本发明涉及用于皮肤组织工程学领域的生物检测方法，尤其是涉及一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法。
背景领域
皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。
虽然目前已有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”：①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管系统供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如：血管、毛发、汗腺等。
1997年，Asahara等（AsaharaT,etal.1997)首次发现人体外周血中存在能分化为ECs的前体细胞，将其命名为EPCs。EPCs不仅参与胚胎期的血管发生，而且在成体的血管生长发育中发挥重要作用。但EPCs主要存在于骨髓和外周血中，其来源和数量非常有限，获取的细胞纯度较低、增殖能力较差，能够成功分化成ECs的效率更低，而且多个部位穿刺取材对患者的损伤大（GehlingUM,etal.2000；CasamassimiA,etal.2007）。此外，ECs在血管的发生和形成过程中也演绎着非常重要的角色。然而，ECs自体取材来源有限，取材后极易引起桥血管的狭窄、闭塞，易加重对患者的损伤，且经过原代分离培养的血管内皮细胞极易老化，细胞周期短，增殖能力非常局限。这些都限制了ECs的直接获取和应用。遂考虑利用干细胞诱导的方法。
研究表明，毛囊干细胞（HairFollicleStemCells,HFSCs）是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点(CotsarelisG,etal.1990,CotsarelisG.2006)。体外培养的HFSCs表现出高克隆形成能力，具有非常高的再生潜能(RochatA,etal.1994)。它来源于皮肤、毛发，数量极其可观，且没有严重的并发症，无免疫原性，可供自体移植，是最容易获得的干细胞来源之一。Stelios等发表的最新研究结果证明，已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管系统。而血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。
技术实现要素：
本发明所需要解决的技术问题在于提供一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，为此，本发明提供如下技术方案：
一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，其特征在于，所述毛囊干细胞为大鼠毛囊干细胞，所述联合鉴定方法包括血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测、血管内皮细胞标记物的流式检测、血管内皮细胞的超微形态检测以及血管内皮细胞的体外功能检测；
首先，进行血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测，用于定性地表示内皮细胞标记物的表达位置，用于大致表达毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的情况；
其次，进行血管内皮细胞标记物的流式检测，用于定量地检测内皮细胞标记物的阳性率；
再次，进行血管内皮细胞的超微形态检测或体外功能检测，所述超微形态检测用于证明内皮细胞特有的W-P小体的存在，所述体外功能检测用于检测内皮细胞的功能。
进一步地，所述血管内皮细胞标记物为CD31和VE-cadherin。
进一步地，血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测包括如下步骤：
（1）诱导后的细胞用普通胰酶-PBS（1:3）稀释液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5min，1200转/5min离心；
（2）以1×105/孔浓度接种于事先用Matrix胶包被在37℃、5%CO2的培养箱中30min的玻片上，贴壁培养1d；
（3）吸去诱导培养基，用1XPBS洗3次；
（4）4%PFA-PBS于室温下固定10min；
（5）1XPBS洗3次，5min/次；
（6）1%BSA-PBS于室温下封闭30min；
（7）1XPBS洗2次，5min/次；
（8）孵化一抗，每滴15-25UL一抗稀释液，4℃过夜；
（9）1XPBS洗3次，5min/次；
（10）孵化二抗，避光1h；
（11）1XPBS洗3次，5min/次；
（12）DAPI染核，室温下10min；
（13）1XPBS洗2次，5min/次；
（14）封片，激光共聚焦下拍照。
进一步地，血管内皮细胞标记物的流式检测包括如下步骤：
（1）诱导后的细胞用普通胰酶-PBS稀释液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5min，1200转/5min离心，之后1XPBS洗2次；
（2）80%甲醇将细胞轻轻吹打成单悬液，室温固定5min，1200转/3min离心弃上清；
（3）0.1%PBST将细胞轻轻吹打成单悬液，室温静置20min，1200转/3min离心弃上清；
（4）5%BSA-PBS将细胞轻轻吹打成单悬液，上摇床封闭30min，1200转/3min离心弃上清；
（5）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；
（6）每管流式管100UL（1Xannexin-bindingbuffer)，1×106cell；
（7）加一抗，避光静置30min；
（8）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；
（9）加二抗，避光静置30min；
（10）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；
（11）1XPBS每管流式管500UL，上机流式检测。
进一步地，血管内皮细胞的超微形态检测为血管内皮细胞的透射电镜检测，所述透射电镜检测包括如下步骤：
（1）2.5%戊二酸-PBS溶液将消化离心所得的细胞固定4小时或过夜；
（2）0.1MPBS漂洗2次/10-15min；
（3）1%锇酸固定于4℃下1h；
（4）ddH2O漂洗2次/10-15min；
