因子(例如IL-10或TGF-β)的水平升高。在一个实施方式中，与在抑制DC分化和/或成熟的蛋白不存在的情况下进行的标准测定相比，本发明的蛋白使促炎细胞因子的水平下降至少约20%或使抗炎细胞因子的水平升高至少20%。在其他实施方式中，对DC分化和/或成熟的抑制作用可以使促炎细胞因子的水平下降或使抗炎细胞因子的水平上升至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。还可以通过多种其他方法来对免疫抑制效果进行评估，例如局部炎症减少，或所产生的抗原特异性T细胞和B细胞库的大小或活性的减少。可以从中分离出本发明的蛋白的节肢动物本发明的蛋白可以从节肢动物中分离出。“节肢动物”定义为属于节肢动物门的动物，其包括昆虫、甲壳类动物和蜘蛛类动物。节肢动物的特征是分节的躯体和由甲壳素构成的坚硬外骨骼。在本发明的一个方面中，可以从吸血节肢动物中分离出本发明的蛋白。术语“吸血节肢动物”包括所有从适合的宿主吸食血液的节肢动物。其包括蜱、螨以及诸如虱、蚤和蚊等昆虫。通常称其为血液吸食节肢动物，并且这两种术语在本申请中将可以互换使用。在本发明的另一个方面中，分离出的吸血节肢动物可以是蜱。术语“蜱”是为蜱总科中的小型蜘蛛类动物指定的共同名称，其包括在吸血节肢动物中。蜱是外寄生物，靠哺乳动物、鸟类和爬行动物的血液生活。蜱还可以靠两栖动物的血液生活。存在约900个蜱物种，且发现这些物种遍布全世界。不同蜱物种的特征在于其偏好的栖息场所和其地理 分布。大多数蜱物种能够对多种宿主物种(包括人)进行吸食。如上文所讨论的，节肢动物、特别是蜱可以通过对宿主接种多种抗炎成分和免疫调节成分来抑制宿主的免疫系统。可以从任何已知的蜱物种中分离出本发明的DC调节蛋白，所述蜱物种包括属于硬蝶亚科(Ixodinae)、凹沟蝶亚科(Bothriocrotoninae)、花蝶亚科(Amblyomminae)、血蝶亚科(Haemaphysalinae)、扇头蝶亚科(Rhipicephalinae)、璃眼蝶亚科(Hyalomminae)、纳蝶科(Nuttalliellidae)、软蝶亚科(Argasinae)、残_蝶亚科(Otobinae)、匙_蝶亚科(Antricolinae)、伪盾蝶亚科(Nothoaspinae)和纯缘蝶亚科(Ornithodorinae)的物种；举例而言，任何一种下述蝶物种具尾扇头蝶(Rhipicephalus appendiculatus)、血红扇头蝶(Rhipicephalus sanguineus)、囊状扇头蝶(Rhipicephalus bursa)、美洲纯眼蝶(Amblyomma americanum)、卡延纯眼蝶(Amblyomma cajennense)、希伯来纯眼蝶(Amblyomma hebraeum)、彩饰纯眼蝶(Amblyomma variegatum)、微小牛蝶(Rhipicephalus(Boophilus)microplus)、具环牛蝶(Rhipicephalus(Boophilus)annulatus)、消色牛蝶(Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus)、网纹革蝶(Dermacentorreticulatus)、安氏革蝶(Dermacentorandersoni)、边缘革蝶(Dermacentor marginatus)、变异革蝶(Dermacentor variabilis)、铁角血蝶(Haemaphysalis inermis)、犬血蝶(Haemaphysalis Ieachii)、刻点血蝶(Haemaphysalis punctata)、小亚璃眼蝶(Hyalommaanatolicum anatolicum)、胳骑璃眼蝶(Hyalomma dromedarii)、边缘璃眼蝶(Hyalommamarginatum marginatum)、蓖子硬蝶(Ixodes ricinus)、全沟硬蝶(Ixodes persulcatus)、肩突硬蝶(Ixodes scapularis)、六角形硬蝶(Ixodes hexagonus)、波斯锐缘蝶(Argaspersicus)、鴻锐缘蝶(Argas ref Iexus)、游走纯缘蝶(Ornithodoros erraticus)、毛白纯缘蝶(Ornithodoros moubata moubata)、毛白纯缘蝶猪亚种(Ornithodoros moubataporcinus)和萨氏纯缘蝶(Ornithodoros savignyi)。
同源物本发明包括具有下述a)、b)或c)中任何一个的氨基酸序列的蛋白的同源物和活性片段a) SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO:28 (RaA) ；b) SEQ ID NO:4, SEQ IDNO: 26 或 SEQ ID NO:29 (RaB) ；c)SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 24 或 SEQ ID NO: 27 (Rsl)。本发明包括具有SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中任何一个的氨基酸序列的蛋白的同源物和活性片段。术语“同源物”旨在包括保留了调节并优选抑制DC分化和/或成熟的能力的在SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4 和 SEQ ID NO: 6 中或者在 SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25,SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29中公开的本发明的蛋白的旁系同源物和直系同源物。同源物可以具有调节并优选抑制DC分化和/或成熟的能力，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的减少或对T淋巴细胞极化的调节。在一个实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:25或SEQ IDNO:28中任何一个的序列同一 性为至少20%的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在其他实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:25或SEQID NO:28 中任何一个的序列同一性为至少 40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、98%、99%或更高的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在一个实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID N0:2的序列同一性为至少20%的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在其他实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID N0:2的序列同一1注为至少 40%、47%、48%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。本文所述的百分比同一性使用clustalW并使用以下选项来确定空位延伸罚分=0.1 ;空位罚分=10. ο ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。作为另一选择，百分比同一性值可以使用BLAST (版本2.1. 3)且用NCBI(美国国家生物技术信息中心；http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)所指定的缺省参数[Blosum 62矩阵；空位罚分=11，空位延伸罚分=1]来确定。在一个实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:26或SEQ IDNO: 29的序列同一性为至少20%的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在其他实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:26或SEQ ID N0:29的序列同一1注为至少 40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在一个实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:4的序列同一性为至少20%的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在其他实施方式中，本发明包括包含与 SEQ ID NO: 4 的序列同一性为至少 40%、50%、53%、54%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在一个实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:24或SEQ IDNO: 27的序列同一性为至少20%的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在其他实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 27的序列同一1注为至少 40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在一个实施方式中，本发明包括包含与SEQ ID NO:6的序列同一性为至少20%的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。在其他实施方式中，本发明包括包含与 SEQ ID NO: 6 的序列同一性为至少 40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、98%、99%或更高的氨基酸序列的蛋白，或由所述氨基酸序列构成的蛋白。本发明的蛋白的同源物还包括包含在SEQ ID NO:2、4、6、24、25、26、27、28或29上进行的氨基酸替换、插入或缺失的突变蛋白，条件是调节并优选抑制DC的分化和/或成熟的能力得到保留。突变蛋白可以具有调节并优选抑制DC分化和/或成熟的能力，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的减少或对T淋巴细胞极化的调节。在另一个实施方式中，突变蛋白可以具有调节并优选抑制DC分化和/或成熟的能力，从而如上所述形成对免疫应答的抑制。 因此突变蛋白包括含有保守性氨基酸替换的蛋白，所述替换不会对蛋白的功能或活性造成不利影响。该术语还旨在包括天然的生物学变异体(例如，本发明的分离出的节肢动物蛋白所源自的物种中的等位变异体或地理变异)。通过对蛋白序列中的特定残基进行系统突变或定点突变，还可以设计出与野生型蛋白序列相比在调节或抑制DC的分化和/或成熟方面活性提高的突变蛋白。同源物可以源自下述蜱物种，所述蜱物种包括但不限于具尾扇头蜱、血红扇头蜱、囊状扇头蜱、美洲钝眼蜱、卡延钝眼蜱、希伯来钝眼蜱、彩饰钝眼蜱、微小牛蜱、具环牛蜱、消色牛蜱、网纹革蜱、安氏革蜱、边缘革蜱、变异革蜱、铁角血蜱、犬血蜱、刻点血蜱、小亚璃眼蜱、骆驼璃眼蜱、边缘璃眼蜱、蓖子硬蜱、全沟硬蜱、肩突硬蜱、六角形硬蜱、波斯锐缘蜱、鸽锐缘蜱、游走钝缘蜱、毛白钝缘蜱、毛白钝缘蜱猪亚种和萨氏钝缘蜱。同源物还可以源自蚊物种，包括属于库蚊属、按蚊属和伊蚊属的物种，特别是致乏库蚊(Culexquinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和 R 比亚按蚊(Anopheles gambiae);蚤物种，例如猫柿首蚤(Ctenocephalides felis)(猫蚤)；马蝇；白蛉；墨蚊；舌蝇；風；螨。通常，同源物可以源自任何已知的蜱物种，例如属于硬蜱亚科、凹沟蜱亚科、花蜱亚科、血蜱亚科、扇头蜱亚科(包括璃眼蜱亚科)、纳蜱科、软蜱亚科、残喙蜱亚科、匙喙蜱亚科和钝缘蜱亚科中的物种。本领域的技术人员应当清楚鉴定本发明的蛋白的同源物的方法。例如，可以通过对公共和私人的序列数据库进行同源性搜索来鉴定同源物。方便起见，可以使用公用的数据库，但是私人的或付费的数据库将同样有用，特别是在其包含了公共数据库中没有的数据时。原始数据库是存放原始核酸或氨基酸序列数据的站点，其可以是公用的或付费的。公用原始数据库的实例包括GenBank数据库(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)、EMBL数据库(http://www. eb1. ac. uk/)、DDBJ 数据库(http://www. ddb j. nig. ac. jp/)、SffISS-PROT蛋白质数据库(http://expasy. hcuge. ch/)、PIR(http://pirgeorgetown. edu/)、TrEMBL (http: //www. eb1. ac. uk/)、TIGR 数据库(参见 http://www. tigr. org/tdb/index,html)、NRL-3D 数据库(http://www. nbrfa. georgetown. edu)、蛋白质数据库(http://www. rcsb. org/pdb) > NRDB 数据库(ftp://ncb1.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OffL 数据库(http: //www. biochem. ucl. ac. uk/bsm/dbbrowser/OffL/),以及二级数据库PR0SITE (http://expasy. hcuge. ch/sprot/prosite. html)、PRINTS (http://iupab. leeds.ac. uk/bmb5 dp/print s. html)、Profiles (http: //ulrec3. unil. ch/sof tware/PFSCAN_form, html)、Pfam(http://www. sanger, ac. uk/software/pfam)、Identify(http://dna.Stanford, edu/identify/)和 Blocks (http: //www. blocks, fhcrc. org)。付费数据库或私人数据库的实例包括 PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.)和 PathoSeq (IncytePharmaceuticals Inc.)。尽管发明人不愿受理论束缚，但据推定氨基酸序列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6可以不是全长序列。因此，本发明设定在包含氨基酸序列SEQ ID NO:2, SEQID N0:4或SEQ ID NO:6的蛋白的N端和/或C端可以存在其他氨基酸。在一个实施方式中，本发明包括在SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中任一个的序列的N端和/或 C 端添加有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸的蛋白。 据信SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列代表全长蛋白。据推测，SEQ ID NO:27,SEQ ID N0:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列代表成熟蛋白(其意思是通常对应于分泌产物的没有信号序列的蛋白)。本发明还设定，在包含下述a)、b)或
