一种富硒微生物其制备方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种富硒微生物其制备方法及应用。

背景技术：

硒(selenium)，元素符号se，位于元素周期表ⅵ主族，是生命体所必须的非金属微量元素。自然界中，硒主要以4种价态存在：还原态的硒化物(-2)、单质态的硒(0)和氧化态的亚硒酸盐(+4)及硒酸盐(+6)，其中又以亚硒酸盐(+4)毒性最强，以单质硒(0)的毒性最弱。

硒是动物和人所必需的微量元素之一。它与动物的生长发育、繁殖和疾病发生有着密切的关系。研究表明，硒具有抗氧化、提高机体免疫力和抗病力，调节机体代谢，影响动物和人的繁育机能，抗肿瘤，延缓衰老，拮抗有毒元素等多种功能。

哺乳动物体内大部分的硒以硒半胱氨酸的形式在相应功能蛋白中发挥生物活性作用。硒作为许多具有重要生物功能的硒酶的活性中心，与机体的抗氧化作用及免疫应答等功能密切相关。目前在哺乳动物至少已发现并分离到35种硒蛋白，其中功能比较明确的硒蛋白是谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)、脱碘酶(id)、硫氧还蛋白还原酶(tr)、硒磷酸化物合成酶(sps2)、精子线粒体膜硒蛋白(mcs)、精子dna结合硒蛋白、前列腺上皮硒蛋白、人淋巴细胞硒蛋白、硒蛋白p、硒蛋白w和一种存在于多种组织中的18ku硒蛋白。

正因为硒具有包括促进动物生长、提高动物免疫功能和抗病力及抗氧化能力在内的一系列重要的生物学功能，所以本领域中存在很多在食品、药品、保健品、饲料中补加硒的报道。当前广泛使用的补硒方法是添加亚硒酸钠。但由于亚硒酸钠利用率低，毒性大，而且对环境会造成潜在地污染，因此一些国家已经限制使用亚硒酸钠作为硒的营养补充剂。为了避免使用有机硒，本领域技术人员致力于开发能够将无机硒转化为有机硒的方案，提高含硒产品的安全性，并增强硒的使用效率。

益生菌(probiotics)，又名促生素、生菌剂、益生素、原生菌、微生态制剂、活菌制剂等，是指“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。益生菌具有以下几个方面的功能：防止肠道感染，维持肠道菌群平衡；提高免疫机能；控制血清胆固醇；抗肿瘤作用等。目前应用于动物的益生菌菌种已突破40余种，1989年美国食品与药品管理局与美国饲料学会发布了可以直接饲喂动物的益生菌菌种有41种。

由于大部分益生菌为厌氧菌或兼性厌氧菌，因此，其在有氧环境下的生存能力极差，这一特性给益生菌的储存和使用带来了极大的不便。因此，本领域技术人员致力于开发能够提高益生菌在有氧条件下的生存能力的技术方案。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种富硒微生物其制备方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种制备富硒微生物的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供含有硒的培养基，并且在所述培养基中培养微生物；和

(ii)分离步骤(i)中培养的微生物，从而制得所述富硒微生物；

其中，所述培养基中硒浓度c≥10μg/ml(如≥20μg/ml，优选地≥30μg/ml，更优选地≥50μg/ml，最优选地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在另一优选例中，所述培养基中硒浓度c≤1000μg/ml(优选地，≤800μg/ml)。

在另一优选例中，所述培养基为本领域中的基础培养基或改良培养基，如rcm培养基、mrs培养基、tpy培养基。

在另一优选例中，所述微生物为原核微生物、或真核微生物。

在另一优选例中，所述微生物为好氧微生物。

在另一优选例中，所述微生物为厌氧微生物，或兼性厌氧微生物。

在另一优选例中，所述微生物为原核微生物。

在另一优选例中，所述微生物为益生菌。

在另一优选例中，所述微生物选自下组中的一种或多种：双歧杆菌(bifidobacterium)、乳杆菌(lactobacillus)、大肠杆菌(e.coli)。

在另一优选例中，所述含有硒的培养基中，初始添加的含硒成分为无机硒，优选为h2seo3、和/或na2seo4。

在另一优选例中，所述步骤(i)中，包括步骤：

(i0)在不含外源硒的培养基中，培养微生物；

(i1)向步骤(i0)的培养液中，添加新鲜的含硒的培养基，连续或梯度增加培养基中硒浓度，从而使培养液中硒浓度达到并维持在(1±20％)c，并继续培养。

在另一优选例中，所述步骤(i1)中，培养液中的外源硒浓度从0提高到c的时间≥5天，优选地≥10天，更优选地≥15天，最优选地≥20天，比如可以为25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、或100天。

