用于诊断前列腺癌的新型RNA‑生物标志物标签的制作方法

本发明属于生物化学领域。特别地，本发明属于分子生物学领域。更特别地，本发明涉及rna转录物的分析。最特别地，本发明属于前列腺癌诊断领域。
背景技术：
：前列腺癌是男性中最常见的癌症。2012年，新诊断的前列腺癌病例数量在美国约为24万例，欧盟约为36万例，其中德国为68,000例。在美国，目前估计前列腺癌诊出和前列腺癌死亡的终身风险分别为15.9％和2.8％。尽管对前列腺癌进行了广泛的筛查，并在治疗转移性疾病方面取得了重大进展，但在西方世界前列腺癌仍然是每年25万男性患癌死亡的第二大常见原因。目前，前列腺特异性抗原(psa)血清水平的检测和直肠指检是两种主要的筛查方法。通常建议结果异常的患者进行前列腺活检。然而，这会有严重的后果。产生大量假阳性结果的psa筛查因缺乏特异性导致全世界每年有数百万男性进行不必要的前列腺活检(过度诊断)。此外，进行活检带来感染性并发症的重大风险。因此，对于早期前列腺癌诊断迫切需要一种更灵敏和特异性更高的诊断试验以改善前列腺癌筛查并避免大量不必要的前列腺活检。本发明通过提供一系列用于筛查和诊断前列腺癌的生物标志物来解决这个问题。发明概述通过对前列腺癌患者和对照的64个样本进行二代测序鉴定了在肿瘤组织和对照组织中差异表达的转录物，并通过微阵列和qrt-pcr分析对256个样本和56个样本分别进行验证。本发明描述了rna生物标志物，其迄今尚未被发现适用于前列腺癌的诊断。本发明涉及一种用于诊断前列腺癌症的方法，其包括分析患者样本中至少两种核酸的表达水平的步骤，其中所述至少两种核酸选自至少两组核酸，其中所述组由以下构成：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38其中，如果所述至少两种核酸的表达水平高于阈值，则所述样本被认定为前列腺癌阳性。本发明还涉及在严格条件下与上述组中的核酸杂交的一系列核酸。本发明进一步涉及该方法用于诊断前列腺癌的用途。本发明还涉及用于诊断前列腺癌的试剂盒，其包括至少两个引物或者探针，所述引物或者探针在严格条件下与至少两种核酸杂交，其中所述至少两种核酸选自至少两组核酸，其中所述组具有下列组成：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38定义为用于本申请文中的特定术语提供以下定义。如本发明所用，“核酸”或者“核酸分子”通常指可以是未经修饰或者修饰的任何核糖核酸或者脱氧核糖核酸。“核酸”包括但不限于单链和双链核酸。如本发明所用，术语“核酸”还包括如上所述的包括一个或者多个修饰碱基的dna。因此，具有因稳定性或其他原因经过修饰的主链的dna是“核酸”。本发明所用的术语“核酸”包括化学、酶学或代谢修饰形式的核酸，以及病毒和细胞dna特征的化学形式，包括例如简单和复杂的细胞。本发明上下文中的术语“水平”或者“表达水平”指的是生物标志物存在于患者样本中的水平。通常，通过将生物标志物的表达水平与用于标准化的样本中的一个或者几个管家基因进行比较来测量生物标志物的表达水平。如果生物标志物的表达水平超过合适的对照(例如健康的组织)的相同生物标志物的表达水平设定的阈值，则来自患者的样本被认定为前列腺癌阳性。本发明所用的术语“分析样本中核酸的存在和/或水平”或者“具体估计核酸的水平”涉及用于评估和定量核酸水平的方式和方法。一种有用的方法是，例如，定量逆转录pcr。同样地，也可以通过例如northern印迹法、二代测序或者包括测量扩增后在260和280nm处吸光度的光谱技术来分析rna水平。如本发明所用的术语“扩增”，当其应用于核酸序列时，指的是从一个核酸模板序列产生特定核酸序列的一个或者多个拷贝的过程，优选通过聚合酶链式反应的过程。其他的扩增方法包括，但不限于，连接酶链式反应(lcr)、基于特异性多核苷酸的扩增(nsba)或者本领域公知的任何其他方法。如本发明所用，关于诊断标志物或者预后标志物使用的术语“关联”将来自病人的样本中标志物的存在或者量与来自一个已知具有某种症状或者存在具有该症状风险的人的样本的标志物的存在或者表达水平相比较。患者样本中标志物的表达水平可以与已知与特定诊断相关联的水平进行比较。如本发明所用，术语“诊断”涉及鉴定任何发展阶段的疾病，在本发明中指的是前列腺癌，并且还包括确定受试者发展该疾病的倾向。术语“ensembl基因idensg00000245750.3”涉及ensembl的基因id序列注释。属于相同基因id的转录物可能具有不同的剪接事件、外显子，并且可能产生差别极大的蛋白质。这些蛋白质是因选择性剪接而产生的异构体。所述ensembl基因id在其他的注释系统例如，rp11-279f6.1,或者基因座(hg19)chr15:69,755,365-69,863,775(+)具有等同物。在本发明中，任何ensembl注释的等同物均可以使用。术语“ensembl基因idensg00000255545.3”涉及ensembl的基因id序列注释。属于相同基因id的转录物可能具有不同的剪接事件、外显子，并且可能产生差别极大的蛋白质。这些蛋白质是因选择性剪接而产生的异构体。所述ensembl基因id在其他的注释系统例如，rp11-627g23.1或者基因座(hg19)chr11:134,306,367-134,375,555(+)具有等同物。在本发明中，任何ensembl注释的等同物均可以使用。如本发明所用，术语“荧光染料”指的是吸收特定波长的光能并以不同波长重新发光的任何化学物质。