c)的氨基酸序列的蛋白的N端和/或C端可以存在其他氨基酸a) SEQ ID NO: 2, SEQ IDN0:25或SEQ ID NO:28 (RaA) ；b) SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:26或SEQ ID NO:29 (RaB) ；c)SEQID NO: 6、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO: 27 (Rsl)。在一个实施方式中，本发明包括在下述a)、
b)或c)中任一个的序列的N端和/或C端添加有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸的蛋白a) SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 25或 SEQ ID NO:28 (RaA) ；b) SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:26 或 SEQ ID NO:29 (RaB) ；c)SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:24 或 SEQ ID NO:27(Rsl)。在一个实施方式中，本发明还包括本发明的蛋白的功能等价物。本文使用术语“功能等价物”来描述具有以对应于本发明的蛋白的方式调节并优选抑制DC的分化和/或成熟的能力的任何分子。其包括合成产生的蛋白、蛋白的合成变体、提供对应活性但具有不同序列的蛋白分子、具有对应活性的天然存在的非蛋白分子和具有对应活性的合成的非蛋白分子。其还包括半合成产生的蛋白、蛋白的半合成变体和具有对应活性的半合成的非蛋白分子。还包括模仿本发明的蛋白的调节并优选抑制DC的分化和/或成熟的能力的抗体。特别而言，将设计用来模仿本发明的蛋白的三级结构或活性位点的合成分子视为功能等价物。在一个实施方式中，功能等价物具有调节并优选抑制DC分化和/或成熟的能力，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的减少或对T淋巴细胞极化的调节。在另一个实施方式中，功能等价物具有调节并优选抑制DC分化和/或成熟的能力，从而如上所述形成对免疫应答的抑制。在一个实施方式中，同源物可以保留DC调节蛋白(SEQ ID NO:2、4和6或者SEQID N0:24、25、26、27、28或29)的一个或多个保守性基序和特征。如下文所述，这些保守性基序和特征包括包含保守性糖基化位点的序列、半胱氨酸分布模式、CXXW基序、脂质结合能力和受体结合能力。在某些实施方式中，本发明的蛋白或其同源物不具有SEQ ID N0:8、10、12、14或16中任何一个的氨基酸序列。这些序列分别与PCT/GB2009/002219中的SEQ ID N0:2、4、6、8和10对应。片段本发明还提供本发明的蛋白的“活性片段”及这些序列的同源物。此定义中包括保留了调节或抑制哺乳动物DC的分化和/或调节的能力的任何片段。如上所述，此类片段不仅包括SEQ ID NO:2、4和6或者SEQ ID NO:24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的片段，还包括该蛋白的同源物的片段。此类同源物的片段与SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中任何一个的氨基酸序列的片段的同一性通常会超过20%。所述同源物的片段与下述i)、ii)或iii)中任何一个的氨基酸序列的片段的同一性通常会超过 20% :1) SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO:28 ；ii)SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:26 或 SEQ ID NO:29 ;iii)SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:24 或 SEQ ID N0:27。在某些实施方式中，同源物的片段会表现出超过30%、40%、47%、48%、50%、52%、53%60%、70%、80%、81%、82%、90%、95%、98%或99%的分别与分离出的节肢动物蛋白(SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:4 或 SEQ ID NO:6)的片段的同一性。在其他实施方式中，同源物的片段会表现出超过30%、40%、47%、48%、50%、52%、53%60%、70%、80%、81%、82%、90%、95%、98%或99%的分别与分离出的节肢动物蛋白(下述i)、ii)或iii)中任何一个)的片段的同一性i)SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:25或SEQ ID NO:28 ；ii)SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:26 或 SEQ ID NO:29 ;iii)SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:24 或 SEQID N0:27。本发明的蛋白片段优选是上述SEQ ID NO: 2、4或6或者SEQ ID NO: 24、25、26、26、28或29及其同源物的活性片段。这些片段优选调节且更优选抑制DC的分化和/或成熟。在一个实施方式中，本发明的蛋白的片段调节并优选抑制DC的分化和/或成熟，从而如上所述导致T淋巴细胞活化的减少或对T淋巴细胞极化的调节。在另一个实施方式中，本发明的蛋白的片段调节并优选抑制DC的分化和/或成熟，从而如上所述形成对免疫应答的抑制。通过对SEQ ID NO: 2、4或6或者SEQ ID NO: 24、25、26、26、28或29中任何一个的氨基酸序列进行系统突变或片段化，当然可以合理设计出在调节或抑制DC的分化和/或成熟方面活性提高的片段。在一个实施方式中，本发明的蛋白或其同源物的片段的长度可以是至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。本发明的片段可以包含来自SEQ ID NO: 2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中任一个的氨基酸序列或其同源物的至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100 或更多个连续氨基酸。本发明的片段可以包含来自下述i)、ii)或iii)中任一个的氨基酸序列或其同源物的至少 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100 或更多个连续氨基酸i)SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO:28 ；ii)SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:26 或 SEQ IDN0:29 ；iii)SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:24 或 SEQ ID N0:27。本发明的蛋白片段可以保留DC调节蛋白(SEQ ID NO:2、4、6、24、25、26、27、28和29)的一个或多个保守性基序和特征。在一个实施方式中，本发明的蛋白片段可以保留DC调节蛋白(SEQ ID N0:2、4和6)的一个或多个保守性基序和特征。如下文所述，这些保守性基序和特征包括包含保守性糖基化位点的序列、半胱氨酸分布模式、CXXW基序、脂质结合能力和受体结合能力。糖基化发明人已发现DC调节蛋白在一个或多个位置发生了糖基化。因此，在一个方面中，本发明的蛋白可以在一个或多个位置发生糖基化。在一个实施方式中，所述蛋白可以在一个、两个、三个或更多位置发生糖基化。本发明的蛋白优选N-糖基化(即，多糖连接至天冬酰胺氨基酸残基)，但是该蛋白还可以在一个或多个位置发生O-糖基化(S卩，N-乙酰半乳糖胺连接至丝氨酸或苏氨酸残基)。在一个实施方式中，糖部分可以包含一个或多个甘露糖或岩藻糖或半乳糖单元。 发明人还发现，本发明的DC调节蛋白在糖基化位点附近具有共有序列。该共有序列在保守性位置具有将发生糖基化的氨基酸残基。在一个实施方式中，将发生糖基化的氨基酸残基是天冬酰胺残基(在N-糖基化的情况下)或者是丝氨酸或苏氨酸残基(在O-糖基化的情况下)。在RaA(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置115、RaB(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置113和Rsl(SEQ IDNO: 6)的氨基酸位置116，本发明的蛋白具有天冬酰胺氨基酸残基。此夕卜，在全长RaA蛋白(SEQ ID NO:25)的氨基酸位置154、全长RaB蛋白(SEQ ID NO:26)的氨基酸位置153或全长Rsl蛋白(SEQ ID NO: 24)的氨基酸位置155，本发明的蛋白具有天冬酰胺氨基酸残基。这些位置对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的残基155。因此，在一个实施方式中，在对应于SEQ ID NO:2、4或6中任何一个的序列中的氨基酸位置110 120中任何一个位置的残基处，本发明的蛋白具有保守的天冬酰胺残基。在另一个实施方式中，在对应于RaA (SEQ ID NO:2)的氨基酸位置115、RaB(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置113或Rsl (SEQ ID NO: 6)的氨基酸位置116的残基处，本发明的蛋白具有保守的天冬酰胺残基。在另一个实施方式中，在对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的氨基酸位置115的氨基酸位置，本发明的蛋白具有保守的天冬酰胺残基。在一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列N-Z-(S/T)-(X)3_5-C，其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列⑴12-16-n-z- (S/T)-⑴3_5-c，其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在另一个实施 方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列W-(X)12_16-N-Z-(S/T)-(X)3_5-C，其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列C-(X)2-W- 12_16-n-z-(s/t)-⑴3_5-c，其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任
意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列C-(X)2-ff-(X) 12_16-n-z-(s/t)-(F/Y)-(X)2_4-c，其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列C-⑴2-w-⑴7_n-(I/L)-P-⑴3-n-z-(S/T)-⑴3_5-C，其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列 C- (X) 2-ff- (X) 7_n- (I/L) -P- (X) 3-N-Z- (S/T) - (F/Y) - (X) 2_4_C，其中，X 为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白或者其同源物或片段包含具有糖基化位点的序列c-⑴2-w-⑴13_15-n-z- (s/t) - (X) 4-c，其中，X为任意氨基酸，z为除脯氨酸以外的任意
氨基酸。本发明的蛋白可以是天然糖基化的。这在下述情况下尤其如此该蛋白是天然产生的且是分离的，或者该蛋白是在宿主细胞中重组产生的且所述宿主细胞真实反映了天然产生所述蛋白的生物体的糖基化模式。作为另一选择，可以有必要对本发明的蛋白进行人工糖基化。这在下述情况下尤其如此该蛋白是化学合成的，或者该蛋白是在未真实反映所述蛋白天然糖基化模式的生物体中重组产生的。此外，为了变更或改进该蛋白的性质，可以进行额外的糖基化。发明人在不愿受理论束缚的情况下假设参与DC调节蛋白与其受体的结合的是本发明的蛋白中的糖部分。这将在标题为“受体结合”的部分做更详细的讨论。如上所述，本发明包括SEQ ID NO: 2、4 和 6 或者 SEQ ID NO: 24、25、26、27、28 或 29的氨基酸序列的同源物和片段。本发明的同源物或片段可以保留SEQ ID N0:2、4、6、24、25、26、27、28或29的全长序列中的含有糖基化位点的序列。在某些实施方式中，本发明的同源物或片段可以保留SEQ ID N0:2、4和6的全长序列中的含有糖基化位点的序列。在其他一些实施方式中，所述同源物和片段可以保留一个或多个上述含有糖基化位点的序列。半胱氨酸分布模式本发明的蛋白和之前鉴定的DC调节蛋白Japanin之间的序列同源性表明同Japanin—样，本发明的蛋白是脂质运载蛋白(Iipocalin)或脂质运载蛋白样分子。脂质运载蛋白是共同拥有类似的结构折叠的蛋白家族。特征性脂质运载蛋白折叠是分八股的反平行β桶，其形成在多数情 况下充当配体结合部位的内部空腔。脂质运载蛋白通常在间隔分布的位置上含有半胱氨酸残基。通常，这些半胱氨酸残基中的至少一些会形成可以使脂质运载蛋白折置稳定的内部~■硫键。