在另一优选例中，所述步骤(i)中，包括步骤：

(i0)在不含外源硒的培养基中，培养微生物；

(i1)向步骤(i0)的培养液中，连续添加新鲜的含硒浓度为c的培养基；在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到并维持在(1±20％)c，并继续培养。

在另一优选例中，所述方法中(i)中通过梯度增加的方式，逐步提高培养基中硒的含量。

在另一优选例中，所述步骤(i)中，包括步骤：

(i0)在不含硒的培养基中，培养微生物，所得培养物的体积为v；

(i1)第1次补料

向步骤(i0)的培养物中，连续添加新鲜的第一含硒培养基，其中所述第一含硒培养基中硒浓度为c1，添加速度为每8h～48h(优选为10h～24h)添加0.01v～1v(优选为0.05v～0.5v，更优选为0.1v～0.4v)，在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到约(1±20％)c1；

(i2)第2次补料

向第1次补料后获得的培养物中，连续添加新鲜的第二含硒培养基，其中所述第二含硒培养基中硒浓度为c2，添加速度为每8h～48h(优选为10h～24h)添加0.01v～1v(优选为0.05v～0.5v，更优选为0.1v～0.4v)，在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到约(1±20％)c2；

……

(in)第n次补料

向第n-1次补料后获得的培养物中，连续添加新鲜的第n含硒培养基，其中所述第n含硒培养基中硒浓度为cn，添加速度为每8h～48h(优选为10h～24h)添加0.01v～1v(优选为0.05v～0.5v，更优选为0.1v～0.4v)，在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到约(1±20％)cn,cn＝c；

其中，c1≤c2≤……≤cn，n为2～100的正整数(优选为3～50的正整数，更优选为4～30的正整数，最优选为5～20的正整数，如6、7、8、9、10)。

在另一优选例中，上一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度与下一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度的比值为1：1～10(优选为1：1.2～5，更优选为1：1.5～3)。

在另一优选例中，下一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度比上一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度高0～500μg/ml(优选地高10～200μg/ml，更优选地高20～100μg/ml，如高50μg/ml)。

在另一优选例中，c1为5～100μg/ml(优选地为10～50μg/ml，更优选地为15～30μg/ml)。

在另一优选例中，所述方法还包括任选地步骤：在每次补料过程中，或两次补料之间，稳定培养1h～24h，在此过程中既不补充培养液也不移除培养液。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(3)：对步骤(2)中获得所述富硒微生物进行干燥处理，获得富硒微生物的干菌体。

在另一优选例中，所述步骤(1)为厌氧培养。

在另一优选例中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≥5mg(如≥10mg，优选地≥15mg，更优选地≥20mg，最优选地≥30mg)。

在另一优选例中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≥50mg(优选地≥100mg，更优选地≥200mg)。

在另一优选例中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≤500mg。

在另一优选例中，所述富硒微生物对氧的耐受能力是同种野生类型微生物(在不含硒培养基中，以相同条件培养的同种微生物)对氧的耐受能力的至少10倍，优选地至少20倍，更优选地至少50倍。

在另一优选例中，所述富硒微生物对抗生素的耐受能力是同种野生类型微生物(在不含硒培养基中，以相同条件培养的同种微生物)对抗生素的耐受能力的至少2倍。

本发明的第二方面，提供了一种富硒微生物，所述富硒微生物中每克干菌体中的硒含量≥5mg(如≥10mg，优选地≥15mg，更优选地≥20mg，最优选地≥30mg)。

在另一优选例中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≥50mg(优选地≥100mg，更优选地≥200mg)。

