利奈唑胺半抗原和完全抗原及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗生素的检测。具体地说，本发明涉及利奈唑胺半抗原、利用该半抗原获得的、获得的利奈唑胺单克隆抗体及其在荧光免疫层析法检测利奈唑胺中的应用。

背景技术：

抗菌药物自问世以来，在治愈并挽救了无数患者生命的同时，也因抗菌药物的不合理应用给患者或社会带来了诸多危害：耐药菌增加，各种药物产生耐药性的细菌有逐年增多的趋势。不合理用药是事关全人类健康的大事，是全世界所有国家普遍存在的问题。我国药物的不合理情况亦非常严重，据国家食品药品监督管理局通报，每年至少有20万人因用错药、用药不当而死亡，40％死于抗菌药物应用不合理。合理用药的问题一直是专业人士和公众关注的热点。国外对于抗菌药物合理使用的研究和管理起步较早,对于我国抗菌药物的合理使用起到了积极的推动作用。为提高抗菌药物的临床合理应用水平，保障患者用药安全及减少细菌耐药性，卫生部、国家中医药管理总局于2004年联合制订和发布了《抗菌药物临床应用指导原则》(简称《指导原则》)，这是我国第一部有关抗菌药物临床应用的技术指南与管理规范。

近年，由于临床抗菌药物广泛应用及不合理使用导致细菌的耐药问题的日益严重。为对抗迅速增长耐药菌，许多制药公司都积极研发新的抗菌药。以利奈唑胺(linezolid)为代表的噁唑烷酮类药物具有全新的结构和独特的作用机制，对大多数革兰阳性菌引起的感染具有较好的治疗作用。然而，临床上发现并非所有的患者给与相同的使用方案可以达到理想的效果。危重感染患者，如囊性纤维化患者、严重烧伤患者、重度肾功能衰竭患者、器官移植患者等由于病理生理条件存在影响药物体内分布和排泄的多种因素(如水肿、体液治疗和腹水等)，可能造成药物体内过程发生了一些改变。因此，对这些危重患者有必要进行血药浓度的监测，以确保药物的有效治疗，优化利奈唑胺的临床使用，减少耐药菌株的产生及不良反应的发生。要达到此目的需建立简便、快速、灵敏、可靠的人血中利奈唑胺定量检测方法，进行危重患者利奈唑胺使用后的血药浓度监测。

利奈唑胺的检测方法，目前国外文献报道有液质联用检测法、高效液相色谱法(hplc)。液质联用检测对仪器要求高，国内难以普及。国内有利奈唑胺hplc法的报道，但采用外标法，且方法的回收率低。虽然此方法特异性强、灵敏度高、精确，但是样本前处理操作步骤繁琐，成本高，再加上设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的筛选检测。免疫分析法(如酶联免疫法、胶体金法以及荧光免疫层析法)，由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便分析样本大等优点弥补了理化分析的不足，在小分子药物检测中起着越来越重要的作用。酶联免疫吸附测定法可同时检测多个样品，具有灵敏、特异性强等优点，但是不适用于现场及时检测。荧光免疫层析法操作简单、快速、无需大型检测仪器设备，更适用于现场及时检测，是快速检测发展的趋势。

影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与选择是产生特异性抗体和建立小分子药物含量快速检测技术最关键的步骤。

因此，本领域急需利奈唑胺的半抗原，通过该半抗原可以获得利奈唑胺的完全抗原，进而获得利奈唑胺的特异性抗体。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利奈唑胺的半抗原以及通过该半抗原获得的利奈唑胺的完全抗原。

本发明的另一目的是提供利奈唑胺的特异性抗体以及包含该抗体的检测试剂盒和利用该抗体检测利奈唑胺的方法。

在第一方面，本发明提供一种半抗原，所述半抗原具有式2所示的结构：

式中，r包括但不限于以下基团：-ch2-、-ο-、或它们的组合；

n＝2-8的整数。

在优选的实施方式中，r为-ch2-。

在优选的实施方式中，n＝4-6的整数；最优选4。

在第二方面，本发明提供一种完全抗原，所述完全抗原具有式3所示的结构：

其中，protein为蛋白质载体；和

r和n如本发明第一方面所述。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)及人工合成的多聚赖氨酸(pll)等。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(bsa)、或卵清蛋白(ova)。