适用于标记核酸的荧光染料包括例如：fam(5-或6-羧基荧光素)、vic、ned、荧光素、fitc、ird-700/800、cy3、cy5、cy3.5、cy5.5、hex、tet、tamra、joe、rox、bodipytmr、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、亚基马黄(yakimayellow)、阿利克夏染料(alexafluor)以及pet等等。如本发明所用，当术语“分离的”用于提及核酸时，其意指天然存在的序列从其所在的正常细胞(例如染色体)环境中去除，或者在非天然环境中合成(例如人工合成)。因此，所述“分离的”序列可以在无细胞的溶液中，或者被置于不同的细胞环境中。如本发明所用，“试剂盒”指的是一个封装的组合；该组合可选择地包括该组合的使用说明和/或使用该组合需要的其他反应物和组件。如果所述试剂盒包括核酸，所述试剂盒还可以包括所述核酸的合成或者非天然突变体。合成的或者非天然的核酸应被理解为包含任何化学、生物化学或者生物学修饰的核酸，这样的核酸并非以此形式出现于自然界中。这些修饰包括但不限于：带有荧光染料或者淬灭剂标记、生物素标签以及核酸骨架的修饰，或者将上述核酸区别于其天然对应物的任何其他修饰。上述说明同样适用于其他天然化合物例如蛋白、脂质等。本发明所用术语“患者”指的是因为疾病或者怀疑患有疾病而正在接受医疗护理或者应该接受医疗护理的活着的人或者非人生物。这包括正在被调查病理征兆的尚未确定疾病的人。因此本发明所述的方法和试验适用于人类和兽类疾病。本发明所用属于“引物”，指的是核酸——无论其是纯化的限制性消化中自然出现或者以合成方式产生的，当将该核酸置于引物延伸产物合成的条件下，其可以作为合成的起始点；其与一条核酸链互补，并在核苷酸、诱导剂例如dna聚合酶的存在下，及合适的温度和ph时被诱导。所述引物可以为单链或者双链，其必须足够长以引导所需延伸产物在诱导剂存在下合成。引物的确切长度取决于众多因素：包括温度、引物的来源以及所用方法。优选地，引物的长度为大约15-100个碱基；更优选地为大约20-50个碱基；最优选的为大约20-40个碱基。关于确定引物合适长度的因素对本领域普通技术人员而言是容易获知的。可选择地，上述引物可以是合成的元件，即其包含化学、生物化学或生物学修饰。这些修饰包括但不限于：带有荧光染料或者淬灭剂标记，或者核酸骨架中的修饰，或者将上述引物区别于其天然对应物的任何其他修饰。术语“探针”指的是任何可用于特异性检测生物实体的元件，例如核酸、蛋白或者脂质。除了可以特异性结合生物实体的部分以外，探针上还包括允许其在试验中被检测到的至少一个修饰。该修饰包括但不限于：标记，例如荧光染料；特别引入的放射性元素；或者生物素标签。所述探针还包括其结构上的修饰，例如锁定的核酸。本发明所用术语“样本”指的是为了诊断、预后或者评估感兴趣的受试者，例如患者的目的而获得的体液或者组织的样本。优选的测试样本包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。此外，本领域技术人员能够认识到，在分馏或纯化程序之后，一些测试样本将更容易被分析，例如将全血分离成血清或血浆组分。因此，在本发明一优选实施例中，所述样本选自组，该组包括：血液样本、血清样本、血浆样本、脑脊液样本、唾液样本、尿液样本或者任何上述样本的提取物，以及血液或者淋巴中的循环肿瘤细胞、任何疑似含有转移的组织以及任何可能包含前列腺癌细胞或者其部分的来源，包括囊泡，例如外来体、微泡等，以及来自前列腺肿瘤细胞的游离的或与蛋白质结合的rna分子。优选地，所述样本为血液样本，最优选地为血清样本或者血浆样本。重要的是，尿液(特别是直肠指诊后)和精液属于最优选的样本。组织样本也可以是在手术过程获得的活检标本或组织样本。本发明所用术语“曲线下面积(auc)”描述了接收器操作特性(roc)曲线或者roc曲线下的面积。auc涉及生物标志物的特异性和灵敏度。一个完美的标记(auc＝1.0)在roc空间的左上角产生一个点或者坐标为(0，1)的点，这表示灵敏度为100％(无假阴性)且特异性为100％(无假阳性)。术语“p值”涉及当零假设实际为真，即不同组的平均值之间没有差异时获得观察到的样本结果(或更极端的结果)的可能性。p值越小，替代假设相比于比零假设能更好地解释观察结果的可能性越高。术语“调整后的p值”指的是因多种比较(被测试基因/探针的数量)而调整后的p值。应用的方法在实验部分详细描述。本发明的详细描述本发明描述了前列腺癌诊断的方法。所述方法包括分析取自患者的样本并具体确定所述患者样本中生物标志物组合的水平。然后，将每个生物标志物的结果与阈值相关联，并且当结果超过该阈值时，所述患者样本被认定为前列腺癌阳性。本发明涉及包含seqidnos.1～42的几组序列。所述序列如下所示。限于篇幅，仅列出前100个核苷酸。序列的其他部分可以在序列表中找到。特别地，本发明涉及8组不同的序列：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38序列seqidno3和11对应于来自该基因座(hg19)：chr2：1,550,437-1,629,191(-)的剪接的转录物。转录物seqidno.36和38的长度分别为38342个核苷酸和346832个核苷酸。发明者惊奇地发现，这两个核酸对应的是单个的、长的转录物。因此，这些长转录物任意部分表达水平的检测适用于本发明的方法。有两种类型的序列。第一种，一些转录物是已经在相关数据库中注释的已知序列。它们通过各自的注释被识别。第二种，还没有被注释的新的转录物。本发明中它们被设定为：xloc_后跟一个数字。