在另一优选例中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≤500mg。

在另一优选例中，所述富硒微生物为通过权利要求1所述的方法制备而得

在另一优选例中，所述微生物为原核微生物、或真核微生物。

在另一优选例中，所述微生物为好氧微生物。

在另一优选例中，所述微生物为厌氧微生物，或兼性厌氧微生物。

在另一优选例中，所述微生物为原核微生物。

在另一优选例中，所述微生物为益生菌。

在另一优选例中，所述微生物选自下组中的一种或多种：双歧杆菌(bifidobacterium)、乳杆菌(lactobacillus)、大肠杆菌(e.coli)。

本发明的第三方面，提供了一种微生物制品，所述微生物制品从本发明第二方面所述的富硒微生物的发酵产物中制得。

在另一优选例中，所述微生物制品为有机硒制品。

在另一优选例中，所述微生物制品包括但不限于；含硒蛋白制品、含硒多糖制品、含硒核酸制品、含硒小分子化合物、或其组合。

在另一优选例中，所述微生物制品为硒纳米颗粒。

在另一优选例中，所述微生物制品为奶制品。

本发明的第四方面，提供了一种组合物，所述组合物中含至少一种本发明第二方面所述的富硒微生物和/或至少一种本发明第三方面所述的微生物制品。

在另一优选例中，所述组合物(冻干剂)中还包括保护剂，优选地所述保护剂包括选自下组的一种或多种；脱脂奶粉、海藻糖、和l-半胱氨酸(或其盐)。

在另一优选例中，所述组合物为试剂组合物、药物组合物、保健品组合物、食品组合物、饲料组合物或化妆品组合物。

在另一优选例中，所述组合物为菌剂。

在另一优选例中，所述菌剂为液体制剂、粉剂或片剂。

在另一优选例中，所述组合物为奶制品。

本发明的第五方面，提供了如本发明第二方面所述的富硒微生物、本发明第三方面所述的微生物制品或本发明第四方面所述的组合物的用途，用于提高微生物的抗逆性。

在另一优选例中，所述“抗逆性”包括但不限于：耐受自由基(如氧自由基)的能力、耐受氧的能力、耐受抗生素的能力、耐受高温的能力、耐受低温的能力、耐受酸碱度的能力、耐受紫外线的能力、耐受放射性射线的能力、或其组合。

在另一优选例中，所述用途还包括：用于提高厌氧或兼性厌氧微生物对氧的耐受能力。

本发明的第六方面，提供了一种提高微生物抗逆性的方法，包括步骤：

提供含有硒的培养基，并且在所述培养基中培养微生物。

在另一优选例中，所述培养基中硒浓度≥10μg/ml(如≥20μg/ml，优选地≥30μg/ml，更优选地≥50μg/ml，最优选地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在另一优选例中，所述培养基中硒浓度c≤1500μg/ml(优选地≤1000μg/ml，更优选地≤800μg/ml)。

在另一优选例中，所述方法包括本发明第一方面所述的制备富硒微生物的方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了根据本发明的富硒微生物对氧的耐受能力。

图2a显示了根据本发明的富硒微生物对头孢曲松的耐受性。

图2b显示了根据本发明的富硒微生物对万古霉素的耐受性。

图2c显示了根据本发明的富硒微生物对甲硝唑的耐受性。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种制备富硒微生物的方法，实验结果表明，根据本发明的方法制备的富硒微生物具有显著提高的抗逆性。本发明人在研究中意外地发现，微生物能够在含≥20μg/ml的硒的培养基中正常生长，而且所培养的微生物具有显著提高的抗逆性，在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

富硒微生物

本发明提供了一类富硒微生物，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≥5mg(如≥10mg，优选地≥15mg，更优选地≥20mg，最优选地≥30mg)。本发明中所述的硒含量，如无特别说明均指有机硒的含量。硒含量的测定方法采用本发明中的常规的或标准的测量方法即可。比如，文献《gb5009.93-2010食品中硒的测定》中记载的方法。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≥50mg(优选地≥100mg，更优选地≥200mg)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述富硒微生物每克干菌体中的硒含量≤500mg。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述的微生物为原核微生物、或真核微生物。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述微生物为原核微生物为好氧微生物。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述微生物为厌氧微生物，或兼性厌氧微生物。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述微生物为原核微生物。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述微生物为益生菌。

在另一优选例中，所述微生物选自下组中的一种或多种：双歧杆菌(bifidobacterium)、乳杆菌(lactobacillus)、大肠杆菌(e.coli)。

根据本发明的富硒微生物，具有显著提高的抗逆性。比如更具本发明的富硒微生物能够显著提高对抗生素的耐受能力。再比如更具本发明的富硒厌氧微生物(和/或兼性厌氧微生物)能够显著提高对氧的耐受能力。

益生菌

术语“益生菌”指在动物组织中，如人类胃肠和阴道中具有有益作用的细菌。最常用作益生菌的细菌是乳酸菌和双歧杆菌；然而，其他有益细菌，如嗜热链球菌(s.thermophilis)也可以是益生菌。在胃和小肠中增殖后，一些益生菌存活下来，并且在大肠内暂时生存，其中结肠发酵能力被正向修饰。见，例如，roberfroid，amjclinnutr71(suppl)：1682s-1687s(2000)。