发明人已发现，本发明的DC调节蛋白具有保守的半胱氨酸分布模式。认为该半胱氨酸分布模式是形成本发明的DC调节蛋白的特定的脂质运载蛋白折叠所必需的，而且如下文所更详细描述的，该半胱氨酸分布模式的构造使得脂质分子(例如胆固醇)可以与蛋白结合。该半胱氨酸分布模式还可能是使所述特定的脂质运载蛋白折叠稳定所必需的。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C- 82_92-C- 22_26_C-⑴KH12-C,其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)81_91-C-(X)22_26_C-⑴1(1-12-C，其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)81_92-C-(X)22_26_C-⑴1(1-12-C，其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C- 82_92-C- 23_26_C-⑴1(1-12-C，其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式(HX)81_91-C-(X)22_27-C-⑴KH12-C,其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式c-(x)81_92-c-(x)23_27-c-⑴KH12-C,其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)82_92-C-(X)22_26-C-⑴n-12-C，其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)81_91-C-(X)22_26_C-⑴KH13-C,其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)81_92-C-(X)22_26_C-⑴KH13-C,其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)82_92-C-(X)23_26_C-⑴n-12-C，其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式(HX)81_91-C-(X)22_27-C-⑴KH13-C,其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)81_92-C-(X)23_27-C-⑴n-13-C，其中X为任意氨基酸。在一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C- 82_9「C- 22_26-C-⑴KH12-C,其中X为任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)82_91-C-(X)2-W-(X) 19_23-c-⑴1Q_12-C，其中X为任意氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的蛋白包含半胱氨酸分布模式和具有糖基化位点的序列 C- (X) 82-9i_C- (X) 2-ff- (X) i2-16_N-Z- (S/T) - (X) 4_C_ (X) 1(I_12_C,其中,X 为任意氨基酸，Z 为除脯氨酸以外的任意氨基酸。在RaA(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置101、RaB(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置100和RsKSEQ ID NO:6)的氨基酸位置102，鉴定出的蛋白的半胱氨酸分布模式中具有色氨酸氨基酸残基。这些位置对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的残基141。因此，在一个实施方式中，在对应于SEQ ID N0:2、4和6中任何一个的序列中的氨基酸位置100 105中任何一个位置的残基处，本发明的蛋白具有保守的色氨酸残基。在另一个实施方式中，在对应于RaA(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置101、RaB(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置100或Rsl(SEQ ID NO: 6)的氨基酸位置102的残基处，本发明的蛋白具有保守的色氨酸残基。此外，在全长RaA蛋白(SEQ ID NO: 25)的氨基酸位置140、全长RaB蛋白(SEQ IDNO: 26)的氨基酸位置139和全长Rsl蛋白(SEQ ID NO: 24)的氨基酸位置141，鉴定出的蛋白的半胱氨酸分布模式中具有色氨酸氨基酸残基。这些位置对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的残基141。因此，在一个实施方式中，在对应于SEQ ID N0:24、25和26中任何一个的序列中的氨基酸位置137 143中任何一个位置的残基处，本发明的蛋白具有保守的色氨酸残基。在另一个实施方式中，在对应于全长RaA蛋白(SEQ ID NO:25)的氨基酸位置140、全长RaB蛋白(SEQ ID NO:26)的氨基酸位置139和全长Rsl蛋白(SEQ IDNO:24)的氨基酸位置141的残基处，本发明的蛋白具有保守的色氨酸残基。在另一个实施方式中，在对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的氨基酸位置141的氨基酸位置，本发明的蛋白具有保守的色氨酸残基。如上所述，本发明包括SEQ ID NO: 2、4 和 6 或者 SEQ ID NO: 24、25、26、27、28 或 29的氨基酸序列的同源物和片段。在某些实施方式中，这些同源物或片段可以保留本发明的蛋白的半胱氨酸分布模式，且可以保留上述共有序列 。脂质结合性质
鉴于其推定脂质运载蛋白结构，认为本发明的蛋白与脂质或脂样分子联结。术语 “脂质”旨在涵盖任何可溶于有机溶剂但不溶于水的疏水性分子或两性分子。其包括脂肪、 油、三酰甘油、糖脂、磷脂及类固醇、脂酰、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、醣脂质、聚酮化合物、固醇脂和异戊烯醇脂。术语“脂样分子”涵盖与脂质性质相似或相同的任何分子。术语“脂样分子”还包括任何与非脂质分子复合的脂质。其包括糖脂、磷脂、磷酸糖脂、带标记脂质和乙酰化脂质。
在体内，在本发明的蛋白在内质网中折叠的过程中或紧随该折叠后，或者在从此位置输出所述蛋白后的后续阶段，所述蛋白可以与脂质分子结合。
在本发明的范围内，本发明的蛋白或者其同源物或片段可以在其产生过程中与脂质联结。举例而言，如果从其天然来源分离出或通过重组产生本发明的蛋白，该蛋白可以无需任何干预而自动与脂质联结。作为另一选择，可以将脂质添加到包含本发明蛋白的组合物中，从而使得可以在所述脂质和所述蛋白之间形成复合体。特别的是，如果蛋白是化学合成的，可以将脂质外源性地添加到包含所述蛋白的组合物中来形成复合体。
如上所述，本发明的蛋白可以与脂质“联结”或“复合”。在本文中这些术语可以互换使用，用来描述脂质和本发明的蛋白之间的任何类型的接触。特别的是，在本发明的蛋白和脂质之间可以存在相互作用。在一个实施方式中，该相互作用可以完全是结构性的，即脂质可以通过镶嵌关系契合至蛋白的结合口袋中。在另一实施方式中，脂质可以通过任何引力来与蛋白进行物理相互作用。此类引力可以包括静电相互作用、疏水相互作用、亲水相互作用、范德华力、氢键和共价相互作用。脂质和蛋白间的相互作用可以由结构性相互作用和引力的组合形成。
在一个实施方式中，本发明的蛋白可以与脂质联结。在另一实施方式中，脂质可以是类固醇或固醇，例如胆固醇。在另一实施方式中，脂质可以是胆固醇的代谢产物，例如维生素D3或地塞米松。本发明由此提供包含本发明的蛋白和脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)的复合体，或由本发明的蛋白和所述脂质构成的复合体。
如上所述，本发明包括SEQ ID NO: 2、4 和 6 或者 SEQ ID NO: 24、25、26、27、28 或 29 的氨基酸序列的同源物和片段。在某些实施方式中，同源物或片段可以保留SEQ ID N0:2、 4和6的全长蛋白的脂质结合性质。在另外一些实施方式中，同源物和片段可以保留结合胆固醇或胆固醇的代谢产物(例如维生素D3或地塞米松)的能力。因此，本发明还包括包含本发明的蛋 白的同源物或片段以及脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)的复合体， 或由本发明的蛋白的同源物或片段和所述脂质构成的复合体。
由于本发明的DC调节蛋白涉及胆固醇结合，所以发明人设想经改造用来运载脂质但未保留本发明的DC调节蛋白的生物活性的蛋白可能具有有用的性质。因此本发明包括运载蛋白，其结合脂质并靶向DC表面上的受体。这种运载蛋白本身并不具有调节并优选抑制DC的成熟和分化的生物活性。在一个实施方式中，可以通过改造本发明的调节蛋白来产生运载蛋白，以阻止其生物活性。在另一实施方式中，运载蛋白所运载的脂质可以通过与细胞受体结合来发挥生物功能。因此上文所用的术语“功能等价物”包括运载蛋白。
CXXW 基序
令人惊奇的是，发明人已发现所有鉴定出的DC调节蛋白都具有CXXW基序，其中X 为任意氨基酸。发明人推定，该基序可能参与这些DC调节蛋白的特定脂质运载蛋白结构的形成。CXXW基序可能在脂质运载蛋白的桶状结构中参与与脂质(例如胆固醇)的结合。脂质可能与该基序的一个残基结合，或者该基序可能导致形成适合尺寸的结合口袋，以促进脂质在桶结构中的结合。
鉴定出的蛋白的CXXW基序存在于RaA(SEQ ID NO: 2)的氨基酸位置98 101、 RaB (SEQ ID NO:4)的氨基酸位置97 100和Rsl (SEQ ID NO:6)的氨基酸位置99 102。 这些位置对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的残基138 141。因此，在一个实施方式中，在对应于SEQ ID N0:2、4和6中任何一个的序列中的氨基酸位置95 105中任何一个位置的残基处，本发明的蛋白具有保守的CXXW基序。在另一个实施方式中，在对应于RaA(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置98 101、RaB(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置97 100 或Rsl (SEQ ID NO:6)的氨基酸位置99 102的残基处，本发明的蛋白具有保守的CXXW基序。此外，鉴定出的蛋白的CXXW基序存在于全长RaA蛋白(SEQ ID NO: 25)的氨基酸位置 137 140、全长RaB蛋白(SEQ ID NO: 26)的氨基酸位置136 139和全长Rsl蛋白(SEQ ID NO:24)的氨基酸位置138 141。这些位置对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8) 的残基138 141。因此，在一个实施方式中，在对应于SEQ ID NO:24、25和26中任何一个的序列中的氨基酸位置133 144中任何一个位置的残基处，本发明的蛋白具有保守的 CXXW基序。在另一个实施方式中，在对应于全长RaA蛋白(SEQ ID NO: 25)的氨基酸位置 137 140、全长RaB蛋白(SEQ ID NO:26)的氨基酸位置136 139和全长Rsl蛋白(SEQ ID NO: 24)的氨基酸位置138 141的残基处，本发明的蛋白具有保守的CXXW基序。在另一个实施方式中，在对应于Japanin的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的氨基酸138 141的氨基酸位置，本发明的蛋白具有保守的CXXW基序。
在一个实施方式中，本发明的DC调节蛋白可以包含基序CXXW，其中X是任意氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明的DC调节蛋白可以包含基序CXLW，其中X是任意氨基酸。
在又一个实施方式中，本发明的DC调节蛋白可以包含基序CSLW或CELW。
在某些实施方式中，在CXXW之后可以是缬氨酸残基，因此本发明的蛋白可以包含基序CXXWV。在此实施方式中，该基序可以包含残基CXLWV、CSLffV或CELWV。
发明人假设，该基序形成脂质运载蛋白的桶状结构的一部分，CSLW基序中的丝氨酸残基的较小尺寸使得脂质分子(例如胆固醇)可以进入该桶中并结合在该桶结构内。因此，在优选实施方式中，本发明的蛋白包含CSLW基序。
如上所述，本发明包括SEQ ID NO: 2、4 和 6 或者 SEQ ID NO: 24、25、26、27、28 或 29 的氨基酸序列的同源物和片段。在某些实施方 式中，这些同源物或片段可以保留CXXW基序。在其他一些实施方式中，这些同源物和片段可以保留CXLW基序或保留CELW或CSLW基序。
受体结合
本发明的DC调节蛋白据信可结合Ca2+依赖性受体。该受体可以是凝集素受体，具体而言，可以是C型凝集素细胞表面受体。这表明这些蛋白通过结合靶细胞表面受体并触发引起抑制的内部细胞信号传导途径来发挥调节并优选抑制树突状细胞分化和/或成熟的功能。
本发明的蛋白可以直接或间接地调节靶细胞，例如DC。