这些名称提供了关于转录物的基因组起源的信息，但可能不会代表给定转录物的整个序列。检测到的序列在一些情况下可能更长或者更短。在xloc转录物的情况中，如果检测到片段，则这些片段可以短至1000个、500个、400个、300个、200个、150个、100个、50个、40个、30个、20个、10个、9个、8个、7个、6个或者5个核苷酸。表1：seqidno列表。同时列出序列seqidnos1～42及其相应的转录物和基因注释。表中显示每条seqidno的前100个核苷酸。生物标志物pca3通常用于前列腺癌(pca)的诊断。正如所预期的，本发明人通过二代测序发现：pca3的表达水平是测试的受试者中pca疾病的象征(图2)。然而，发现生物标志物在非常低风险的肿瘤(v)中具有最高的表达水平，并且随着肿瘤的危险因素的增加而降低。这一发现使pca3成为中高危肿瘤的不可信标志物，这也表明需要更好的前列腺癌生物标志物。就特异性和灵敏度来说，发明人发现了许多显著优于pca3的新的生物标志物。例如，相比于pca3的值为0.851，retro-rpl7(seqidno.1)在roc曲线下的面积(auc)的值为0.935(图3)。seqidno.1和seqidno.12所示序列与生物标记的组合产生的auc值为0.985(见表7)。已经发现以下组的生物标志物的组合对前列腺癌具有高度指示性：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38选自所有上述8组的生物标志物的组合产成的auc值为1.0(见图6)。因此，本发明涉及一种诊断前列腺癌症的方法，其包括分析患者样本中至少两种核酸的表达水平的步骤，其中所述至少两种核酸选自至少两组核酸，其中，所述组由以下构成：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38其中，如果所述至少两种核酸的表达水平高于阈值，则认定所述样本为前列腺癌阳性。本发明进一步涉及一种诊断和/或治疗前列腺癌的方法，其包括分析患者样本中至少两种核酸的表达水平的步骤，其中所述至少两种核酸选自至少两组核酸，其中所述组由以下构成：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38其中，如果所述至少两种核酸的表达水平高于阈值，则认定所述样本为前列腺癌阳性；并且给患者施用一种或多种前列腺癌治疗剂。优选的前列腺癌治疗药物包括：多西他赛卡巴他赛米托蒽醌雌莫司汀多柔比星依托泊苷(vp-16)、长春花碱紫杉醇卡铂醋酸阿比特龙、比卡鲁胺、康士得、地加瑞克、恩杂鲁胺、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、泼尼松、西普鲁塞-t(sipuleucel-t)、二氯化镭223和/或长春瑞滨在一优选的实施例中，本发明涉及一种诊断前列腺癌症的方法，其包括分析至少两种核酸的表达水平的步骤，其中所述至少两种核酸中的至少一种选自第2组中的seqidno.4、5、6、7、8、9和10，和/或第1组中的seqidno.1。在本发明的另一个实施例当中，分析至少3种核酸的表达水平，其中所述核酸选自至少3个不同的组。在本发明的可选实施例中，分析至少4种核酸的表达水平，其中所述核酸选自至少4个不同的组。在本发明的可选实施例中，分析至少5种核酸的表达水平，其中所述核酸选自至少5个不同的组。在本发明的可选实施例中，分析至少6种核酸的表达水平，其中所述核酸选自至少6个不同的组。在本发明的可选实施例中，分析至少7种核酸的表达水平，其中所述核酸选自至少7个不同的组。在本发明的最优选的实施例中，分析每一组中的至少1种核酸的表达水平。所述样本可以选自以下组，所述组包括：前列腺组织、活检材料、淋巴结、尿液、精液、血液、血清、血浆、血液或淋巴中的循环肿瘤细胞、疑似含有转移的任何组织以及可能含有前列腺肿瘤细胞或其部分，例如外来体、微泡、以及来自前列腺肿瘤细胞的游离的或与蛋白质结合的rna分子。更优选地，所述样本为尿液，最优选地，所述样本为患者经过直肠指检(dre)后的尿液。用于定量核酸的任何合适的方法可用于分析核酸的表达水平。在一个实施例中，使用基于荧光的试验进行核酸定量。在一优选的实施例中，通过测量标记的引物、标记的探针或荧光检测剂的荧光来进行表达水平的分析。在本发明的另一个实施例中，使用基于核酸扩增的试验进行核酸定量。在一优选实施例中，使用pcr或测序方法进行核酸定量。在最优选的实施例中，使用qrt-pcr进行核酸定量。在一可选的实施例中，对由核酸或其反向互补序列编码的蛋白质进行分析和定量。本发明还涉及用于诊断前列腺癌的试剂盒，其包括至少两个引物或者探针，所述引物或者探针在严格条件下与至少两种核酸杂交，其中所述至少两种核酸选自至少两组核酸，其中所述组由以下构成：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38所述试剂盒可能包括两种以上的核酸。在一优选的实施例中，所述试剂盒还包含用于分析表达水平的试剂。在一优选的实施例中，所述试剂盒还包括用于核酸扩增和/或核酸定量和/或核酸检测的试剂。在另一实施例中，所述试剂盒包括对照样本。实验结果表明新型生物标志物组合对pca检测具有高度特异性和灵敏度。理想地，将组中核酸的转录物的表达水平与样本中一个或几个其他基因(例如管家基因)的转录物的表达水平进行比较。合适的管家基因的实例如下表2所示：表2：阈值为测试样本和被指定为癌阳性的对照样本之间的最小表达差异。