在第三方面，本发明提供一种制备本发明第一方面所述半抗原的方法，所述方法包括步骤：

(a)使得利奈唑胺脱乙酰得到脱乙酰利奈唑胺

(b)将脱乙酰利奈唑胺与二酸类化合物、或者带酯基环烷二酮类化合物反应得到本发明第一方面所述的半抗原。

在优选的实施方式中，步骤(b)的条件如下：反应温度为16～30℃，优选25～28℃，更优选25℃；反应时间为20～50分钟，优选30～40分钟，更优选35分钟；反应溶剂为甲醇、乙醇、thf、dmf、二氯甲烷、四氢呋喃，优选甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃，更优选二氯甲烷/四氢呋喃。

在第四方面，本发明提供一种制备本发明第二方面所述完全抗原的方法，所述方法包括步骤：

将本发明第一方面所述的半抗原与蛋白质载体连接，以制得本发明第二方面所述的完全抗原。

在优选的实施方式中，将得到的半抗原与蛋白质载体连接的条件如下：反应温度为20-28℃，优选23-28℃，更优选25℃；反应ph为7.0-8.0，优选7.2-7.6，更优选7.5；反应时间为1-6小时，优选3-4小时，更优选3小时。

在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)及人工合成的多聚赖氨酸(pll)等。

在一优选例中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(bsa)、或卵清蛋白(ova)。

在第五方面，本发明提供一种本发明第一方面所述半抗原或第二方面所述完全抗原的用途，用于制备利奈唑胺的特异性单克隆抗体。

在第六方面，本发明提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于利奈唑胺。

在具体的实施方式中，所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(cctcc，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为cctccno:c201614；分类命名为：杂交瘤细胞株lh3a8c2。

在优选的实施方式中，所述的单克隆抗体检测利奈唑胺的灵敏度为0.28ug/ml。

在另一优选的实施方式中，所述的单克隆抗体不结合其它抗生素。

在另一优选的实施方式中，所述的其它抗生素是盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、万古霉素、替考拉宁、咪达唑仑、氟康唑、呋塞米、地塞米松磷酸或奥美拉唑。

在第七方面，本发明提供一种产生本发明第六方面所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系是由中国典型培养物保藏中心(cctcc，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为cctccno:c201614的小鼠杂交瘤细胞系；分类命名为：杂交瘤细胞株lh3a8c2。

在第八方面，本发明提供本发明第六方面所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测样品中利奈唑胺的试剂、检测卡或试剂盒。

在优选的实施方式中，所述样品是生物样品，优选血液样品。

在第九方面，本发明提供一种检测生物样品中是否存在利奈唑胺的方法，所述方法包括步骤：

(a)将所述生物样品与本发明第六方面所述的单克隆抗体接触；

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在利奈唑胺。

在优选的实施方式中，所述单克隆抗体带有可检测标记物；优选地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

在优选的实施方式中，所述检测方法为荧光检测法。

在优选的实施方式中，所述检测方法是体外非诊断性的。

在第十方面，本发明提供一种检测利奈唑胺的荧光免疫层析检测卡，所述检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明第二方面所述的完全抗原，质控带上包被有兔抗体igg。

在优选的实施方式中，所述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。

在优选的实施方式中，所述上盖上还设有产品编号区；条形码识别区。

在优选的实施方式中，所述基片是深色硬质基片；优选黑色pvc基片。

在优选的实施方式中，所述检测部件是硝酸纤维素膜。

在优选的实施方式中，所述加样部件是玻璃纤维。

在优选的实施方式中，所述吸液部件是吸水纸。

在第十一方面，本发明提供一种检测利奈唑胺的检测试剂盒，所述试剂盒装有：

(a)本发明第十方面所述的利奈唑胺荧光免疫层析检测卡；和

(b)与本发明第十方面所述的利奈唑胺荧光免疫层析检测卡配套的利奈唑胺检测分析液；和

(c)利用所述利奈唑胺检测试剂盒检测利奈唑胺的使用说明书；

其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的本发明第六方面所述的单克隆抗体和抗兔igg抗体的检测分析液。