在一个实施方式中，所述蛋白可以结合靶细胞(例如DC)外表面上的受体。在另一个实施方式中，所述蛋白可以结合二价阳离子依赖性受体。在另一个实施方式中，所述蛋白可以结合Ca2+依赖性受体。在另一个实施方式中，所述蛋白可以结合凝集素受体，特别是可以结合C型凝集素受体。在一个实施方式中，所述蛋白可以结合受体并模仿该受体的天然配体。对本领域技术人员显而易见的是，所述蛋白的任何部分均可以结合该受体。特别地， 如果所述蛋白是糖基化的且/或与脂质分子结合，结合靶细胞上的受体的可以是糖部分或所联结的脂质。
在另一个实施方式中，所述蛋白可以结合靶细胞内部的受体。例如，所述蛋白可以结合溶酶体或其他细胞器的表面上的内部受体。
在一个实施方式中，本发明的蛋白可以通过结合一个或多个中间蛋白(例如血浆蛋白)来间接地调节DC细胞，其中，所述中间蛋白直接或间接地调节DC。例如，中间蛋白可以直接结合DC受体。
在一个实施方式中，本发明包括包含本发明的蛋白和受体的复合体，或由本发明的蛋白和受体组成的复合体。在另一个实施方式中，所述复合体可以包含本发明的蛋白、受体(例如二价阳离子依赖性受体，如C型凝集素受体)和脂质(例如胆固醇或胆固醇的代谢产物)，或者可以由本发明的蛋白、受体和脂质组成。
抗体
本发明还提供抗体，该抗体结合本发明的蛋白及其片段和同源物。可以将所述抗体作为消除本发明的蛋白的试剂来使用。所述抗体还可以是中和本发明的蛋白调节或抑制 DC分化和/或成熟的活性的抗体，因此如下文所述其可用于治疗目的。本发明的此方面中包括与本发明的范围所囊括的任何上述同源物和蛋白片段结合的抗体。
本发明还包括与本发明的蛋白的糖部分结合的抗体。特别的是，本发明包括与天然地连接在本发明的蛋白及其同源物和片段上的一种或多种糖部分结合的抗体。
在一个实施方式中，本发明还包括模仿本发明的蛋白的调节并优选抑制DC的分化和/或成熟的能力的抗体。
本发明的范围内还包括“Anticalin”。其为改造脂质运载蛋白而得到的分子，用来识别并结合特定的蛋白表位。在某些实施方式中，anticalin可以采取肽、糖肽或糖脂的形式。本文中将anticalin包含在术语“抗体”的范围内。Anticalin不是源自免疫球蛋白的分子，但是其以与抗体类似的方式识别蛋白表位。
如果需要多克隆抗体，可以用本发明的蛋白或者其同源物或片段来免疫化选定的哺乳动物(例如小鼠、兔、猪、山羊或马)。如果需要，可以使该蛋白与运载蛋白偶联。 常用的运载蛋白包括牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin)。随后用偶联的蛋白来免疫化动物。收集免疫化的动物的血清，并按照已知程序(例如通过免疫亲和层析)对其进行处理。
本领域的技术人员还能够容易地制造针对本发明的蛋白及其同源物和片段的单克隆抗体。使用杂交瘤技术是公知的制造单克隆抗体的一般方法(参见例如Kohler, G. 和 Milstein, C.，Nature 256:495-497(1975)；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983)； Cole Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第 77-96 页，Alan R. Liss, Inc.(1985))。
本文所用的术语“抗体”包括全长抗体和抗体片段，例如Fab、F(ab’)2和Fv片段，这些片段也特异性地结合本发明的蛋白或者其同源物或片段。术语“抗体”还包括对本发明的蛋白及其同源物和片段有特异性的嵌合抗体分子和人源化抗体分子。嵌合抗体是将非人类可变区连接或融合至人类恒定区而得到的抗体(参见例如Liu等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 84，3439(1987))。本文所用的术语“人源化抗体”指已用非人类供体抗体的重链和/或轻链的可变区中的CDR氨基酸及选定的其他氨基酸替换了人抗体中的对等氨基酸而获得的抗体分子。人源化抗体因此与人抗体非常相似，但具有供体抗体的结合能力 (参见 Jones 等，Nature, 321, 522 (1986) ;Verhoeyen 等,Science, 239, 1534(1988) ；Kabat 等，J.1mmunol.，147，1709 (1991) ；Queen 等，Proc. Natl Acad. Sc1. USA, 86，10029 (1989)； Gorman 等，Proc. Natl Acad. Sc1. USA, 88, 34181 (1991)；以及 Hodgson 等，Bio/Technology, 9，421 (1991))。这些人源化抗体也包含在本发明的范围内。
术语“抗体”还包括“塑性”抗体(分子印迹聚合物(MIP))。
在一些情况下，为了例如便于检测，可能需要将标记基团连接到抗体上。该标记可以是酶、放射性标记、化合物(例如生物素)或荧光染料。这些带标记的抗体也包含在本发明的范围内。
融合蛋白
本发明还包括融合蛋白，所述融合蛋白含有以基因手段融合至或以化学手段连接至一种或多种肽、多肽或其他分子上的本发明的蛋白或者其同源物或片段。额外的肽或多肽或分子的目的可以是为了对蛋白的检测、表达、分离或纯化进行辅助，或者其可以根据需要赋予该蛋白额外性质。潜在的融合伴侣的实例包括β_半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、萤光素酶、多聚组氨酸标签、Τ7聚合酶片段和分泌信号肽。融合伴侣还可以延长所述分子(例如Fe片段)在体内的寿命。
其他的潜在融合伴侣包括潜在的生物药剂，例如为了用作治疗特定疾病的药物而正在开发的蛋白或其他分子。另外的潜在融合伴侣包括会将本发明的蛋白靶向免疫系统中的细胞(如DC)的抗原。举例而言，融合伴侣可以包括可以与所述蛋白融合的自身抗原或外来抗原或者过敏原，从而在体内将所述蛋白递送至DC。另外的融合伴侣可以包括与DC的不同细胞表面组分结合的分子，以便于向DC进行递送。这类抗原的实例将在下文结合治疗方法进行更详细的讨论。在一些情况下，可以包含多种融合伴侣。
核酸
本发明还包括核酸分子，所 述核酸分子包含编码本发明的蛋白的核酸序列。术语 “核酸分子”包括DNA分子、RNA分子和混合的DNA-RNA分子。该定义还包括基因组DNA、cDNA 分子、mRNA分子以及含有经修饰的碱基的DNA和RNA。对本领域的技术人员而言显而易见的是，遗传密码的简并性决定了会存在多种不同的能够编码本发明的蛋白或者其同源物或片段的确定的蛋白序列的核酸序列。本发明还包括编码融合蛋白(例如上述融合蛋白)的核酸分子。
在本发明的一个方面中，包含编码本发明的蛋白的核酸序列的核酸分子可以包含 SEQ ID NO: 1、3、5中任何一个的核苷酸序列或其简并序列，或者可以由所述核苷酸序列或其简并序列构成。在本发明的另一个方面中，包含编码本发明的蛋白的核酸序列的核酸分子可以包含SEQ ID N0:41、42或43中任何一个的核苷酸序列或其简并序列，或者可以由所述核苷酸序列或其简并序列构成。
本发明还提供反义核酸分子，其在高度严格杂交条件下与包含编码本发明的蛋白或者其同源物或片段的核酸序列的上述核酸分子杂交。高度严格杂交条件包括 在含有50%甲酰胺、5XSSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、 5 XDenhardts溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml经剪切的变性鲑精DNA的溶液中于42°C过夜温育，随后在O.1 X SSC中于约65°C清洗滤膜。反义核酸分子包括反义DNA寡聚核苷酸和包括siRNA在内的RNA寡聚核苷酸。
本发明还包括包含核酸分子或反义核酸分子的载体，所述核酸分子包含编码本发明的蛋白或者其同源物或片段的核酸序列，所述反义核酸分子在高度严格杂交条件下与所述核酸分子杂交。所述载体包括克隆载体和表达载体。所述表达载体可以整合有在框内与本发明的核酸分子连接的适合的转录控制序列和翻译控制序列，例如增强子元件、启动子-操纵基因区、终止序列、mRNA稳定性序列、起始密码子及终止密码子或者核糖体结合位点。这些控制序列仅通过实例给出，而并非试图对其进行限制。
此外，方便的是，使重组蛋白从某种宿主分泌出。因此，此类载体的其他成分可以包括编码分泌序列、信号传导序列和加工序列的核酸序列。
本发明的载体可以包括质粒和病毒(包括细菌噬菌体和真核生物病毒)，以及其他线状或环状DNA运载体，例如采用转座元件或同源重组技术的载体。特别适合的病毒载体包括杆状病毒类、慢病毒类、腺病毒类和牛痘病毒类载体。
本发明还包括宿主细胞，该宿主细胞包含编码本发明的蛋白或者其同源物或片段的载体、核酸分子或反义核酸分子。在本发明的范围内，可以使用任何类型的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞可以是原核生物宿主细胞。在该实施方式中,所述原核生物宿主细胞可以是大肠杆菌宿主细胞。在另一个实施方式中，宿主细胞可以是真核生物宿主细胞。 在该实施方式中，所述宿主细胞可以是真核酵母细胞。在又一个实施方式中，宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞。在再一个实施方式中，宿主细胞可以是昆虫细胞，且在该实施方式中表达系统可以是杆状病毒表达系统。
可以使用多种技术来将本发明的载体或核酸导入宿主细胞。在文献中充分描述了适合的转化或转染技术(Sambrook 等，1989 ;Ausubel 等，1991 ;Spector, Goldman 和 Leinwald, 1998)。在真核细胞中，根据对系统的要求，表达系统可以是短暂的(例如附加体)或永久的(染色体整合)。
在本发明另一个实施方式中，提供了制备本发明的蛋白或者其同源物或片段的方法，所述方法包括
i)在使所述蛋白表达的条件下培养包含载体的宿主细胞，所述载体含有编码本发明的蛋白或者其同源物或片段的核酸序列；和
ii)回收由此产生的所述蛋白。
在本发明的此方面中，基于宿主细胞系统、载体和随后的蛋白回收方法，蛋白表达所需的条件会有所不同。用于产生和回收本发明的蛋白的具体方法的一个实例包括 用编码本发明的蛋白的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，并通过添加聚乙二醇(PEG)或硫酸铵而将所得的蛋白从培养上清液中沉淀出。这些条件的变化形式对本领域的技术人员而言是显而易见的。
药物组合物
因鉴定出本发明的蛋白在调节并优选抑制DC分化和/或成熟中具有活性，故计划将本发明的蛋白、核酸、反义核酸、载体、宿主细胞和抗体作为治疗剂来使用。
本发明提供药物组合物，所述组合物包含调节并优选抑制DC的分化和/或成熟的DC调节蛋白或者其功能等价物或片段，编码所述蛋白、同源物或片段的核酸，含有所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，或结合所述蛋白、同源物或片段的抗体；以及药物可接受的载剂。
只要赋形剂本身并不引发毒性效果或导致产生对接受药物组合物的个体有害的抗体，本文所用的术语“药物可接受的载剂”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、 聚乙醇酸和无活性的病毒颗粒或者实际上任何其他试剂。药物可接受的载剂还可以包括 诸如水、生理盐水、甘油、乙醇等液体，或者诸如润湿剂或乳化剂和PH缓冲物质等辅助性物质。赋形剂可以使药物组合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、糊剂、悬浮剂，从而帮助患者进行服用。在Remington’ sPharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中全面讨论了药物可接受的载剂。
在一个实施方式中，药物组合物可以包括一种或多种与蛋白相互作用的脂质分子。在一个具体实施方式
中，所述脂质分子可以是类固醇或固醇，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物(例如维生素D3或地塞米松)。在另一个实施方式中，药物组合物可以包含复合物， 所述复合物包含或仅包含本发明的蛋白；和脂质，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物(如维生素D3或地塞米松)。在又一实施方式中，药物组合物可以包含复合物，所述复合物包含或仅包含本发明的蛋白；脂质，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物(如维生素D3或地塞米松)；和受体，例如二价阳离子依赖性受体(如C型凝集素受体)。
在本发明的一个方面中，药物组合物还可以包含一种或多种额外的治疗剂。本发明此方面包括本领域技术人员会认为有利于与本发明的蛋白共同施用的任何额外治疗剂。 特别而言，所述额外治疗剂可以包括抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子模拟物或细胞因子结合蛋白。在特定的实施方式中，所述一种或多种额外治疗剂可以包括抗炎剂。
治疗方法
技术领域：
本发明提供用于疗法的调节并优选抑制哺乳动物DC的分化和/或成熟的蛋白， 编码所述蛋白的核酸，反义核酸，含有所述核酸或反义核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，与所述蛋白结合的抗体，或者包含所述蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体的药物组合物。
本文所用的术语“疗法”包括为人类或动物患者的利益而使用本文所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。具体而言该术语包括治疗性治疗、预防性治疗、诊断和疫苗接种。此列表仅通过说明性的方式给出，并不试图进行限制。
本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以用来治疗任何动物。 在一些实施方式中，所述动物可以是鱼。在一些实施方式中，所述动物可以是哺乳动物。在另外一些实施方式中，所述哺乳动物动物可以是牛、猪、羊、猫、狗、禽(例如鸡)或兔。在另外一些实施方式中，所述哺乳动物可以是人。在另一个实施方式中，所述动物可以是爬行动物。
在另一个实施方式中，提供了下述物在制造用于治疗DC活性相关疾病的药物中的应用DC调节蛋白，编码所述蛋白的核酸，能与编码所述蛋白的核酸结合的反义核酸，含有所述核酸或反义核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，与所述蛋白或核酸分子结合的抗体，或包含所述蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体的药物组合物。