理想地，测试样本与对照样本之间生物标志物的表达水平差异为1.5倍(±20％)、2倍(±20％)、3倍(±20％)、4倍(±20％)以及最优选地为5倍(±20％)或者更多。p值(t检验)为﹤2×10-5。fdr优选为﹤5×10-4。对于所选择的基因的组，阈值优选为肿瘤样本的表达相比于对照样本的表达增加2倍(±20％)。本发明涉及rna生物标志物的水平分析。该分析可以通过多种方法完成，例如基于pcr的方法，如定量逆转录pcr。本发明涉及一种特异性确定生物标志物水平的扩增方法。在本发明中，将样本与对核酸特异的正向引物以及反向引物混合，所述核酸的序列至少选自以下序列组：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38然后进行扩增循环。设计探针或引物使得它们在严格条件下能够与所述靶序列杂交。所述至少两个扩增反应可以同时进行或以多重扩增的形式进行。在一个实施例中，通过测量标记的引物、标记的探针或荧光检测剂的荧光来进行该方法中的分析。更优选地，通过qrt-pcr进行表达水平的分析。在进一步的实施例中，通过测序的方法进行至少两种核酸的表达水平的分析。本发明还涉及组合中包括的生物标志物的表达水平的定量。扩增后，直接定量并且定量可以通过多种方法完成。在使用其中至少一个引物具有荧光染料时，可以使用来自染料的荧光信号进行定量。可以使用各种引物系统和染料，如sybrgreen、多重探针、taqman探针、分子信标和蝎形引物。其他可行的定量方法是，例如northern印迹法、二代测序或260和280nm处的吸光度测量。从下面的实施例清楚地得出，本发明公开了用于检测前列腺癌的生物标志物组合，其比目前的生物标志物可以更准确和灵敏地诊断疾病。实施例临床队列在德累斯顿大学医院接受根治性前列腺切除术(rpe)或手术以去除良性前列腺增生(bph)的前列腺癌(pca)患者被纳入旨在鉴定pca新生物标志物的回顾性临床队列。根据法律规定，获得当地道德委员会的批准和患者知情同意书。对于pca患者，收集至少五年的临床随访数据。来自40名pca患者和8名bph患者的前列腺组织样本用于通过全基因组rna测序鉴定诊断相关的生物标志物。根据gleason(theveteran’sadministrationcooperativeurologicresearchgroup:histologicgradingandclinicalstagingofprostaticcarcinoma；intannenbaum,m.urologicpathology:theprostate,philadelphia:leaandfebiger.pp.171-198)及rpe中相邻淋巴结转移的存在(参见表3)的阶段划分，基于分期定义了四个pca组。表3：用于全基因组rna测序的pca队列：对照组(c)由bph样本组成。非常低风险(v)和低风险(l)组包括分别具有gleason评分(gs)<7和＝7的患者的样本，全部无淋巴结转移(pn0)。中风险(m)组包括gs<＝7且呈现淋巴结转移(pn+)的病例；高危组(h)组由gs>7的组织组成。对于后者，分析了从相同患者获得的成对的肿瘤和无肿瘤的组织样本。通过定制的微阵列和定量逆转录实时pcr(qrt-pcr)，进一步对包含256个(40个对照bph、216个肿瘤样本)和56个患者(16个对照bph、40个肿瘤样本)的队列分别验证选择的生物标志物候选物。前列腺组织样本前列腺组织样本获得自德累斯顿大学医院泌尿外科手术，并储存在德累斯顿大学综合癌症中心的液氮中。对前列腺癌(pca)患者进行的前列腺切除术(rpe)获得的前列腺组织样本分为肿瘤样本和无肿瘤样本。使用良性前列腺增生(bph)患者的前列腺组织样本作为非肿瘤对照。上述均具备患者知情同意书。为了验证样本的状态及其肿瘤细胞含量，将所有样本分为一系列冷冻切片。为此，将冷冻组织样本包埋在tissue-tekoct化合物(sakurafinetekgmbh)中，并通过冷冻固定在金属压头上。使用装有冷却至-28℃的切片机刀片c35(feather)的冷冻切片机(leica)制备冷冻切片。将每个样本切成总共208个冷冻切片，其中4个进行he染色，并由病理学家对其肿瘤细胞含量进行评估(图1)。由此产生3堆连续的冷冻切片，其中每堆冷冻切片两个侧边为he染色部分。仅将任一侧边包含至少60％或最多5％肿瘤细胞部分的堆分别用作肿瘤样本或无肿瘤样本。然后对所选择堆的50个冷冻切片进行rna制备。rna分离使用qiazol和qiacube上的mirneasyminikit(均来自qiagen)，随后手动进行dna酶i消化，从冷冻保存的组织中分离总rna。使用nanodrop1000(peqlab)测定rna浓度。使用agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies，paloalto，ca)验证rna完整性，并且仅对rna完整性数值(rin)至少为6的rna样本进行进一步处理。全基因组长rna二代测序使用包含来自良性前列腺增生(bph)8个前列腺组织样本作为对照和56个肿瘤组织样本(包括来自具有gleason评分的样本的肿瘤和无肿瘤组织对)的回顾性pca队列的子集进行全基因组的rna测序。使用ribo-zerorrnaremovalkit(epicenter)从1μg总rna中去除核糖体rna。使用scriptseqv2rna-seq文库制备试剂盒(epicenter)从50ng不含rrna的rna制备测序文库。使用agencourtampurexp系统试剂盒(beckmancoulter)纯化双标记的cdna。