在优选的实施方式中，所述检测分析液中的标记用荧光染料包括但不限于，fitc(fluorescein)、alexafluor647、cftm647、tritc(rhodamine)和calfluor(r)red610等。

在优选的实施方式中，所述检测分析液的溶剂部分是含有bsa的磷酸缓冲液。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了利奈唑胺衍生物的¹h-nmr鉴定结果；

图2显示了利奈唑胺免疫原和包被原的紫外扫描图谱；

图3显示了利奈唑胺荧光免疫层析检测卡的结构的示意图；其中：

图3a显示了未装塑料卡的试纸卡结构；1：黑色pvc基片；2：吸水纸：3：硝酸纤维素膜；4：玻璃纤维；5：质控线带(c线)；6：检测线带(t线)；

图3b显示了带有塑料卡盒的利奈唑胺检测卡结构；1’：下盖；2’：上盖；3’：加样窗口；4’：玻璃纤维；5’：检测窗口；6’：质控线带(c线)；7’：检测线带(t线)；8’：硝酸纤维素膜；9’：利奈唑胺项目标志(lin)；10’：条形码识别区域；

图4显示了利奈唑胺荧光免疫层析检测的标准曲线图谱；

图5显示了利奈唑胺elisa检测的标准曲线图谱。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究合成了作为半抗原的利奈唑胺衍生物，并将其与适当的蛋白质载体连接产生了完全抗原，以此为免疫原免疫balb/c小鼠，将其脾细胞与小鼠骨髓瘤sp20细胞融合，获得特异性分泌抗利奈唑胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而制备并纯化得到了利奈唑胺单克隆抗体，随后利用所述完全抗原和利奈唑胺抗体制备了具有高灵敏度和特异性的利奈唑胺免疫检测卡。在此基础上，完成了本发明。

半抗原

某些小分子物质，例如利奈唑胺的分子量不大，单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

因此，为了制备利奈唑胺的完全抗原，本发明人对利奈唑胺进行了衍生化，从而制得了本发明的半抗原。本文所用的术语，“半抗原”、“利奈唑胺半抗原”或“利奈唑胺衍生物”均是指经衍生得到的具有以下结构式3的利奈唑胺衍生物：

式中，r包括但不限于以下基团：-ch2-、-ο-、或它们的组合；

n＝2-8的整数。

在优选的实施方式中，r为-ch2-。在优选的实施方式中，n＝4-6的整数；最优选n＝4。

本发明的利奈唑胺半抗原可采用如下所示的方法制备：

(a)使得利奈唑胺脱乙酰得到脱乙酰利奈唑胺

(b)将脱乙酰利奈唑胺与二酸类化合物、或者带酯基环烷二酮类化合物反应得到本发明的半抗原。

在优选的实施方式中，步骤(b)的条件如下：反应温度为16～30℃，优选25～28℃，更优选25℃；反应时间为20～50分钟，优选30～40分钟，更优选35分钟；反应溶剂为甲醇、乙醇、thf、dmf、二氯甲烷、四氢呋喃，优选甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃，更优选二氯甲烷/四氢呋喃。

在具体的实施方式中，利奈唑胺半抗原的制备如以下反应式所示：

完全抗原

具有免疫原性与免疫反应性的物质，称为完全抗原(completeantigen)，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素、动物血清等。完全抗原既能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，还能与其在体内、体外发生特异性结合反应。

通常，半抗原需要和大分子如牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)或血蓝蛋白(klh)或以共价键方式偶联，成为既具有免疫反应性，又具有免疫原性的完全抗原。