本发明使用的益生菌可以是任何已知的益生菌，例如，嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)，保加利亚乳杆菌(l.bulgaricus)，干酪乳酸杆菌(l.casei)，拟干酪乳杆菌(l.paracasei)，发酵乳杆菌(l.fermentum)，植物乳杆菌(l.plantarum)，鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)，唾液乳杆菌(l.salivarius)，两歧双歧杆菌(b.bifidum)，婴儿双歧杆菌(b.infantis)，动物型双歧杆菌乳酸亚型(b.animalissubsp.lactis)，长双歧杆菌(b.longum)，嗜热链球菌(s.thermophilis)，粪肠球菌(e.faecalis)，和屎肠球菌(e.faecium)。

应当了解上述所列仅处于描述目的，而非关于益生菌限制性说明。对于此方面，任何额外的益生菌也可以用于本发明，例如，任何额外已知的和/或可用的乳酸菌或双歧杆菌。

在本发明一个优选地实施方式中，益生菌可以包括一类对宿主有益的活性微生物，其定植于人体或动物体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。

益生菌大多为厌氧微生物或兼性厌氧微生物，因此其对氧的耐受能力较差，给益生菌产品的生产和存储代带来了极大的挑战。

通过微生物(如益生菌)将无机硒转化为有机硒的尝试中，由于无机硒对微生物具有很大的毒性，因此转化率较低。本领域技术人员一般认为，大多数微生物仅能在硒含量在约3μg/ml的培养基中正常生长。

富硒微生物制备方法

本领域技术人员普遍认为，在高浓度硒(如≥5μg/ml)的培养条件下，微生物是很难生长的，主要表现在，当培养基中硒浓度过高时，发酵产物的生物量显著减少。本发明人经过深入的研究，意外地发现能够在高浓度硒(如≥10μg/ml)的培养条件下，进行微生物培养，而且产生的生物量稳定，不会显著降低。基于此，本发明提供了一种制备富硒微生物的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供含有硒(外源的人工添加的硒)的培养基，并且在所述培养基中培养微生物；和

(ii)分离步骤(i)中培养的微生物，从而制得所述富硒微生物；

其中，所述培养基中硒浓度c≥10μg/ml(如≥20μg/ml，优选地≥30μg/ml，更优选地≥50μg/ml，最优选地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在本发明的一个优选的实施方式中，可以通过梯度增加的方式，逐步提高培养基中硒的含量，从而使培养基中硒浓度达到c。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述方法包括步骤：

(i)提供含有硒的培养基，并且在所述培养基中培养微生物；和

(ii)分离步骤(i)中培养的微生物，从而制得所述富硒微生物；

其中，所述培养基中硒浓度c≥10μg/ml(如≥20μg/ml，优选地≥30μg/ml，更优选地≥50μg/ml，最优选地≥100μg/ml，如≥200μg/ml、≥500μg/ml)。

在另一优选例中，所述培养基中硒浓度c≤1000μg/ml(优选地，≤800μg/ml)。

在另一优选例中，所述含有硒的培养基中，初始添加的含硒成分为无机硒，优选为h2seo3、和/或na2seo4。

在另一优选例中，所述步骤(i)中，包括步骤：

(i0)在不含硒的培养基中，培养微生物；

(i1)向步骤(i0)的培养液中，连续添加新鲜的含硒浓度为c的培养基；在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到并维持在c，并继续培养。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述步骤(i)中，包括步骤：

(i0)在不含硒的培养基中，培养微生物，所得培养物的体积为v；

(i1)第1次补料

向步骤(i0)的培养物中，连续添加新鲜的第一含硒培养基，其中所述第一含硒培养基中硒浓度为c1，添加速度为每10h～24h添加0.01v～1v(优选为0.05v～0.5v，更优选为0.1v～0.4v)，在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到约c1；

(i2)第2次补料

向第1次补料后获得的培养物中，连续添加新鲜的第二含硒培养基，其中所述第二含硒培养基中硒浓度为c2，添加速度为每10h～24h添加0.01v～1v(优选为0.05v～0.5v，更优选为0.1v～0.4v)，在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到约c2；

……

(in)第n次补料

向第n-1次补料后获得的培养物中，连续添加新鲜的第n含硒培养基，其中所述第n含硒培养基中硒浓度为cn，添加速度为每10h～24h添加0.01v～1v(优选为0.05v～0.5v，更优选为0.1v～0.4v)，在维持培养液总体积约不变的情况下，移除部分培养液，从而使培养液中硒浓度达到约cn,cn＝c；

其中，c1≤c2≤……≤cn，n为2～100的正整数(优选为3～50的正整数，更优选为4～30的正整数，最优选为5～20的正整数，如6、7、8、9、10)。

在另一优选例中，上一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度与下一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度的比值为1：1～10(优选为1：1.2～5，更优选为1：1.5～3)。

在另一优选例中，下一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度比上一次补料中所用的含硒培养基中硒浓度高0～500μg/ml(优选地高10～200μg/ml，更优选地高20～100μg/ml，如高50μg/ml)。