pcr进行10个循环以掺入用于样本多重化的索引条形码并扩增cdna文库。在agilentbioanalyzer(agilenttechnologies)中，使用dnahighsensitivitykit测定扩增文库的质量和浓度。8个样本中每个取4ng混为一个库，并用琼脂糖凝胶电泳在2％琼脂糖凝胶中选择大小。根据制造商的说明书，用minelutegelextraction(qiagen)将150～600bp范围之间的样本进行割胶和纯化。在agilentbioanalyzer中，使用dnahighsensitivitychip(agilenttechnologies)对纯化的文库进行定量。然后将每个纯化的、经过大小选择的库加载到illuminahiseq2000的流动池，并将其分配到所有通道中。根据制造商的方案，在illuminacbot仪器中，使用truseqpeclusterkitsv3(illuminainc.)进行簇生成。使用illuminahiseq2000测序仪(illuminainc.)进行测序。测序运行的细节如下：双末端测序策略；read1为101个循环，索引序列为7个循环，read2为101个循环。测序数据的分析：原始数据的准备使用casavav1.8.1(illumina)对包含碱基响应文件(bcl文件)的原始测序数据进行处理，从而产生fastq文件。fastq文件包含每个临床样本所有测序的rna片段，以下称为“读数”。通过使用cutadapt(http://code.google.com/p/cutadapt/)删除特定的转座序列。测序数据的分析：基因图谱绘制以及转录物组装使用segemehlv0.1.4-382和tophatv2.0.9将读数映射至人类基因组(集合hg19)。使用cufflinksv2.1.1和cuffmergev2.1.1将新的转录物，即在gencodev17中未注释的转录物组装起来。将所有新的转录物单和所有已知的gencodev17中的转录物合并成一个综合注释集。测序数据的分析：统计分析通过htseq-countv0.5.4p1(http://www-huber.embl.de/users/anders/htseq/doc/count.html)计算具有新的和已知的转录物的综合注释集中包含的每个转录物和基因的读数。使用r和bioconductorlibrariesedger鉴定差异表达的转录物和基因。通过缩放每个样本的文库大小(tmm方法)调整临床样本的不同rna组成。将负二项对数线性模型拟合到每个转录物或基因的读数计数，并且通过似然比检验识别不为零的系数。错误发现率由benjanimi-hochberg调整控制。定制微阵列的验证基于测序结果，定制了具有180000个探针(agilentsureprintg3customexonarray，4x180k，design-id058029)的微阵列，其包含mrna、长非编码rna(gencodev15)、新转录物和所有差异表达的转录物。使用包含作为对照的来自良性前列腺增生的40个前列腺组织样本，以及在根治性前列腺切除术后的pca患者的164个肿瘤组织样本和52个无肿瘤组织样本回顾性pca队列进行微阵列筛选。使用quickamplabelingkit(agilent)，用200ng总rna合成crna，并将1650ngcrna在阵列(agilentgeneexpressionhybridizationkit)上杂交。通过实时定量pcr进行验证为了验证通过二代测序和微阵列筛选获得的结果，使用实时定量pcr筛选总共56个组织样本(16个无肿瘤样本和40个肿瘤样本)。根据制造商的说明书，使用high-capacityreversetranscriptionkit(appliedbiosystems)和随机引物，从100ng总rna合成cdna。随后使用4μl稀释的cdna进行pcr试验。使用定制和预设计的taqmangeneexpressionassays(appliedbiosystems)在appliedbiosystems7900htreal-timepcr系统上进行管家基因和目标转录物的实时定量pcr。所有样本均一式三份测量，并将这些测量的方法用于进一步的计算。表4：用于前列腺组织样本中qrt-pcr验证的appliedbiosystemstaqman基因表达试验的id。rt-qpcr结果的统计分析对未调节的管家基因gapdh(seqidno.1)和hprt1(seqidno.3和seqidno.9)分别进行数据归一化。对于相对定量，分析相对于对照样本的中值表达的每个样本基因表达的变化。所有统计学分析均采用r统计软件进行。使用学生t-检验(student'st-test)，比较肿瘤样本和对照样本之间生物标志物的log2转化的相对表达水平。使用proc包计算接收器操作特性(roc)曲线，其通过曲线下面积(auc)表示每个标记物的的诊断能力的量度。所有样本均一式三份测量，并将这些测量的方法用于进一步的计算。dre尿液样本的验证dre尿液样本的收集以及rna分离在前列腺直肠指诊(dre)后收集尿样(dre尿液)。这种常规进行的检查方法允许使尿液样本包括一定量的前列腺细胞。将dre尿液样本离心并用pbs洗涤两次。将所得细胞沉淀重新悬浮于700μlqiazol中。随后使用手动操作dna酶i消化，使用qiacube上的mirneasyminikit(均来自qiagen)分离总rna。使用nanodrop1000(peqlab)测定rna浓度。在agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies，paloalto，ca)上验证rna完整性。实时定量pcr筛选dre尿液样本根据制造商的说明书，从2×50ng的总rna中，使用superscriptiii逆转录酶(appliedbiosystems)以及随机引物合成cdna。随后使用4μlcdna进行pcr试验。在appliedbiosystems的7900htreal-timepcr系统中使用定制和预设计的taqmangeneexpressionassays(appliedbiosystems)进行管家基因(psa)和靶转录物的实时定量pcr。所有样本均一式两份测量，并将这些测量的方法用于进一步的计算。dre尿液样本的全基因组长rna二代测序对于全基因组长rna测序，使用乙醇将7个dre尿液样本中的全部rna析出，以浓缩rna的量并重悬于10μl不含rna酶的水中。使用lowinputribo-zerorrnaremovalkit(epicentre，经clontech修饰)从4ngrna中去除rrna，得到10μl不含rrna的rna。利用8μl不含有rrna的rna，使用smarterstrandedrnaseqkit(clontech)来准备测序文库。使用agencourtampurexpsystemkit(beckmancoulter)纯化双标记的cdna。pcr进行18个循环，以掺入用于多重样本的索引条形码并扩增cdna文库。在agilentbioanalyzer(agilenttechnologies)上使用dnahighsensitivitykit测定扩增的文库的质量和浓度。样本被合并为库，并且根据制造商的说明书在illuminacbot仪器上使用15pmol/l的合并文库以及truseqpeclusterkitv4(illuminainc.)来生成簇。在illuminahiseq2500测序仪(illuminainc.)上，使用hiseqsbsv4测序试剂(250个循环)进行测序。测序运行的细节如下：双末端测序策略；read1为126个循环，索引序列为7个循环，read2为126个循环。dre尿液qrt-pcr结果的统计分析针对前列腺特异性抗原(psa)进行数据归一化，以分析来自dre尿液样本的qrt-pcr结果。对于相对定量，分析相对于对照样本的中值表达的每个样本基因表达的变化。所有统计学分析均采用r统计软件进行。表5：用于qrt-pcr验证的appliedbiosystemstaqman基因表达试验的id。结果将rpe和8个bph前列腺组织样本作为良性、非肿瘤对照，使用链特异性、双末端长rna二代测序(ngs)分析40个pca肿瘤样本和16个无肿瘤样本的转录组。为了优化数据质量和分析的稳定性，制备了至少3个部分、每个样本约150个的冷冻切片。病理评估后，仅保留在肿瘤样本和无肿瘤样本中分别满足最大肿瘤细胞数为60％和最小肿瘤细胞数为5％的部分进行进一步分析。转录组测序(rnaseq)方法旨在全面鉴定和定量在正常或癌前列腺组织中表达的rna。将独立于多聚腺苷酸化状态的所有类别的编码和长的非编码转录物进行测序。使用大输入量的rna来确保文库的高复杂性。此外，对每个文库平均200m的双末端读数2×100nt进行测序，使得低表达的转录物能够基于高覆盖率进行组装。该方法胜过大多数分析大量样本的同类公开研究。总共约组装了3000个没有显示与gencodev17中注释的转录物有外显子重叠的新的转录物。在错误发现率为0.01时，在所有对比中观察到有6442个差异表达的基因。表4给出了特定对比时差异表达基因的数量。表6：不同对比以及gencode生物型的差异表达基因的数量。结果成功地重现了先前报道在前列腺肿瘤和正常组织之间差异表达的大部分转录物。此外，已经鉴定了许多新的pca相关转录物，其可用于开发用于诊断pca的试验。选出的最有希望的转录物通过qrt-pcr在pca肿瘤和bph对照样本的测试队列中得到验证。这些新型生物标志物候选物中的几种，其特异性和灵敏度已经显著超过已经用于pca诊断的生物标志物pca3的特异性和灵敏度。在测序队列中，pca3被证明与pca明显相关，但高危组有较强的下降倾向(图2)。在测试队列中，相比于pca3在roc曲线(auc)下的面积值为0.851，新的生物标志物retro-rpl7(seqidno.1)产生的面积值为0.935(图3)。本发明的新的生物标志物retro-rpl7和xloc133897的组合产生的auc值为0.975(图6)。实验结果表明，新型生物标志物对pca的检测具有较高的特异性和灵敏度。因此，可以在可能含有前列腺肿瘤细胞或其部分(包括囊泡如外来体、微泡等，以及来自前列腺肿瘤细胞的游离或与蛋白质结合的rna分子)的所有来源中，单独或者组合测量这些新发现的生物标志物(或者与已知的生物标志物组合)的基础上来进行pca诊断。这些来源包括(但不限于)前列腺组织、活检材料、淋巴结、尿液、精液、血液、血清、血浆、血液或淋巴中的循环肿瘤细胞，以及疑似含有pca转移的任何组织。本发明rna生物标志物的测量可以通过适合特异性估计rna水平的任何方法进行，例如基于pcr的方法，如qrt-pcr。该试验可用于pca的早期诊断(筛选)、预测肿瘤的侵袭性(预后)和/或帮助选择治疗。因此，基于这些生物标志物的诊断试验可以显着降低当前测定的高假阳性率，从而有助于避免不必要的侵入性前列腺活组织检查。