本发明还提供治疗患有DC活性相关疾病的动物的方法,所述方法包括向所述动物施用治疗有效量的下述物DC调节蛋白，编码所述蛋白的核酸，能够与编码所述蛋白的核酸结合的反义核酸，含有所述核酸或反义核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，与所述蛋白结合的抗体，或包含所述蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体的药物组合物。
在本发明范围内，可以使用多种施用模式中的任何一种或多种来向患者施用本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。此类施用模式为本领域所公知，其可以包括肠胃外注射(例如静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射或注射至组织间隙)，或者通过直肠施用、口服、阴道施用、局部施用、经皮施用、皮内施用、鞘内施用、鼻内施用、眼部施用、耳部施用、肺部施用或其他粘膜施用。可以使用纳米贴片(nanopatch)来经皮施用本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。还可以使用基因枪来施用本发明的核酸、载体或药物组合物。确切的施用模式将取决于待治疗的疾病或病况。
在一个实施方式中，可以在治疗或预防自身免疫性疾病、过敏症或其他超敏性病症、移植反应(包括例如移植排斥和移植物抗宿主疾病等移植反应)和急性及慢性炎症性疾病时使用本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。
自身免疫性疾病包括但不限于胃酸缺乏性自身免疫性慢性活动型肝炎、艾迪生病、斑秃、肌萎缩性侧索硬化(ALS，Lou Gehrig病)、强直性脊柱炎、抗肾小球基底膜肾炎或抗肾小管基底膜肾炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、关节炎、哮喘、遗传性过敏、遗传过敏性皮炎、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、 巴洛病、白塞氏病、Berger氏病(IgA肾病)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻、口炎性腹泻皮炎、慢性疲劳免疫缺陷综合征(CFIDS)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS，或慢性疲劳综合征(CFS))、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施综合征(Churg Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、寇甘综合征、冷凝集素病、大肠炎、颉动脉炎、CREST综合征、 克罗恩氏病、库欣氏综合征、Dego氏病、皮炎、皮肌炎、幼年型皮肌炎、Devic氏病、I型糖尿病、盘状红斑狼疮、Dowling-Dego氏病、德雷斯勒综合征、嗜酸性筋膜炎、获得性大疱性表皮松解症、特发性混合性冷球蛋白血症、埃文斯综合征、纤维肌痛、纤维肌炎、纤维化肺泡炎、 胃炎、巨细胞动脉炎(giant cell artertis)、肾小球性肾炎、古德帕斯彻病、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、乔本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨诺-许兰氏紫癜、肝炎、Hughes综合征、特发性肾上腺萎缩、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、炎性脱髓鞘性多发性神经病、胰岛素依赖性糖尿病(I型)、肠易激综合征、幼年型关节炎、川畸病、扁平苔藓、Lou Gehrig病、狼疮状肝炎、莱姆病、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性骨髓瘤、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、眼瘢痕性类天疱疮、骨质疏松症、扁平部睫状体炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、多腺性自身免疫性综合征、风湿性多肌痛(PMR)、多肌炎、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、银屑病、雷诺氏现象、莱特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、粘血综合征(sticky blood syndrome)(或Hughes综合征)、身肌强直综合征、斯提耳病、西登哈姆舞蹈病、系统性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、血管炎、白癫风、韦格纳肉芽肿病和Wilson综合征。
过敏症或其他免疫相关的敏感性可以是任何已知的超敏反应病症(根据 Gell-Coombs分类，其包括I型、II型、III型或IV型)以及较少定义的V型超敏反应病症。 此类病症包括但不限于遗传性过敏症、哮喘、胎儿成红细胞增多症、古德帕斯彻综合征、自身免疫性溶血性贫血、血清病、阿蒂斯反应、系统性红斑狼疮、接触性皮炎、结核菌素皮肤试验、慢性移植排斥、格雷夫斯病、重症肌无力、全身过敏反应、局部过敏反应、过敏性鼻炎、结膜炎、胃肠炎、湿疹、输血反应、新生儿溶血性疾患、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎、接触性皮炎、遗传过敏性皮炎、结节损伤(tubercular lesion)、药物引发的溶血性贫血、狼疮肾炎、曲霉病、多动脉炎、多肌炎、硬皮病、超敏性肺炎、韦格纳肉芽肿病、I型糖尿病、荨麻疹/ 血管性水肿或甲状腺发炎。过敏或超敏反应病症可能与传染病有关，所述传染病包括但不限于肺结核、麻风、芽生菌病、组织胞浆菌病、弓形体病、利什曼病或其他感染。可以治疗的过敏症包括但不限于对花粉(例如桦树、豚草、油菜籽)、食物(例如坚果、蛋或海味)、药物(例如青霉素或水杨酸盐)、昆虫产物(例如蜜蜂或胡蜂毒液，或者房尘螨)或动物毛发以及诸如胶乳等人造产品的过敏反应。可以治疗的过敏症还可以包括对节肢动物产物的过敏反应。其他可以治疗的炎性疾病包括动脉硬化症或其他心血管疾病、阿尔茨海默病、血管炎、肌炎、脑炎、再灌注损伤、II型糖尿病、脂肪肝和伤口愈合，所述伤口愈合包括炎症期、血管生成过程、纤维组织形成及外皮形成和重塑期。另外的可以治疗的炎性疾病包括囊性纤维化病、支气管扩张病和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以用来治疗或预防鼻息肉病、先兆子痫引发的高血压、伊耳斯氏病或急性胰腺炎。
在一个实施方式中，本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以用来治疗或预防在治疗程序或诊断程序中因体液或组织与人造材料或非哺乳动物材料的接触而引起的有害病况。此类程序可以是临时性或永久性的，包括但不限于对包括肾血液渗析或肝血液渗析、腹膜透析、心肺转流术和血液滤过在内的体外循环回路的使用，对置于血管、膀胱、鞘内空间或任何其他中空内脏的留置导管的使用，对包括人工关节、心脏瓣膜、 血管内支架、脑脊液分流物、人造血管和冠状动脉血管成形术导管在内的植入型假体的使用。
本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可能具有免疫抑制效果， 该效果可用于预防移植反应(例如移植排斥)。移植物可以是同一 个体中的自体移植物、在基因匹配的个体间的同系移植物、在同一物种不同成员之间的同种异体移植物或者在不同物种间的异种移植物。本发明的蛋白可用于预防对多种移植物的排斥，所述移植物包括但不限于心脏、肺、心脏及肺、肾脏、肝脏、胰腺、肠、手、角膜、移植的皮肤(包括脸部再植和脸部移植)、胰岛、骨髓移植物、输入血、血管、心脏瓣膜、骨和皮肤。所述蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以用来预防骨髓移植后的移植物抗宿主疾病。
虽然本发明人不希望受理论束缚，但仍推定本发明的蛋白可以参与抑制癌症所涉及的信号传导途径。在本发明的另一个实施方式中，可以用本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物来治疗癌症。本发明还提供治疗患有癌症的动物的方法，所述方法包括向所述动物施用治疗有效量的上述本发明的蛋白、核酸、载体、抗体或药物组合物。这种治疗可以涉及对癌症中的免疫应答的复极化或调节。
特别地，癌症可以是血液癌症，例如淋巴瘤或白血病或多发性骨髓瘤。可以依照本发明来治疗的白血病包括急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴母细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病。可以依照本发明来治疗的淋巴瘤包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤。还可以治疗的相关病症包括能够最终发展为 ALL的脊髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(包括真性红细胞增多症、特发性血小板增多症或骨髓纤维化症)以及由轻链疾病引发的淀粉样蛋白。
在另外的实施方式中，癌症可以是恶性肿瘤、肉瘤或胚细胞瘤。本发明考虑了对任何器官的癌的治疗，所述癌包括但不限于乳腺、肺、卵巢、胰腺、睾丸、皮肤、结肠、脑、肝或子宫颈的癌以及黑色素瘤。可以治疗或预防的癌是组织细胞瘤且特别是犬皮肤组织细胞瘤。
在本发明的另一个实施方式中，可以用本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物来治疗传染病。特别的是，这种治疗可以涉及对免疫应答的复极化或调节，所述免疫应答针对由诸如病毒、细菌和原生动物(例如HIV、TB和疟疾的致病因素)等病原体以及其他寄生物造成的感染。
吸血节肢动物(例如蜱)是诸如蜱传脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、 Nairobi羊病毒、伯氏疏螺旋体(Lyme病的因素)和小泰勒虫(海岸热的因素)等传染病因素的来源。推测本发明的蛋白可以起到促进蜱传疾病传播的作用。因此本发明的蛋白及其同源物和片段可用于对动物进行接种来引发免疫应答，从而治疗或预防蜱传疾病。因此，在本发明的另一个实施方式中，提供了防止由节`肢动物传播的传染病传播的方法或治疗由节肢动物传播的传染病的方法，所述方法包括向动物施用本发明的蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。本发明还提供本发明的蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物用于预防由节肢动物传播的传染病的传播和治疗由节肢动物传播的传染病。 所述节肢动物可以是吸血节肢动物。由节肢动物传播的疾病可以是莱姆病、蜱传脑炎、克里米亚-刚果出血热、Nairobi羊病毒或海岸热。
因此还可以将本发明的蛋白及其同源物和片段用作疫苗来抵抗吸血节肢动物本身及其携带的疾病。本发明由此提供向动物接种疫苗来抵抗吸血节肢动物(可以是蜱)的方法，所述方法包括向所述动物施用本发明的蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物。本发明还提供本发明的蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物用于向动物接种疫苗来抵抗吸血节肢动物(可以是蜱)。
如上所讨论，可能有益的是，将本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与一种以上的额外治疗剂(例如抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子模拟物或细胞因子结合蛋白，或者为治疗上述任何病症而开发的其他生物药剂)组合施用。
还可能有益的是，将本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体与使其在体内靶向DC的抗原一起施用，从而调节或抑制与不利的免疫应答相关的DC分化和成熟。在此实施方式中，可以将本发明蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与疾病相关要素组合施用给患者，从而帮助本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物靶向适合的DC。在本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或抗体已经凭借与DC特异性地结合而靶向 DC的实施方式中，可以不需要疾病相关要素。
术语“疾病相关要素”旨在涵盖与患者的疾病相关的任何成分。所述疾病可以包括上述的自身免疫性疾病、过敏及其他超敏反应、移植反应(例如移植排斥和移植物抗宿主疾病)、传染病(包括由蜱传播的传染病)、癌症(包括血液系统恶性肿瘤)和急性及慢性炎症性疾病。因此，“疾病相关要素”可以包括i)与诸如病毒、微生物、寄生物和微生物毒素等传染原相关的成分；ii)与过敏相关的非自身分子过敏原；iii)与除过敏外的超敏反应相关的非自身成分；iv)与自身免疫性疾病相关的自身成分；V)来自同一物种具不同基因的成员的移植抗原(异型抗原)或来自不同物种的移植抗原(异种抗原)jPvi)肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。
术语“疾病相关要素”还涵盖上述疾病相关要素的片段及衍生物。此类衍生物可以包括已去毒的试剂、合成的模拟位(mimotope)和抗原，所述抗原在其结构中存在替换、 插入或缺失但仍能够将本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物引导至适合的DC。
向动物提供疾病相关要素将提高与所述疾病相关的调节或抑制DC分化和成熟的特异性。以此方式来靶向特定的DC是有利的，因为其避免了对整体免疫应答进行抑制的需求，而且因此可以使副作用的程度减少。