（5）2%醋酸铀固定/染色30min；
（6）50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水1次/10-15min；
（7）100%丙酮梯度脱水2次/10-20min；
（8）再经过渗透、包埋、聚合三个过程；
（9）超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜下观察W-P小体。
进一步地，血管内皮细胞的体外功能检测为血管内皮细胞的体外官腔形成实验，所述体外官腔形成实验包括如下步骤：
（1）从-20℃冰箱中取出Matrigel?基质胶放在4℃冰箱中过夜，使之成为液态；
（2）微量移液枪头和24孔板在冰上预冷；
（3）在24孔板中每孔注入100μLMatrigel?基质胶，小心摇动使之均匀分布于孔的各个部位，并避免产生气泡，所有操作必须在冰上进行；
（4）然后将24孔板放入37℃、5%CO2培养箱中30min；
（5）诱导后的细胞经过清洗、消化、收集，按每孔2×105/500μL接种于覆盖Matrigel?基质胶的24孔中，共设3个复孔；
（6）继续培养，分别在2h、4h、6h后，在100倍荧光显微镜下每孔随机选取3个视野进行拍照。
本发明中所涉及的CD31、VE-cadherin以及W-P小体的解释如下：
CD31
CD31为近年来发现的内皮细胞特异性标记物，又称为血小板/内皮细胞粘附分子（Platelet/EndothelialCellAdhesionMolecule-1，PECAM-1)，表达于血小板、单核细胞，尤其是内皮细胞连接处，主要存在于内皮细胞细胞膜以及胞浆内。可以运用流式细胞仪技术或免疫组化法检测CD31来分选纯化和鉴定内皮细胞。
VE-cadherin，又名CD144，是血管内皮的特异性钙黏蛋白，专一地表达在血管内皮细胞的表面，并集中分布于内皮细胞连接处，是黏附连接的主要黏附分子。大量研究表明，血管内皮钙黏蛋白对维持血管内皮细胞极性和血管的完整性是必不可少的。
小体
1964年，Weibel和Palade在血管内皮细胞中发现了一种长约1-6um的棒状细胞器，后来命名为Weibel-Palade小体（Weibel-Paladebody），简称W-P小体，是内皮细胞特有的一种细胞器。1982年，Wagner等人通过透射电镜观察到了W-P小体呈规则的与长轴平行的棒状结构，该结构宽约0.1~0.3um，长约0.5~5um，第八因子相关抗原vWF因子即由该小体分泌产生。由于仅存在于内皮细胞中，发现率只能达到30%，因此，被认为是内皮细胞最特异的形态学指标。
本发明所提供的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，所述联合鉴定方法包括血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测、血管内皮细胞标记物的流式检测、血管内皮细胞的超微形态检测以及血管内皮细胞的体外功能检测，血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测定性地表达血管内皮细胞的形成，血管内皮细胞标记物的流式检测定量地表达血管内皮细胞的形成，血管内皮细胞的超微形态检测显示血管内皮细胞最特异的形态学指标-W-P小体；血管内皮细胞的体外功能检测反映了血管内皮细胞的功能特征；通过联合运用这四种鉴定方法，从不同的角度反映了毛囊干细胞诱导为血管内皮细胞的有效性，系统且全方位地表征了所形成的血管内皮细胞的大致位置、存在数量、存在的形貌以及所具有的功能特征。
附图说明
图1为本发明所提供的原代大鼠毛囊干细胞从毛囊隆突部爬出，呈鸟巢状、上皮样细胞，排列紧密100×；
图2为本发明所提供的IV型胶原筛选纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞，呈典型的铺路石状100×；
图3为本发明所提供的P3代大鼠毛囊干细胞的流式细胞仪检测，分别为整合素β1（A）、整合素a6（B）、角蛋白15（C）的阳性率；
图4为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在诱导7天后，血管内皮细胞标记物CD31（A）和VE-cadherin（B）的免疫荧光染色结果；
图5为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在诱导7天后，血管内皮细胞标记物CD31（A）和VE-cadherin（B）的流式阳性率检测结果；
图6为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在诱导7天后，透射电镜下的血管内皮细胞特有结构W-P小体图；
图7为本发明所提供的纯化后的P3代大鼠毛囊干细胞在诱导7天后，荧光显微镜下的体外官腔形成实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
1.大鼠毛囊干细胞的分离、培养、纯化和鉴定
1.1大鼠毛囊干细胞的分离
取新生1周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出。在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次。然后用1%Ⅳ型胶原酶和1%Dispase酶混合液37℃消化90min后，用PBS洗两次。体视显微镜下用1ml注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1ml完全培养基。
所述完全培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μlL-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松。
1.2大鼠毛囊干细胞的培养
在37℃、5%CO2培养条件下培养1h，再缓缓加入2ml完全培养基继续培养3h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3ml完全培养基，之后每2-3d换液。图1
1.3大鼠毛囊干细胞的纯化
将100μg/mlIV型胶原按照3ml/100mmdish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。图2
1.4大鼠毛囊干细胞的鉴定