生物标志物的组合选自组，所述组由以下构成：第1组：seqidno.1第2组：ensembl基因id为ensg00000245750.3的剪接变体，其选自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10构成的组第3组：ensembl基因id为ensg00000255545.3的剪接变体，其选自由seqidno.26、27、28和29构成的组第4组：seqidno.3和11第5组：seqidno.12第6组：seqidno.24第7组：seqidno.36第8组：seqidno.38也对其组合的诊断价值进行了分析。本发明人发现当如下表和图7所示对所述组的组合进行分析时，诊断值和auc大大增加。这表明不仅单独的新型生物标志物优于先前已知的生物标志物，令人惊奇的是它们的组合也使pca诊断有进一步的显著改善。表7：包含第5组序列的标志物组合的auc值相比于第5组单独使用产生的auc值。数据来自256个前列腺组织样本的定制微阵列分析。seqaseqbauc值seqid120.817seqid12+seqid10.985seqid12+seqid30.959seqid12+seqid110.96seqid12+seqid4_100.989seqid12+seqid380.896seqid12+seqid360.944表8：包含第2组序列的标志物组合的auc值相比于第2组单独使用产生的auc值。数据来自256个前列腺组织样本的定制微阵列分析。seqaseqbauc试验seqid4_100.959seqid4_10+seqid26_290.981seqid4_10+seqid120.989seqid4_10+seqid380.98seqid4_10+seqid360.988表9：包含第3组序列的标志物组合的auc值相比于第3组单独使用产生的auc值。数据来自256个前列腺组织样本的定制微阵列分析。表10：包含第4组序列的标志物组合的auc值相比于第4组单独使用产生的auc值。数据来自256个前列腺组织样本的定制微阵列分析。seqaseqbauc试验seqid30.935seqid3+seqid10.984seqid3+seqid4_100.981seqid3+seqid110.946seqid3+seqid120.959seqid3+seqid26_290.962seqid3+seqid360.974seqid3+seqid380.958表11：包含第1组序列的标志物组合的auc值相比于第1组单独使用产生的auc值。数据来自256个前列腺组织样本的定制微阵列分析。seqaseqbauc试验seqid10.935seqid1+seqid30.984seqid1+seqid4_100.986seqid1+seqid110.983seqid1+seqid120.985seqid1+seqid26_290.985seqid1+seqid360.986seqid1+seqid380.983表12：包含第6组序列的标志物组合的auc值相比于第6组单独使用产生的auc值。数据来自64个前列腺组织样本的rna二代测序分析。seqaseqbauc测序seqid240.919seqid24+seqid11seqid24+seqid30.984seqid24+seqid110.975seqid24+seqid121seqid24+seqid4_100.988seqid24+seqid26_290.962seqid24+seqid360.959seqid24+seqid380.966表13：包含第7组和第8组序列的标志物组合的auc值相比于第7组或者第8组单独使用产生的auc值。数据来自256个前列腺组织样本的定制微阵列分析。seqaseqbauc值seqid380.806seqid360.88seqid38+seqid360.958seqid24+seqid30.984seqid24+seqid110.975seqid24+seqid121seqid24+seqid4_100.988seqid24+seqid26_290.962seqid24+seqid360.959seqid24+seqid380.966本发明人还发现，可以在患者的尿样中检测到所有组的表达，然而在健康患者的尿样中所有组不表达或者低表达(图8)。这个结果是令人惊奇的，因为fontenete等人(int.brazjurol.vol.37no.6riodejaneironov./dec.2011)曾显示：由于其在健康患者中比在pca患者即本发明样本中更频繁地过表达，因此psa的mrna不是尿样中前列腺癌的合适的生物标志物。因此，分析尿样中生物标志物表达水平可以用于可靠地诊断前列腺癌并非先验的结果。基于这些生物标志物组合的诊断测定的优点使得其相比于现有的试验具有显著降低的假阳性率，并且测量其在尿样中的表达水平避免了进行不必要的侵入性前列腺活检。附图说明图1：组织样本质量的验证：为了确定组织样本的肿瘤细胞含量，如图所示，从冷冻样本制备冷冻切片。he：苏木精/伊红；ihc：免疫组化。组织样品质量的验证：从冷冻样品制备4μm的冷冻切片以用于he染色(以确保组织样品的肿瘤细胞含量)、rna和dna分离以及ihc。he：苏木精/伊红；ihc：免疫组化。图2：转录物pca3的rna测序结果箱型图。回顾性pca队列的rna测序结果包含来自良性前列腺增生的8个前列腺组织样本的作为对照(c)，v(非常低风险；gleason＜7，pn0)、l(低风险；gleason评分＝7，pn0)以及m(中等风险；gleason评分＜＝7，pn+)组，其中每个组都有8个pca肿瘤样本，以及高危组h(高危；gleason评分＞7)中的16对肿瘤组织和无肿瘤组织样本。