在本发明的一方面中，可以将本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物与疾病相关要素分开施用。在此方面中，本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以与疾病相关要素依次施用。在另一实施方式中，本发明的蛋白、核酸、载体、 宿主细胞、抗体或药物组合物可以在疾病相关要素之前施用。在另一实施方式中，本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以在疾病相关要素之后施用。
在另一实施方式中，本发明的蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体或药物组合物可以与疾病相关要素同时施用。在本发明的此方面中，本发明的蛋白或抗体可以与疾病相关要素结合，例如以融合蛋白的方式结合。
因此本发明还提供融合蛋白，所述融合蛋白具有疾病相关要素；和本发明的蛋白或者其同源物或片段。还提供了编码此融合蛋白的核酸。
本发明还提供一种 药物组合物，所述药物组合物包含本发明的蛋白、核酸、载体、 宿主细胞、抗体或药物组合物；疾病相关要素；和药物可接受的载剂。
上述方法涉及向动物施用本发明的蛋白，从而在动物体内调节并优选抑制DC的分化和/或成熟。所述蛋白可以单独施用，或与包括疾病相关要素在内的额外试剂组合施用，所述额外试剂会使本发明的蛋白靶向DC。
上述疾病的替代性治疗方法是将本发明的蛋白用于离体靶向疗法。该方法包括将本发明的蛋白体外递送至DC来调节所述DC并将经调节的DC递送至需要治疗的动物。
在另一方面，本发明提供调节DC的方法，所述方法包括使DC接触本发明的蛋白或者其同源物或片段。还提供了使用此方法产生的经调节的DC。
本发明还提供在有需要的动物中治疗或预防的DC相关病症的方法，其中所述方法包括向动物施用用上述方法产生的经调节的DC。
可以直接从需要治疗的动物中分离出DC。作为另一选择，可以从需要治疗的动物中分离出DC前体，例如骨髓祖细胞的单核细胞，并用该DC前体来产生经调节的DC。在本发明的此方面中，对于在用本发明的蛋白对DC进行处理后将要导入经调节的DC的动物，DC 或DC前体可以与该动物是自体同源的或同种异基因的。
DC相关病症可以是上文讨论的任何疾病，包括自身免疫性疾病、过敏及其他超敏反应、移植反应(例如移植排斥及移植物抗宿主疾病)、传染病(包括由蜱传播的传染病)、 癌症(包括血液系统恶性肿瘤)和急性及慢性炎症性疾病。所考虑的是，该方法可以用来在进行移植前从移植供体产生经调节的DC来向计划的移植受体进行施用，其目的在于诱发对移植物的不应性并因此减少给予免疫抑制剂的需要。
在本发明的此方面中，还可以使DC与上述疾病相关要素接触，从而使本发明的蛋白或者其同源物或片段靶向适合的DC。作为另一选择，可以将经调节的DC和诸如上文所述的那些疾病相关要素组合施用至动物。
筛选方法
对本发明的蛋白的同种受体(cognate receptor)的鉴定使得在筛选方法中能够用该受体来鉴定本发明的蛋白的潜在激动剂和拮抗剂，从而鉴定出任何具有潜在治疗用途或其他用途的化合物。
可以从例如细胞、无细胞制剂、化学物质库或天然产物混合物中分离出潜在的激动剂或拮抗剂化合物。对于此类筛选方法的恰当综述，参见Coligan等,Current Protocols in Immunology 1(2):第 5 章(1991)。
最适合作为优秀拮抗剂的化合物是下述分子所述分子与本发明的蛋白的同种受体结合，且并不引发由本发明的蛋白引发的生物效应，并因此竞争性地抑制本发明的蛋白的功能。如上所述，认为本发明的蛋白的同种受体是二价阳离子依赖性受体，所述二价阳离子依赖性受体是C型凝集素受体且在结合本发明的蛋白时引发细胞内信号传导途径从而抑制DC的分化和成熟。潜在的拮抗剂包括与所述受体结合且不激活信号传导途径或激活负信号传导途径的有机小分子、肽、多肽和抗体。特别地，适合的潜在拮抗剂包含糖部分和与本发明的蛋白对应的经改造的分子，所述分子经改造而在保留其对受体的亲和力的同时减弱了其功能。在另一个实施方式中，潜在的拮抗剂包括与所述受体结合且不激活信号传导途径或激活负信号传导途径的合成小分子。其他适合的化合物包括针对本发明的蛋白的抗体，针对与本发明的蛋白联结的糖部分的抗体，以及能够经改造而具有靶标特异性的 anticalin。
最适合充当良好激动剂的化合物是下述化合物所述化合物与本发明的蛋白的同种受体结合并与本发明的蛋白引发相同的细胞内信号传导途径，由此以与本发明的蛋白相似的方式发挥调节并优选抑制DC的分化和成熟的功能。适合的潜在激动剂包括经改造而提高了受体活化能力和/或对受体的结合亲和力的本发明的蛋白。适合的潜在激动剂的其他实例包括有机小分子、合成分子、肽、多肽融合蛋白、抗体或抗体片段 。
用于此筛选技术中的同种受体(二价阳离子依赖性受体，可以是C型凝集素)可以游离于溶液中、附着于固体支持物、携带于细胞表面或位于细胞内。通常，这些筛选程序可以包括使用表达所述受体的适合的细胞或细胞膜，使之与测试化合物接触，从而观察结合或观察对功能性响应的刺激或抑制。随后，将与测试化合物接触的细胞的功能性响应与未接触测试化合物的对照细胞进行比较。这种测定可以使用适当的检测系统来评估测试化合物是否会产生与本发明的蛋白使受体活化而产生的信号相似的信号。由于确信本发明的蛋白通过结合细胞表面二价阳离子依赖性受体(例如C型凝集素受体)并引发细胞内信号传导途径来发挥作用，所以，如果筛选方法涉及使用细胞表面受体且涉及监视化合物与受体的结合是否引发细胞内信号，则该筛选方法可能会最有效地发挥作用。
在一个实施方式中，鉴定本发明的蛋白的激动剂化合物或拮抗剂化合物的方法包括
(a)在允许与受体结合的条件下，使表面上表达有二价阳离子依赖性受体(例如C 型凝集素受体)的细胞与待筛选的化合物接触，其中所述受体能够提供可检测的信号以响应与化合物的结合；和
(b)通过测量由所述化合物与所述受体的相互作用产生的信号的水平，来确定所述化合物是否与所述受体结合并活化或抑制所述受体。
在某些实施方式中，可以在配体存在时使待筛选的化合物与受体接触。此类配体可以是脂质，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物(例如维生素D3或地塞米松)。
在另一实施方式中，鉴定本发明的蛋白的拮抗剂化合物的方法包括
(a)在使本发明的蛋白可以结合其同种受体的条件下，使表面上表达有二价阳离子依赖性受体(例如C型凝集素受体)的细胞与本发明的蛋白接触，其中所述受体能够提供可检测的信号以响应与本发明的蛋白的结合；
(b)测量由本发明的蛋白与所述受体的相互作用产生的信号的水平；
(C)在允许与受体结合的条件下，添加待筛选的化合物；和
(d)通过测量由所述化合物与所述受体的相互作用产生的信号的水平变化，来确定所述化合物对本发明的蛋白的结合的影响。
在某些实施方式中，可以在上述筛选方法中使用上文讨论的本发明的蛋白的任何同源物或片段。
在另外一些实施方式中，可以在配体存在的情况下使待筛选化合物和/或本发明的蛋白与受体接触。此类配体可以是脂质，例如胆固醇或胆固醇的代谢产物。
上文指出的条件 可以包括培养基的存在、含生理浓度Ca2+的溶液的存在和/或pH 值为7 8。
上述可检测的信号可包括细胞内磷酸化、核定位、基因表达和/或细胞因子释放。
在上述方法的某些实施方式中，可以使用简单的结合测定，其中，利用与测试化合物直接或间接联结的标记，或者利用涉及到与带标记的竞争者竞争的测定，来检测测试化合物对携带C型凝集素受体的表面的附着。在另一实施方式中，可以使用竞争性药物筛选测定，其中，能够结合二价阳离子依赖性受体(例如C型凝集素受体)的中和性抗体为结合而与测试化合物特异性地竞争。以此方式，可以使用这些抗体来检测任何具有受体特异性结合亲和力的测试化合物的存在。
对于作用于本发明的蛋白的同种受体的化合物，本领域的技术人员将能够设计测定方法来对其进行鉴定。本领域的技术人员可以容易地确定可以用来进行对具有适合的受体结合亲和力的化合物的高通量筛选的技术(参见国际专利申请W084/03564)。在该方法中，在固体基体上合成了大量不同的小的测试化合物，随后可以使其与受体反应并进行清洗。一种固定多肽的方法是使用非中和性抗体。随后，可以使用本领域公知的方法来检测已结合的受体。还可以将纯化的受体分子直接涂布到平板上，以用于前述的药物筛选技术中。
本发明还包括用上述方法鉴定出的激动剂、拮抗剂和其他化合物。这些激动剂、拮抗剂和其他化合物可以构成上述药物组合物的一部分，而且可以在上述治疗方法中使用。
现将通过实施例来详细描述本发明的各个方面及实施方式。应该理解，可以在不脱离本发明范围的情况下对细节做出修改。
图1 显示了 RaA 的 DNA 和氨基酸序列(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2)
图 2 显示了 RaA(SEQ ID NO:2)与 Japanin(SEQ ID NO:8)的比对。RaA 与 Japanin 的比对使用clustalW并使用以下选项来获得空位延伸罚分=0.1 ;空位罚分=10. O ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。在构成该比对的131个残基中，有61个(46.56%)完全相同[用*标出]，26个(19. 85%)为强相似[:]，22个(16. 79%)为弱相似[·]。
图3 显示了 RaB 的 DNA 和氨基酸序列(SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4)
图 4 显示了 RaB (SEQ ID NO:4)与 Japanin (SEQ ID NO:8)的比对。RaB 与 Japanin 的比对使用clustalW并使用以下选项来获得空位延伸罚分=0.1 ;空位罚分=10. O ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。在构成该比对的138个残基中，有73个(52.9%)完全相同[用*标出]，30个(21. 74%)为强相似[:]，12个(8. 7%)为弱相似[·]。
图5 显示了 Rsl 的 DNA 和氨基酸序列(SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6)
图 6 显示了 Rsl (SEQ ID NO:6)与 Japanin (SEQ ID NO:8)的比对。Rsl 与 Japanin 的比对使用clustalW并使用以下选项来获得空位延伸罚分=0.1 ;空位罚分=10. O ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。在构成该比对的131个残基中，有ios个(80.15%)完全相同[用*标出]，12个(9. 16%)为强相似[:]，7个(5. 34%)为弱相似[·]。
图 7 显示了 RaA(SEQ ID NO: 2)、RaB (SEQ ID NO:4)、Rsl (SEQ ID NO:6)和 Japanin (SEQ ID NO:8)的比对，并标出了保守性基序和特征的位置。CXXW基序以斜体示出，保守性半胱氨酸残基以粗体示出，含糖基化位点的序列中的天冬酰胺残基以下划线标出。使用了以下选项空位延伸罚分=0.2 ;空位罚分=10. ο ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵 =gonnetο
图 8 显示了 RaA(SEQ ID NO: 2)、RaB (SEQ ID NO:4)、Rsl (SEQ ID NO:6)、 Japanin(SEQ ID NO:8) DA(SEQ ID NO: 10)的比对，并标出了保守性基序和特征的位置。 CXXff基序以斜体示出，保守性半胱氨酸残基以粗体示出，含糖基化位点的序列中的天冬酰胺残基以下划线标出。使用了以下选项空位延伸罚分=0.2 ;空位罚分=10.0 ;亲水性残基 =Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。
图9显示出，Rs、RaA和RaB存在于CHO的转染物上清液中。
图1OA显示了 RsURaA和RaB转染物上清液对未经LPS处理的树突状细胞中⑶86 的表达的影响。
图1OB显示出，RsURaA和RaB转染物上清液抑制经LPS处理的树突状细胞中⑶86的表达。
图11显示出，在响应Rsl、RaA和RaB转染物上清液时，经LPS处理的树突状细胞中 B7-H1的上调得到了增强。
序列说明
SEQIDNO:1是RaA的核苷酸序列
SEQIDNO:2是RaA的氨基酸序列
SEQIDNO:3是RaB的核苷酸序列
SEQIDNO:4是RaB的氨基酸序列
SEQIDNO:5是Rsl的核苷酸序列
SEQIDNO:6是Rsl的氨基酸序列
SEQIDNO:7是Japanin的核苷酸序列
SEQIDNO:8是Japanin的氨基酸序列
SEQIDNO:9是DA的核苷酸序列
SEQIDNO: 10是DA的氨基酸序列
SEQIDNO: 11是RM的核苷酸序列
SEQIDNO: 12是RM的氨基酸序列
SEQIDNO: 13是AM的核苷酸序列
SEQIDNO: 14是AM的氨基酸序列
SEQIDNO: 15是RaC的核苷酸序列
SEQIDNO: 16是RaC的氨基酸序列
SEQIDNO: 17是简并的源自Japanin的正向引物
SEQIDNO: 18是载体特异性反向引物
SEQIDNO: 19是Japan in特异性反向引物
SEQID NO:20是Rsl特异性反向引物
SEQIDNO: 21是RaA特异性反向引物
SEQIDNO: 22是RaB特异性反向引物
SEQIDNO: 23是载体特异性正向引物
SEQIDNO:24是Rsl的全长氨基酸序列
SEQIDNO:25是RaA的全长氨基酸序列
SEQIDNO:26是RaB的全长氨基酸序列
SEQIDNO:27是预测的Rsl成熟肽序列
SEQIDNO: 28是预测的RaA成熟肽序列
SEQIDNO: 29是预测的RaB成熟肽序列
SEQIDNO:30是Rsl合成基因的核苷酸序列
SEQIDNO: 31是RaA合成基因的核苷酸序列
SEQIDNO: 32是RaB合成基因的核苷酸序列
SEQIDNO: 33 40表示CXXW基序
SEQIDNO:41是Rsl的全长DNA/编码序列(包括终止密码子)
SEQIDNO:42是RaA的全长DNA/编码序列(包括终止密码子)
SEQIDNO:43是RaB的全长DNA/编码序列(包括终止密码子)
SEQIDNO:44 是 Rsl 的 5’DNA 序列
SEQIDNO:45 是 RaA 的 5’ DNA 序列
SEQIDNO:46 是 RaB 的 5’ DNA 序列
SEQIDNO:47是Rsl特异性正向引物
SEQIDNO: 48是RaA特异性正向引物
SEQIDNO: 49是RaB特异性正向引物实施例
实施例Ι-RaA, RaB和Rsl的鉴定