在另一优选例中，所述方法还包括任选地步骤：在每次补料补料过程中，或两次补料之间，稳定培养1h～24h，在此过程中既不补充培养液也不移除培养液。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(3)：对步骤(2)中获得所述富硒微生物进行干燥处理，获得富硒微生物的干菌体。

在本发明中，术语“培养基”(medium)是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。不同培养基可根据实际需要，添加一些常规物质。如无特别说明，本发明的术语“培养基”即指本领域中的基础培养基。本领域技术人员可以根据本领域的常规技术知识根据所培养的微生物类型的选择合适的培养基。如可以参照文献《微生物学实验》(高等教育出版社,2007)选择培养基。

在本发明的较佳的实施方式中，微生物培养温度为20℃～45℃，优选为35℃～40℃。

在本发明的较佳的实施方式中，微生物培养的ph为3.0～9.0，优选为5.5～8.0，如7.5。

组合物和施用方法

本发明的组合物可包含根据本发明的富硒微生物。所述组合物可以为试剂组合物、药物组合物、保健品组合物、食品组合物、饲料组合物或化妆品组合物。

本发明的组合物可包括生理学上可接受的运载体。生理学上可接受的载体可以是食物产品或药物学载体。本文用术语“生理学上可接受”(或“药学上可接受”)指分子实体和组合物在恰当地给予动物或人时不产生不利、过敏性或其它不良反应。因此，本发明的组合物可包括含有本发明富硒微生物的食物产品。食物产品可包括根据本发明的富硒微生物，优选为活体微生物。食物产品可以是奶制品例如奶或基于奶的产品，例如使用含有奶的培养基制备根据本发明的富硒微生物或将本发明的富硒微生物添加到奶制品中。示范性奶源包括但不限于奶牛、绵羊、山羊、牦牛、水牛、马、驴、麋鹿和骆驼。

本文所述的组合物可与药学上可接受的运载体混合。本文所述的术语“药学上可接受的运载体”包括任何和全部可为药学上可接受物质用作介质的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。

因此，本发明还包括药物组合物，其包含作为活性成分的根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物，以及一种或多种药学上可接受的运载体。为了制备本发明的组合物，根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物一般与赋形剂混合，用赋形剂稀释或包裹在载体内，其形式可以是胶囊、片剂、囊袋、纸或其他容器。如果辅料用作稀释剂，它可以是固体、半固体或液体材料(例如生理盐水)，用作活性成分的运载体、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、药袋、扁胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(固体形式或在液体介质中)、软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液以及无菌包装的粉末剂。如本领域所知，稀释剂类型可根据所需的给药途径改变。得到的组合物可包含额外试剂，例如防腐剂。赋形剂或运载体根据给药模式和途径选择。合适的药物运载体以及药学配方中使用的一些药学必要物如本领域熟知的教科书《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences(e.w.martin)),，以及usp/nf(美国药典和国家配方)所述。合适的赋形剂的一些例子包括：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂还可包含：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如甲-和丙羟基苯甲酸酯；甜味剂；和调味剂。药物组合物可配制成在使用本领域已知的方法施给病人后，提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

可用标准技术制备用于本方法的药物学上可接受的组合物，包括其中根据本发明的富硒微生物及其产生的一种或多种代谢物被包裹在胶体中用于口腔传递的那些。根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物可经干燥或通过碾磨或粉碎压缩，置入用于口服给药的胶囊中。在一些实施方式中，根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物可与一种或多种辅料混合，例如与崩解剂、填充剂、助流剂或防腐剂混合。合适的胶囊包括硬壳胶囊或软壳胶囊。可用任何基于脂质或基于聚合物的胶体形成胶囊。用于胶体制备的示范性聚合物包括明胶、植物多糖或其衍生物，例如角叉菜胶和淀粉的改性形式和纤维素，如羟丙甲纤维素。可任选的，可在成胶剂溶液中加入其他成分，例如增塑剂，如甘油和/或山梨糖醇来降低胶囊的硬度，着色剂，防腐剂，崩解剂，润滑剂和表面处理剂。在一些实施方式中，胶囊不包含明胶。在其他实施方式中，胶囊不包含植物多糖或其衍生物。