图3：通过56个前列腺组织样本的qrt-pcr分析得出的retro-rpl7(seqidno.1)以及pca3的roc曲线。图4：seqidno.12的定制微阵列数据的箱线图。使用包含来自作为对照的良性前列腺增生的40个前列腺组织样本作为对照，以及在根治性前列腺切除术(rpe)后的pca患者的164个肿瘤组织样本和52个无肿瘤组织样本的回顾性pca队列进行的定制微阵列筛选结果。图5：通过对如图4所描述的256个前列腺组织样本进行定制微阵列分析得出的关于seqidno.12的roc曲线。图6：基于双转录标记的logit模型(logitmodel)。显示了包含retro-rpl7(seqidno.1)和xloc133897(seqidno.2)(auc＝0.975)的多变量logit模型的roc曲线。图7：生物标志物标签：a)将通过对8个对照组织样本(良性前列腺增生，bph)和40个前列腺癌组织样本中如序列seqidno.1、3、4-10、11、12、24、26-29、36和38所示的转录物进行rna二代测序得到的数据结合为一个标记以产生更高的特异性和灵敏度。数据通过箱线图(左侧)和roc曲线(右)显示。产生的auc值为1.0。b)将通过对40个对照组织样本(良性前列腺增生，bph)和164个前列腺癌组织样本中如序列seqidno.1、3、4-10、11、12、24、26-29、36和38所示的转录物进行定制微阵列分析得到的数据结合为一个标记以产生更高的特异性和灵敏度。数据通过箱线图(左侧)和roc曲线(右)显示。产生的auc值为1.0。图8：通过rna二代测序检测尿液样本中的生物标志物：在泌尿科医师对患者进行直肠指检后获得尿样。使用illuminahiseq2500二测序仪对从这些样本分离的rna进行转录组全rna测序。通过标准算法将读数映射至基因组，并对映射至本发明序列号(seqidno.)的基因座位点的读数进行计数，并将其归一化为从前列腺特异性抗原(psa)的基因位点得出的读数，其作为尿液中前列腺上皮细胞存在的量度。比较了患有和不患有前列腺癌的患者的样本。sequencelisting<110>弗劳恩霍夫应用研究促进协会<120>用于诊断前列腺癌的新型rna-生物标志物标签<130>p1710728wp<150>ep14195709.2<151>2014-01-12<160>42<170>patentinversion3.5<210>1<211>825<212>dna<213>homosapiens<400>1ttttccggctggaaccatggagggtgttgaagagaagaagaaggttcctgctgtgccaga60aacccttaagaaaaagtgaaggaatttcacagagctgaagatcaagcgcctgagaaataa120gtttgcccaaaagatgcttctaaaggcaaggaggaagcttatctatgaaaaagcaaagca180ctatcacaaggaatatatgcagatgtacagaactgaaattcaaatatcgaggatggcaag240aaaagctggcaacttctatgtatctgcagaacccaaattggcgtttgtcatcaggatcgg300aggttatcaattgggtgagcccaaaggtctgaaaggtgttgcaacttctttgccttcatc360aaatcttcaatagaaactttgtgaagctcagcagggcttcaataatgtgctgaggtttgt420agaaccatatattgcatgggcatacccaaatctgaagtcagtaaataaactaatctacaa480atgtggttatagcaaaatgaataagaagctacttgctccaacagataatactttgattgc540tcgatctcttggtaaatatggcctcatctgcatggaggatctgattcatgagatctatac600tgttggaaaatgcttaaagaagcaaataacttcctgtggcccttcaaattatcctctcga660caagttagaatgaagaaaaagaccaccaattttgtagaaggtggagatgctgacaacagg720gaagaccagatcaacaggcttattagaagaataaacatgcctaccacaattattttttgt780aatctagccagttaataaacagtacctgctctcaaattgaaaaaa825<210>2<211>3120<212>dna<213>homosapiens<400>2gcccgcttctgtgactccaccccttacggaaagtctatgggactctctgaaatgtatgag60tgatactgttagaaagcggcaagaaaatgaaaagaaaacgtggatgttttccatatttga120gttgatgcaggctggagacaacagctgccagagctgcaaggcagaacaccctgagaagtg180gaaccggaggatccaggcgcctgttgaagggataaatgagagccgtggcgtgtggatggg240actctttctgtcttccgtttggctgaagctccaaacgccaggagtaacccagtg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