蛋白RaA、RaB和Rsl的与Japanin相关的不完整氨基酸序列通过扩增表达文库中的扇头蝶cDNA来获得,在Lambda Zap II (Stratagene)中制备所述cDNA。使用简并的、源自Japanin的正向引物(SEQ ID NO: 17)并组合对应于RaB的载体特异性反向引物(SEQ ID NO: 18)或对应于RaA和Rsl的Japanin特异性反向引物(SEQ ID NO: 19)，利用聚合酶链式反应(PCR)来进行扩增。
实施例2—Japanin分别与RaA、RaB和Rsl的比对
将RaA(SEQ ID NO: 2)、RaB (SEQ ID NO:4)和 Rsl (SEQ ID NO:6)的氨基酸序列分别与Japanin (SEQ ID NO: 8)进行比对，所述比对使用clustalW并使用以下选项来进行空位延伸罚分=0.1 ;空位罚分=10. ο ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。这些比对的结果分别示于图2、图4和图6中。
对于RaA，在构成比对的131个残基中，有61个(46. 56%)完全相同，26个(19. 85%) 为强相似，22个(16. 79%)为弱相似。
对于RaB，在构成比对的138个残基中，有73个(52.9%)完全相同，30个(21.74%) 为强相似，12个(8. 7%)为弱相似。
对于Rsl，在构成比对的131个残基中，有105个(80. 15%)完全相同，12个(9. 16%) 为强相似，7个(5. 34%)为弱相似。
实施例3—Japani n、RaA、RaB 和 Rsl 的比对
对RaA(SEQ ID NO:2)、RaB(SEQ ID NO:4)、RsI(SEQ ID NO:6)和 Japanin (SEQ ID NO:8)的氨基酸序列进行比对，所述比对使用clustalW并使用以下选项来进行空位延伸罚分=0.2 ;空位罚分=10. ο ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。该比对的结果示于图 7中。
实施例4—Japanin、RaA、RaB、Rsl 和 DA 的比对
对RaA (SEQ ID NO: 2)、RaB (SEQ ID NO: 4)、Rsl (SEQ ID NO: 6)、Japanin (SEQ ID N0:8)和DA(SEQ ID NO: 10)的氨基酸序列进行比对，所述比对使用clustalW并使用以下选项来进行空位延伸罚分=0.2 ;空位罚分=10. ο ;亲水性残基=Gpsndqerk ;矩阵=gonnet。 该比对的结果示于图8中。
图8表明这5种蛋白在蝶脂质运载蛋白家族中形成明显的聚类(cluster)。它们的进化未缘关系和结构相似性意味着保守的功能。
发明人已提供了之前未鉴定出的三种DC调节蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列。基于序列同源性和比对研究，发明人已能够确定可能对此类蛋白的结构和功能重要的多个基序和特征。这些结果提供了对这些分子的作用方式的深入观察，这种深入观察可能对设计用于疗法的其他DC调节分子有用。
将以下通用实验技术用于实施例5 8所描述的实验。
除非另有说明，细胞培养基和补充剂来自PAA。
LPS是来自大肠杆菌055 :B5的三氯乙酸提取制备物(Simga，产品码L4005)。从分离自健康成年供体的外周血液单核细胞中产生人树突状细胞(DC)。简言之，将白细胞层 (英国国家血液服务中心(National Blood Service),牛津)与不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)以约1:3(体积/体积)混合,小心铺设至Lymphoprep (Axis Shield)上并在800g于22°C离心30分钟。在PBS/血沉棕黄层混合物的分界面形成外周血单个核细胞 (PBMC)层，小心收集Lymphoprep并用PBS清洗三次以除去血小板(每次于4°C离心10分钟，最初在400g、然后在300g、最后在200g进行离心)。
使用Easysep人单核细胞富集试剂盒(Stemcell technologies)进行负选择,从而从PBMC中分离出单核细胞。将PBMC重悬于不含Ca2+/Mg2+的PBS中，随后按照制造商的操作说明来使用试剂盒。将纯化的单核细胞以5X IO5个/ml的密度重悬于DC-RPMI (即补充有10%胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、1000U/ml 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (Gentaur)和250ng/ml人白细胞介素4(IL_4) (Peprotech EC)的RPMI 1640)中。3天后，取出1/3的培养基进行离心，将沉淀物重悬于相同体积的含1000U/ml GM-CSF和750ng/mlIL_4的新鲜培养基中，随后将其加回培养物中。5天后，或者立即使用细胞，或者将细胞冷冻。为了冷冻细胞，用HBSS/2%FCS清洗细胞，并将细胞重悬于含5. 5%羟乙基淀粉(“Voluven”，来自John Radcliffe Hospital pharmacy)/4. 8% 二甲亚砜(DMSO) (Hybrimax 级,来自 Sigma)/3. 8%FCS 的等渗盐水中，随后置于控制型冷冻设备(I度/分钟)中的_80°C冰柜中。
实施例5-对同源物的5’序列的PCR克隆
通过扩增cDNA来获得Rsl、RaA和RaB的丢失的N端氨基酸序列，其中所述cDNA 来自用来获得SEQ ID N0:2、4和6所表示的部分序列的扇头蜱表达文库。
使用基因特异性反向引物(SEQ ID NO:20、21或22)并组合载体特异性正向引物 (SEQ ID NO: 23)并且按照制造商的操作说明使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes),利用聚合酶链式反应(PCR)来进行扩增。按照制造商的操作说明将PCR产物克隆至pCRBlunt II Τ0Ρ0克隆载体(Invitrogen)中，并使用连接好的质粒来转染T0P10大肠杆菌细胞 (Invitrogen)，随后将细胞平板接种到LB琼脂上。随后挑出单个的菌落使之在液体LB培养基中生长，并使用QIAprep系统(Qiagen)从其中制备质粒DNA。对这些质粒进行测序,从而得至Ij RsURaA和RaB的5’ cDNA序列(分别以SEQ ID N0:44、45和46给出)。
实施例6—对同源物的3’序列的PCR克隆
通过扩增cDNA来获得Rsl和RaA的丢失的C端氨基酸序列，其中所述cDNA来自用来获得SEQ ID N0:2、4和6所表示的部分序列的扇头蜱表达 文库。使用相同的方法来确认RaB的C端序列(之前已确定；见实施例1, SEQ ID NO:4)。
使用基因特异性正向引物(SEQ ID N0:47、48或49)并组合载体特异性反向引物 (SEQ ID NO: 23)并且按照制造商的操作说明使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes),利用聚合酶链式反应(PCR)来进行扩增。按照制造商的操作说明使用Perfectly Blunt克隆试剂盒(Novagen)将PCR产物克隆至pT7Blue克隆载体中，并使用连接好的质粒来转染TOPlO大肠杆菌细胞(InvitiOgen)，随后将细胞平板接种到LB琼脂上。挑出单个的菌落使之在液体 LB培养基中生长，并使用QIApr印系统(Qiagen)从其中制备质粒DNA。对这些质粒进行测序，从而得到Rsl、RaA和RaB的3’ cDNA序列，并将其与之前产生的序列合并以给出全长核苷酸cDNA序列(分别由SEQ ID N0:41、42和43表示)，并由此得到所编码的肽序列(分别为 SEQ ID NO: 24、25 和 26)。SignalP (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/) 来鉴定这些蛋白的可能的信号肽部分，其表示成熟的分泌蛋白将具有SEQ ID N0:27、28和 29所示的氨基酸序列。
实施例7—同源物在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达
为了测试同源物的活性，在CHO细胞中表达了这些同源物。将编码每种同源物的合成基因亚克隆至哺乳动物表达载体(P⑶NA3.1)中，使用这些表达构建体来转染CHO细胞，并通过蛋白质印迹来确认在转染物上清液中存在重组蛋白。
a.合成基因
为CHO细胞表达而优化了的合成基因由DNA2. O生成(SEQ ID NO:30、31和32)。 这些基因编码上述同源物的全长肽序列以及编码连接部分(GG)和多组氨酸标签(HHHHHH) 的C端延伸段，以便于检测和纯化。这些基因还包含非编码性DNA (包含5’ -Kozak序列，以允许真核表达)和便于进行亚克隆的限制性内切酶位点(5’ BamHI位点和3’ NotI位点)。
b.亚克隆至 pCDNA3.1 中
由于将合成基因提供在克隆载体中，所以有必要将其转移到表达载体中来产生重组蛋白。为了在CHO细胞中进行表达，发明人选择了 pCDNA3.1哺乳动物表达载体，其中，表达由CMV启动子驱动。
通过下述方法从母体pCDNA3.1_v5_his C (Invitrogen)制备 pCDNA3.1 :用 BamHI 和NotI限制性内切酶(New England Biolabs)将多克隆位点区切除，用FastAP碱式磷酸酶(Fermenatas)进行处理来消除载体的细胞连接,并使用QIEx II系统(Qiagen)凝胶纯化载体主链。
通过下述方法从其运载质粒制备所述合成基因用BamHI和NotI限制性内切酶将编码同源物的区域(包括Kozak序列和多组氨酸标签)切出，并使用QIEx II系统将其凝胶纯化。
使用T4 DNA连接酶(Fermentas)将切出的合成基因与制得的pDNA3.1连接，从而产生pDNA3.1-同源物构建体。使用连接好的DNA来转染感受态大肠杆菌，随后将大肠杆菌平板接种到LB琼脂上，从而允许选择用于液体培养的单个菌落。使用QIAprep系统 (Qiagen)从这些培养物中抽提出质粒DNA，并测序验证其身份。随后将整合有上述合成基因序列的DNA用于转染。
c.转染CHO细胞
在标准细胞培养条件下，使CHO细胞在补充有10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素和100 μ g/ml链霉素的RPMI中生长。为了进行转染，将细胞以约30% 40%接种在 24孔板中，过夜培养。随后选择汇合度(confIuency)为80% 95%的孔进行转染。
用ρΟ)ΝΑ3·1-同源物构建体、pO)NA3· l-japanin-his (阳性对照)、PCNDA3. Ι-lacZ-his (作为转染的阳性对照和DC调节活性的阴性对照)转染细胞，或者仅用转染试剂(模拟转染对照)转染细胞。按制造商的操作说明用TransIT2020试剂(Mirus) 进行转染，每孔使用1. 5 μ I试剂和500ng质粒DNA。72小时后收集上清液，进行分析或立即冷冻。
d.进行蛋白质印迹来确认表达
通过蛋白质印迹来确认带多组氨酸标签的蛋白的表达。
向6. 5 μ I转染物上清液中添加十二烧基硫酸锂(LDS)加样缓冲液(Invitrogen), 并添加二硫苏糖醇(DTT)(终浓度为50mM)，并于70°C加热10分钟使蛋白变性。在4% 20%的丙烯酰胺Pierce Protein预制凝胶(Thermofisher)上使准备好的样品电泳,随后在 Towbin缓冲液中进行湿转移(施加I小时的400mA恒定电流),从而将样品转移到硝化纤维膜上。
于室温用StartingBlock T20 (PBS)封闭缓冲液(Thermofisher)对膜进行 30 分钟的封闭，用PBS/0. l%Tween 20进行冲洗，随后在以1/1000稀释于PBS/3%BSA/0. l%Tween 20中的抗五组氨酸生物素(Qiagen)中，于6°C温育过夜。随后在PBS/0. l%Tween20中进行充分清洗，并在以1/20000稀释于PBS/0. l%Tween 20中的抗生蛋白链菌素-HRP (Jackson Immunoresearch)中，于室温温育30分钟。随后再进行数次PBS/0. l%Tween 20清洗,添加 ECL底物(GE Lifesciences)，而后使膜暴露于X光胶片。
显影的胶片清楚地显示出，每种带多组氨酸标签的Japanin同源物存在于转染物上清液中(见图9)。
实施例8—同源物转染物上清液的树突状细胞调节活性
a.在响应刺激物时对⑶86上调的抑制
使用按上文所述产生的源自人单核细胞的DC来针对DC调节活性进行筛选。在 96孔平底组织培养板(Corning)中、在补充有待筛选样品的DC-RPMI中培养DC。添加转染物上清液至总体积的10%，同时使用500ng/ml的纯化japanin。培养24小时后，添加LPS(100ng/ml)来刺激DC。再培养18 24小时后，用以1/50稀释的抗人CD86-PE 克隆IT2. 2(eBi0SCienCe)进行染色，随后用流式细胞术来评估⑶86的表达水平。使用 FACSCanto流式细胞仪(Becton Dickinson)来执行流式细胞术。发现在经LPS处理的DC 和未经处理的DC中，来自用三种同源物中的每一种转染了的细胞的上清液都减少了 CD86 的表达，其减少程度与来自japanin转染物的上清液相仿(见图10)。
b.在响应刺激物时对B7-H1上调的增强
用在上文4.1中描述的转染物上清液和LPS处理DC。随后，用以1/100稀释的抗人B7Hl-PECy7克隆MIHl(eBioscience)进行染色，而后用流式细胞术来评估B7-H1 (CD274) 的水平。使用FACSCanto流式细胞仪(Becton Dickinson)来执行流式细胞术。
发现与仅用LPS诱导的细胞相比，来自用三种同源物中的每一种转染了的细胞或用Japanin转染了的细胞的上清液提高了 B7-H1的表达水平(见图11)。
这意味着这些同源物(以及japanin)促使DC变为调节型表型、降低(T细胞协同刺激性的)CD86的水平并提高(T细胞“协同抑制性的”)B7-H1的水平。
参考文献
Anguita, J. , Ramamoorthi, N. , Hovius, J. , Das, S. , Thomas, V. , Persinski, R.，Conzej D.，Askenasej P.，Rincon，Μ.，Kantorj F.，Fikrigj E. (2002) Salpl5，an Ixodes scapularis salivary protein inhibits CD4+T cell activation Immunity 16, 849-859.