不论其最初来源或其获得的方式，根据本发明的富硒微生物及其产生的一种或多种代谢物可根据其用途来配制。这些组合物可根据药学领域熟知的方法制备，可以各种途径施用，视需要局部或系统性治疗和要治疗的区域而定。给药可以是口服或外用(包括眼科和粘膜，包括鼻内、阴道内和直肠内给药)。在一些实施方式中，给药可以是经肺(例如通过粉末或气溶胶的吸入或吹气，包括通过喷雾器)；经气管；经鼻；表皮和透皮)或眼。眼部给药的方法包括外用(滴眼剂)、结膜下、眼周、或通过球导管来玻璃体内注射或引入，或手术置于结膜囊内的眼科插入物。胃肠外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输液；或颅内如鞘内或心室内给药。胃肠外给药可以单次推注剂量形式，或可以是通过连续灌注泵。外用给药的药物组合物和配方可包括透皮贴片、油膏剂、乳液、软膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体、粉末等。常规药学载体、水、粉末或油状基底、增稠剂等可能是必须或需要的。

组合物可配制成单位剂型，每种剂型包括每日剂量例如约0.005mg到2000mg的根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物。术语“单位剂量形式”指适合作为单一剂量用于人体对象或其他哺乳动物的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的活性成分和合适的药用赋形剂，所述预定量经计算能够产生所需的治疗效果。为制备固体组合物如片剂，将主要的活性成分与药用辅料混合，形成包含本发明化合物均质混合物的固体预制组合物。当这些预制混合物为均匀时，活性成分通常均匀地分散在组合物中，使得组分能容易地进一步分成等同的有效单位剂型，例如片剂、药丸和胶囊。然后将固态预制混合物分成上述类型的单位剂型，包含例如从0.005mg到约1000mg的根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物。

组合物可配制成单位剂型，每剂包含例如从约0.1mg到约1000mg、从约0.1mg到约40mg、从约0.1mg到约20mg、从约0.1mg到约10mg、从约0.2mg到约20mg、从约0.3mg到约15mg、从约0.4mg到约10mg、从约0.5mg到约1mg；从约0.5mg到约100mg、从约0.5mg到约50mg、从约0.5mg到约30mg,、从约0.5mg到约20mg、从约0.5mg到约10mg、从约0.5mg到约5mg；从约1mg到约50mg、从约1mg到约30mg、从约1mg到约20mg、从约1mg到约10mg、从约1mg到约5mg；从约5mg到约50mg、从约5mg到约20mg、从约5mg到约10mg；从约10mg到约100mg、从约20mg到约200mg、从约30mg到约150mg、从约40mg到约100mg、从约50mg到约100mg活性成分。

在一些实施方式中，可对本发明的片剂或丸剂进行包衣或另行复合，提供能够实现延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者包封前者。两种组分可由肠衣层分离，该层阻止胃内崩解并允许内部组分完整地通过十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠衣层或包衣，这些材料包括各种聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、十六醇和醋酸纤维素等材料的混合物。

可掺有本发明组合物用于口服给予或通过注射给予的液体剂型包括：水性溶液剂，适当调味的糖浆；水性或油性混悬剂；和含食用油的经调味乳剂，所述食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油，以及酏剂和类似的药用运载体。

在药物组合物中本发明组合物的比例或浓度可根据许多因素变化，包括剂量、化学性质(例如疏水性)、以及给药途径。例如根据本发明的富硒微生物或其产生的一种或多种代谢物可以包含约0.005mg-1000mg的胶囊提供，用于口服给药。

组合物可包含一种或多种根据本发明的富硒微生物的代谢物，即根据本发明的富硒微生物产生的任何物质，优选地代谢物中含有硒，硒的形态可以为有机的或无机的。代谢物可以由一种或多种基因编码，或可通过一种或多种基因产物的酶活性产生。代谢物包括例如小分子，如氨基酸、核苷、核苷酸以及较大的聚合物结构，例如多肽、碳水化合物、核酸、蛋白聚糖和脂类。代谢物可以是初级代谢物，例如直接参与正常细胞功能的代谢物，或次级代谢物，例如通常基础细胞功能不需要的代谢物。代谢物还可包括任何在初级或次级代谢物合成过程中产生的代谢中间物。中间物可包括但不限于emp、磷酸戊糖(戊糖-p)途径、ed途径、柠檬酸循环和氨基酸生物合成的中间物。

示范性的初级代谢物包括但不限于醇，例如乙醇、甲醇、丁醇；氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、瓜氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；核酸，例如5’鸟氨酸；抗氧化物，例如抗坏血酸；有机酸，例如乙酸、乳酸、柠檬酸；维生素，例如维生素b12；糖；脂肪酸。

代谢物也可以是次级代谢物。次级代谢物通常是基础细胞功能不必须的那些。次级代谢物变化广泛，示范性次级代谢物包括抗生素、激素、类黄酮、类萜、生物碱、苯丙素、苯衍生物、己醇衍生物、香豆素、茋类、氰醇、硫代葡糖酸盐、类固醇和皂素。