采用流式细胞仪鉴定：收集第3代细胞，调整细胞密度为1.0x106个/ml，装入1.5ml的EP管，1200转/3min离心弃上清。80%甲醇将细胞室温固定5min；0.1%PBST将细胞室温静置20min；5%BSA-PBS上摇床封闭30min；PBS洗1次，1200转/3min离心弃上清。每管流式管100UL（1Xannexin-bindingbuffer)，1×106cell。分别加入Integrinβ1-PE；Integrinα6、CK15、抗体避光孵育30min。再加入荧光素标记二抗避光孵育30min。PBS洗1次，1200转/3min离心弃上清。PBS每管流式管500UL，上机流式检测。图3
2.大鼠毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞
2.1诱导培养基的制备
将10mlFBS胎牛血清、1000μl青链霉素混合液、1000μlL-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、10ng/ml血管内皮细胞生长因子165、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、100μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松溶于88mlDMEM/F12培养液，定溶后用规格为0.22滤膜过滤，最终得到的诱导培养基备用。
2.2血管内皮细胞的诱导分化培养
待纯化后的毛囊干细胞在培养皿中达到60%~70%生长融合后，将上述完全培养基换成诱导培养基进行诱导，每2天换一次液。在37℃、5%CO2培养条件下继续培养。
2.3诱导分化后的血管内皮细胞的鉴定
采用细胞形态学观察记录，免疫荧光染色法、流式检测法、透射电镜对诱导后的细胞进行相关指标鉴定，最终得到了所测指标在7天时达到最佳。
血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测
（1）诱导7天后的细胞用普通胰酶-PBS（1:3）稀释液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5min，1200转/5min离心；
（2）以1×105/孔浓度接种于事先用Matrix胶包被在37℃、5%CO2的培养箱中30min的玻片上，贴壁培养1d；
（3）吸去诱导培养基，用1XPBS洗3次；
（4）4%PFA-PBS固定10min（室温）；
（5）1XPBS洗3次，5min/次；
（6）1%BSA-PBS封闭30min（室温）；
（7）1XPBS洗2次，5min/次；
（8）孵化一抗(1:100)，每滴15-25UL一抗稀释液，4℃过夜；
（9）1XPBS洗3次，5min/次；
（10）孵化二抗（1:500)，避光1h；
（11）1XPBS洗3次，5min/次；
（12）DAPI染核（1:2000)，室温10min；
（13）1XPBS洗2次，5min/次；
（14）封片，激光共聚焦下拍照。
结果表明，毛囊干细胞经过诱导7天后，血管内皮细胞特征性标记物CD31和VE-cadherin在细胞内阳性表达。
血管内皮细胞标记物的流式检测
（1）诱导7天后的细胞用普通胰酶-PBS（1:3）稀释液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5min，1200转/5min离心，之后1XPBS洗2次；
（2）80%甲醇将细胞轻轻吹打成单悬液，室温固定5min，1200转/3min离心弃上清；
（3）0.1%PBST将细胞轻轻吹打成单悬液，室温静置20min，1200转/3min离心弃上清；
（4）5%BSA-PBS将细胞轻轻吹打成单悬液，上摇床封闭30min，1200转/3min离心弃上清；
（5）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；
（6）每管流式管100UL（1Xannexin-bindingbuffer)，1×106cell；
（7）加一抗(比例参照抗体说明书)，避光静置30min；
（8）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；
（9）加二抗（比例参照抗体说明书），避光静置30min；
（10）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；
（11）1XPBS每管流式管500UL，上机流式检测。
结果表明，毛囊干细胞在诱导7天后，内皮细胞特征性标记物CD31和VE-cadherin的阳性率分别为65.1%和95.9%。
血管内皮细胞的透射电镜检测
（1）2.5%戊二酸-PBS冲液将消化离心所得的细胞固定4小时或过夜；
（2）0.1MPBS漂洗2次/10-15min；
（3）1%锇酸固定于4℃下1h；
（4）ddH2O漂洗2次/10-15min；
（5）2%醋酸铀固定/染色30min；
（6）50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水1次/10-15min；
（7）100%丙酮梯度脱水2次/10-20min；
（8）再经过渗透、包埋、聚合三个过程；
（9）超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜下观察W-P小体。
结果表明，毛囊干细胞在诱导7天后，在17000X透射电镜下，可以在胞浆内观察到黑色的棒状结构即内皮细胞特有的结构W-P小体，该小体一般宽约0.1-0.3um，长约0.5-5um。
血管内皮细胞的体外官腔形成实验
（1）从-20℃冰箱中取出Matrigel?基质胶放在4℃冰箱中过夜，使之成为液态；
（2）微量移液枪头和24孔板在冰上预冷；
（3）在24孔板中每孔注入100μLMatrigel?基质胶，小心摇动使之均匀分布于孔的各个部位，并避免产生气泡，所有操作必须在冰上进行；
（4）然后将24孔板放入37℃、5%CO2培养箱中30min；
（5）诱导后的细胞经过清洗、消化、收集，按每孔2×105/500μL接种于覆盖Matrigel?基质胶的24孔中，共设3个复孔；
（6）继续培养，分别在2h、4h、6h后，在100倍荧光显微镜下每孔随机选取3个视野进行拍照。
结果表明，毛囊干细胞在诱导7天后，体外官腔形成实验显示：2h后细胞内开始形成简单的连线；4h后细胞内形成的连线增加，并初步形成环状结构；6h后细胞形成较多的、完整的官腔样结构。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例而已，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。