Banchereauj J.等，Ann N YAcad Sci，2003，987，180-187.
Bergman, D.，Palmer, M.，Caimanoj M.，Radolf，J.，Wikelj S. (2000) Isolation and molecular cloning of a secreted immunosuppressant protein from Dermacentor andersoni salivary Gland The Journal of Parasitology 86 (3)，516-525.
Cavassani，K.，Aliberti，J.，Dias, A.，Si Ivaj J.，Ferreira, B. (2005) Tick saliva inhibits differentiation, maturation and function of murine bone-marrow-derived dendritic cells Immunology 114，235—245.
Coligan 等，Current Protocols in Immunology 1(2):第 5 章(1991).
Figdorj C. G.等，Nature medicine, 2004，10 (5)，475-480.
Hannierj S.，Liversidgej J.，Sternberg, J.，Bowman, A. (2004) Characterisation of the B-cell inhibitory protein factor in Ixodes ricinus tick saliva:a potential role in enhanced Borrelia burgdoferi transmission Immunology 113,401-408.
Hovius, J .，Ramamoorthi，N .，Veer, C .，Groot，K .，Nijhof， A. , Jongejanj F. , Dam, A. , Fikrigj E. (2007) Identification of Salp 15 homologues in Ixodes ricinus ticks Vector-bourne and Zoonotic Diseases 7 (3)，296-302.
Jaworski, D.，Jasinskasj A.，Metz, C.，Bucalaj R.，Barbour, A. (200 I) Identification and characterisation of a homologue of the pro-1nflammatory cytokine Macrophage Migration Inhibitory Factor in the tick, Amblyomma americanum Insect Molecular Biology 10 (4)，323-331.
Leboullej G.，Crippaj M.，Decremj Y.，Mejrij N.，Brossardj M.，Bollenj A.，Godfro id, E. (2002)Characterization of novel salivary immunosuppressive protein from Ixodes ricinusticks The Journal of Biological Chemistry 88 (12)，10083-10089.
Ribeiro J. M. C. (1995) Blood-feeding arthropods :1 ive syringes or invertebrate pharmacologists Infectious Agents & Disease 4， 143-152.
Sambrookj J.等，(2000)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y.
Sa-Nunesj A.，Baficaj A.，Lucas, D.，Conrads, T.，Veenstraj T.，Andersen, J.，Mat her, T. , Ribeiroj J. , Francischettij1. (2007)Prostaglandin E2 is a major inhibitor of dendritic cell maturation and function in Ixodes scapularis saliva The journal of Immunology 179， 1497-1505.
Skallova，A.，Iezzi，G.，Ampenberger，F.，Kopf，M.，Kopecky，J. (2008) Tick saliva inhibits dendritic cell migration, maturation,and function while promoting development of Th2responses Journal of Immunology 180，6186—6192.
Subklewej N.，Sebelin-Wulf, K.，Beierj C.，Lietzj A.，Mathasj S.，Dorkenj B.，Pez zutto,A. (2007)Dendritic cell maturation stage determines susceptibility to the proteasome inhibitor bortezomib. Human Immunology 68 (3)，147—155.
Thompson，J. D.，Higgins，D. G.和 Gibson，Τ· J. (1994) CLUSTAL W:1mproving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,positions—specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22，4673-4680.
Yuj D.，Liang, J.，Yuj H.，Wuj H.，Xuj C.，Lu, J.，Laij R. (2006) A tick B-cell inhibitory protein from salivary glands of the hard tick,Hyalomma asiaticum asiaticum Biochemical and Biophysical research communications 343，585—590
W084/03564
PCT/ GB2009/002219.
权利要求
1.一种树突状细胞(DC)调节蛋白，其中，所述蛋白调节哺乳动物DC的分化和成熟，并且包含 i)下述a)、b)或c)中任何一个的氨基酸序列a)SEQID NO: 2、SEQ ID NO: 25或SEQID NO:28(RaA) ；b)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:29(RaB) ；c)SEQ ID NO:6、SEQID NO:24 或 SEQ ID NO:27(Rsl)； ii)i)中定义的蛋白的同源物，且所述同源物与i)中定义的蛋白的同一性为至少40%;或 iii)上述i)中定义的蛋白或上述ii)中定义的同源物的活性片段。
2.如权利要求1所述的DC调节蛋白，其中，所述DC调节蛋白包含SEQID NO: 2、SEQID N0:4或SEQ ID NO:6中任何一个的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白与SEQID NO: 2的氨基酸序列的同一性至少为47%。
4.如权利要求1或2所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白与SEQID NO:4的氨基酸序列的同一丨I"生至少为53%。
5.如权利要求1或2所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白与SEQID NO:6的氨基酸序列的同一性至少为81%。
6.如权利要求1或2所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白不具有SEQID NO:8、SEQ IDNO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO: 16 中任何一个的氨基酸序列。
7.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白在一个或多个位置发生糖基化。
8.如权利要求7所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含具有糖基化位点的序列 -⑴^-⑴吣^^-⑵乃-⑴^-匕且其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。
9.如权利要求8所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含具有糖基化位点的序列C-(X)2-W-W1H6-N-Z-(S/T)-(F/Y)_⑴2_4-C，且其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。
10.如权利要求8所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含具有糖基化位点的序列C-(X)2-W-(x)7_n-(I/L)-P-(X)3-N-Z-(S/T)_ (X) 3_5-C，且其中，X 为任意氨基酸，Z 为除脯氨酸以外的任意氨基酸。
11.如权利要求8所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含糖基化位点序列C- (X) 2-ff- (X) 7_n- (I/L) -P- (X) 3-N-Z- (S/T) - (F/Y) - (X) 2_4_C，且其中，X 为任意氨基酸，Z 为除脯氨酸以外的任意氨基酸。
12.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白是脂质运载蛋白。
13.如权利要求12所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含半胱氨酸分布模式C-(X)8 002_w_00001Q-12_c,且其中 x 为任意氨基酸。
14.如权利要求7 13中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含半胱氨酸分布模式和糖基化位点序列 C- (X) 82_91-C- (X) 2-ff- (X) 12_16-n-z- (S/T) - (X) 4-C- (X) 10_12-C,且其中，X为任意氨基酸，Z为除脯氨酸以外的任意氨基酸。
15.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含基序CXXW，且其中X为任意氨基酸。
16.如权利要求15所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含基序CXLW，且其中X为任意氨基酸。
17.如权利要求15或16所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白包含基序CSLW或CELW。
18.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白与脂质复合。
19.如权利要求18所述的DC调节蛋白，其中，所述脂质是类固醇或固醇。
20.如权利要求18所述的DC调节蛋白，其中，所述脂质是胆固醇或胆固醇的代谢产物，例如维生素D3或地塞米松。
21.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白调节人DC的分化和成熟。
22.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白抑制DC的分化和成熟。
23.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，所述DC调节蛋白分离自吸血节肢动物。
24.如权利要求23所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白分离自蜱。
25.如权利要求24所述的DC调节蛋白，其中，所述蜱选自硬蜱属、凹沟蜱亚科、花蜱亚科、血蜱亚科、包括璃眼蜱亚科的扇头蜱亚科、纳蜱科、软蜱亚科、残喙蜱亚科、匙喙蜱亚科、伪盾蝶亚科和钝缘蝶亚科。
26.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白抑制T淋巴细胞的活 化。
27.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白调节T淋巴细胞的极化。
28.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，其中，所述蛋白是免疫抑制剂。
29.如前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白，所述DC调节蛋白与存在于DC外膜上的受体结合。
30.如权利要求29所述的DC调节蛋白，所述DC调节蛋白结合C型凝集素受体。
31.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码前述权利要求中任一项所述的DC调节蛋白的核酸序列。
32.如权利要求31所述的核酸分子，所述核酸分子包含SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的任何一个。
33.一种核酸分子，所述核酸分子在高度严格杂交条件下与权利要求31或32所述的核酸分子杂交。
34.—种载体,所述载体包含权利要求31 33中任一项所述的核酸分子。
35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求34所述的载体或权利要求31 33中任一项所述的核酸分子。
36.一种制备权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白的方法，所述方法包括在使述蛋白表达的条件下培养权利要求35所述的宿主细胞并回收由此产生的所述蛋白。
37.一种抗体,所述抗体结合权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白。
38.一种调节DC的方法，所述方法包括使所述DC接触权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞或权利要求37所述的抗体。
39.一种经调节的DC，所述经调节的DC用权利要求38所述的方法产生。
40.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体或权利要求39所述的DC ;和药物可接受的载剂。
41.如权利要求40所述的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种额外治疗剂。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述一种或多种额外治疗剂包括抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子模拟物或细胞因子结合蛋白。
43.如权利要求40 42中任一项所述的药物组合物，其中，所述一种或多种额外治疗剂包括疾病相关要素。
44.用于疗法的权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
45.用于治疗或预防自身免疫性疾病、诸如移植排斥等移植反应、急性及慢性炎症性疾病、过敏症或诸如超敏症等其他免疫相关敏感症的权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
46.用于治疗或预防包括由节肢动物传播的疾病在内的传染病的权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
47.用于治疗或预防癌症的权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
48.一种治疗患有自身免疫性疾病、诸如移植排斥等移植反应、急性及慢性炎症性疾病、过敏症或诸如超敏症等其他免疫相关敏感症的动物的方法，所述方法包括向所述动物施用药物有效量的权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
49.一种治疗患有包括由节肢动物传播的疾病在内的传染病的动物的方法，所述方法包括向所述动物施用药物有效量的权利要求1 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
50.一种治疗患有癌症的动物的方法，所述方法包括向所述动物施用药物有效量的权利要求I 30中任一项所述的DC调节蛋白、权利要求31 33中任一项所述的核酸、权利要求34所述的载体、权利要求35所述的宿主细胞、权利要求37所述的抗体、权利要求39所述的DC或权利要求40 43中任一项所述的药物组合物。
51.权利要求48 50中任一项所述的方法或权利要求44 47中任一项所述的DC调节蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体、DC或药物组合物,其中,所述DC调节蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体、DC或药物组合物与疾病相关要素组合施用。
52.权利要求51所述的方法或权利要求51所述的DC调节蛋白、核酸、载体、宿主细胞、抗体、DC或药物组合物，其中，所述疾病相关要素选自与传染原相关的成分；过敏原；与除过敏外的超敏反应相关的非自身成分；与自身免疫性疾病相关的自身成分；移植抗原；血型抗原；和肿瘤抗原。
全文摘要
本发明提供一种调节并优选抑制哺乳动物树突状细胞的分化和/或成熟的树突状细胞调节蛋白。本发明还提供包含在此类蛋白中发现的保守性基序的蛋白，以及包含所述树突状细胞调节蛋白及其同源物和活性片段的药物组合物、其抗体和使用所述蛋白、同源物、片段及抗体的治疗方法。
文档编号A61K38/17GK103037890SQ201180025220
公开日2013年4月10日 申请日期2011年3月23日 优先权日2010年3月23日
发明者J·M·奥斯汀, G·C·帕森, 斯蒂芬·普雷斯顿, 帕特丽夏·纳托尔 申请人:自然环境研究会