乳杆菌通常在发酵奶制品时产生如下代谢物：乳酸/乳酸酯、乙酸酯、乙醇、甲酸酯、乙醛、α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁烯二醇(丁二醇)。发酵可以是任何微生物导致或参与复杂有机物分解成简单物质的过程。

根据本发明的富硒微生物代谢物可包含在培养基、发酵物或培养上清液内。在一些实施方式中，代谢物可从培养物、发酵物或培养上清液中部分或基本分离出来。分离代谢物的方法根据具体代谢物的结构和化学性质而变。部分或基本分离的代谢物将保留功能活性。可用领域已知的标准方法分离和确定根据本发明的富硒微生物代谢物的性质。示范性方法包括例如稳定性分析，例如对热、ph、和/或酶活性的稳定性；层析分析，例如尺寸排阻层析、高效液相层析(hplc)、气相层析、薄层层析、离子交换层析、亲和力层析、反相层析、质谱等。

本发明的主要优点在于：

(1)首次披露了在含极高浓度的硒的培养基中培养微生物，能够提高微生物的抗逆性；

(2)采用本发明的制备高硒微生物的方法，培养的益生菌不仅含有硒而且能够显著提高益生菌在氧气环境下的存活率。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料

1.菌株

益生菌菌株

长双歧杆菌(拉丁名bifidobacteriumlongum，保藏号cicc6187)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection,cicc)。

2.培养基

rcm培养基的主要组成为牛肉膏，蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，淀粉，氯化钠，乙酸钠，l-半胱氨酸盐酸盐，各个成分的含量可以依据本领域的常规知识进行调整。

优选地，每10份rcm培养基按重量份数组成为：牛肉膏0.1份，蛋白胨0.05份，酵母粉0.03份，葡萄糖0.05份，淀粉0.01份，氯化钠0.05份，乙酸钠0.03份，l-半胱氨酸盐酸盐0.005份，ph6.8±0.2，其余为水。

实施例1使用连续培养得到适应高硒培养基的富硒益生菌

1.1培养方法1：

将长双歧杆菌接种于rcm液体培养基中，接种量体积比，即种子液与rcm液体培养基的体积比为1％，37±1℃厌氧培养8h，为一级种子，其中每10份rcm培养基按重量份数组成为：牛肉膏约0.1份，蛋白胨约0.05份，酵母粉约0.03份，葡萄糖约0.05份，淀粉约0.01份，氯化钠约0.05份，乙酸钠约0.03份，l-半胱氨酸盐酸盐约0.005份，其余为水。将一级种子液按接种量体积比5％接种于2l连续培养装置中，培养基装液量为50％，连续通氮气保持厌氧，37±1℃培养16h后，开始使用含有一定浓度硒(亚硒酸钠)的培养基进行连续补料(na2seo3中se质量分数为45.7％，即含100μg/ml的na2seo3培养基中折合se的含量为45.7μg/ml)，补料周期调控如下表：

第101天开始，放出500ml发酵液后，依然以硒浓度为365.6μg/ml(即亚硒酸钠浓度为800μg/ml)的培养基进行连续补料，补料速率为500ml/24h，从第102d起，每天放出500ml的发酵液离心浓缩，弃上清，用无菌的0.9％氯化钠溶液重悬菌泥再离心，至上清液无色澄清、离心后无红色颗粒物质集中沉淀在底部，倒出菌泥，小心勿将底部红色较紧实的菌泥倒出。将收集的菌泥与保护剂以重量比1比1混匀后进行真空冷冻干燥，制得活菌粉。其中保护剂按重量份数的组成为：脱脂奶粉5份，海藻糖2份，l-半胱氨酸盐酸盐0.01份。

在本实施例中，最终实现了长双歧杆菌在硒浓度365.6μg/ml(即亚硒酸钠浓度为800μg/ml)的条件下进行连续培养，并可持续收获菌体。在上述培养过程中，对放出的培养液进行检测，经活菌计数活菌量保持在约10⁸cfu/ml。在最高硒浓度(365.6μg/ml)的培养条件下，每升培养液中可收获干菌体2.1克，菌体干重中总硒含量为41280μg/g。

菌体中硒含量的检测方法参考文献《gb5009.93-2010食品中硒的测定》。

1.2培养方法2：

将长双歧杆菌接种于rcm液体培养基中，接种量体积比，即种子液与rcm液体培养基的体积比为5％，37±1℃厌氧培养14h，为一级种子，再对其扩大为二级种。将二级种子液按接种量体积比6％接种于7l连续培养装置中，装液量为85％，连续通氮气保持厌氧，并使用6mol/l氢氧化钠溶液维持发酵液ph在6.0，38±1℃培养12h后，开始使用含有一定浓度硒的培养基进行连续补料并开启自动出料，补料的同时以同样的速度出料，维持发酵液体积不变，补料周期调控如下表：

从第33天开始，补料继续进行，关闭自动出料，每天放出4l发酵液离心浓缩，弃上清，用无菌的0.9％氯化钠溶液重悬菌泥再离心，至上清液无色澄清、离心后无红色颗粒物质集中沉淀在底部，倒出菌泥，小心勿将底部红色较紧实的菌泥倒出。将收集的菌泥与保护剂以重量比1比2混匀后进行真空冷冻干燥，制得活菌粉。其中保护剂按重量份数的组成为：脱脂奶粉3份，海藻糖3份，l-半胱氨酸盐酸盐0.01份。

在本实施例中，最终能使长双歧杆菌在硒浓度为91.4μg/ml(即亚硒酸钠浓度为200μg/ml)的条件下进行连续培养，此时发酵液中长双歧杆菌活菌数维持在10⁸cfu/ml左右，并可持续收获菌体，每升培养液中可收获干菌体2.1克，菌体干重中总硒的量为24220μg/g。

实施例2：富硒培养益生菌抗氧化性实验

在实验组中，使用上述实施例1的1.1方法，在不同终浓度的含硒培养基中培养富硒长型双歧杆菌，在各终浓度条件下厌氧培养24h。各实验组培养基中硒终浓度(以培养基中添加的na2seo3浓度计)分别为：10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、200μg/ml。

对照组培养基中不添加硒，其它培养条件与实验组相同。

将上述厌氧培养24h后的培养物经离心、洗涤、重悬后转入有氧条件下在无硒新鲜培养基中37℃震荡培养，分别于0h，4h，24h后取样，梯度稀释涂布法进行活菌计数，计算有氧培养24h后菌体的存活率。依此方法比较无硒菌体及含硒菌体在氧气条件下的存活率。将对照组和各实验组在0h的活菌菌落数设为100％。

实验结果如图1所示，在24h后对照组存活率仅为0.336％。而添加了20μg/ml的na2seo3的实验组中，存活率达到了20.60％。添加了200μg/ml的na2seo3的实验组中，存活率达到了86.49％由上述结果可以看出，本发明的富硒益生菌抗氧化性显著增强。相比无硒益生菌抗氧化能力提高了约100倍以上。

实施例3富硒双歧杆菌在提高双岐杆菌对抗生素的耐受性

按照实施例1中的1.1方法，在不同终浓度的含硒培养基中培养富硒长型双歧杆菌，获得不同硒浓度条件下培养的菌体：

对照组：普通长双歧杆菌发酵菌体(培养基中未添加硒)

实验组1：培养基中亚硒酸钠终浓度为10μg/ml发酵所得的富硒菌体；

实验组2：培养基中亚硒酸钠终浓度为20μg/ml发酵所得的富硒菌体；

实验组3：培养基中亚硒酸钠终浓度为100μg/ml发酵所得的富硒菌体；

采用药敏纸片，分别测定四种菌体对不同抗生素的耐受程度，抗生素耐受性能力(r)计算公式如下：

r(％)＝(对照组菌体抑菌圈直径-实验组菌体抑菌圈直径)/(对照菌体抑菌圈直径)×100％

在同一抗生素的同一测试浓度下，r值越高说明菌体的抗生素耐受能力越强。对照组的抗生素耐受能力设为0。

本实施例中，分别检测了各组菌体对头孢曲松、万古霉素、甲硝唑的耐受能力。实验结果如图2所示。

图2a显示了对头孢曲松的耐受能力，实验结果表明，含硒浓度较高菌体具有显著提高的对头孢曲松的耐受能力。在32μg头孢曲松的载药量下，实验组3菌体的耐受能力达到了实验组1菌体的约12倍。

图2b显示了对万古霉素的耐受能力，实验结果表明，含硒浓度较高菌体具有显著提高的对万古霉素的耐受能力。在8μg万古霉素的载药量下，实验组3菌体的耐受能力达到了实验组1菌体的约5倍；在16μg万古霉素的载药量下，实验组1菌体没有表现出耐受能力，而实验组3菌体仍然具有显著的对万古霉素的耐受能力。

图2c显示了对甲硝唑的耐受能力，实验结果表明，含硒浓度较高菌体具有显著提高的对甲硝唑的耐受能力。在2μg甲硝唑的载药量下，实验组3菌体的耐受能力达到了实验组1菌体的约27倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。