本文所用的术语，“完全抗原”是指本发明的利奈唑胺半抗原与适当的蛋白质载体结合后的产物。本文所用的术语，“蛋白质载体”是指任何在免疫学上可接受的用于形成完全抗原的蛋白质，包括但不限于：牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(klh)、人血清白蛋白(hsa)及人工合成的多聚赖氨酸(pll)等，优选牛血清白蛋白(bsa)、或卵清蛋白(ova)。

本发明的利奈唑胺完全抗原的结构如式3所示：

其中，protein为蛋白质载体，本发明中优选为牛血清白蛋白(bsa)或卵清蛋白(ova)；与蛋白质载体共价交联的部分为式2所示的利奈唑胺衍生物；r和n如上文所述。

在如上所述制备得到利奈唑胺半抗原的基础上，可以进一步将得到的半抗原与蛋白质载体连接，从而制备得到本发明的完全抗原。

在优选的实施方式中，将得到的半抗原与蛋白质载体连接的条件如下：反应温度为20-28℃，优选23-28℃，更优选25℃；反应ph为7.0-8.0，优选7.2-7.6，更优选7.5；反应时间为1-6小时，优选3-4小时，更优选3小时。

单克隆抗体的制备

本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，除了可能存在少量可能的自发突变，组成该群体的抗体个体都相同。因此，修饰语“单克隆的”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明完全抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见kohler等人,nature256；495,1975；kohler等人,eur.j.immunol.6:511,1976；kohler等人,eur.j.immunol.6:292,1976；hammerling等人,inmonoclonalantibodiesandtcellhybridomas,elsevier,n.y.,1981)或可用重组dna法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(hat培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自salkinstitutecelldistributioncenter，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及sp-2、nz0或x63-ag8-653细胞(可购自americantypeculturecollection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[kozbor，j.immunol.，133：3001(1984)；brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(monoclonalantibodiesproductiontechniquesandapplications)，51-63页(marceldekker，inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(elisa)或放射免疫分析(ria)。表达抗体的细胞的位置可用facs进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(goding，单克隆抗体(monoclonalantibodies)：原则和实践(principlesandpractice)，academicpress(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，dmem或rpmi-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白a-琼脂糖法(proteina-sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系已于2016年02月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc，中国，武汉，武汉大学)，保藏号为cctccno:c201614；分类命名为：杂交瘤细胞株lh3a8c2。

在具体的实施方式中，本发明的单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

在具体的实施方式中，本发明的单克隆抗体检测利奈唑胺的灵敏度为0.28ug/ml。本发明的单克隆抗体与利奈唑胺完全抗原的载体蛋白，例如bsa或ova没有交叉反应。进一步地，本发明的单克隆抗体也不结合其它抗生素，包括但不限于盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、万古霉素、替考拉宁、咪达唑仑、氟康唑、呋塞米、地塞米松磷酸或奥美拉唑。

检测试剂盒

本发明的检测试剂盒是指含有本发明的单克隆抗体并可用于利奈唑胺检测的试剂盒。所述的试剂盒可根据需要包括容器、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等。

本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如检测卡、含有各种测试所需试剂的测试盒等。实施例中采用检测卡为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于检测卡。

在具体的实施方式中，本发明的检测利奈唑胺的荧光免疫层析检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；和加样部件；其中，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明的完全抗原，质控带上包被有兔抗体igg。

在优选的实施方式中，本发明的利奈唑胺荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。在上盖上还可设有产品编号区；条形码识别区。所述基片可以是深色硬质基片；优选黑色pvc基片。所述检测部件可以是硝酸纤维素膜。所述加样部件可以是玻璃纤维。所述吸液部件可以是吸水纸。

本文所述的“部分重叠的方式固定”表示相邻的两个部件形成一定的重叠区域，而非一个部件完全包含在另一部件中的完全重叠，并且该两部件通过该重叠区域而固定。固定的方式可由本领域技术人员自主选择，例如通过粘合等方式。

在上述检测卡的基础上，本发明还提供一种检测利奈唑胺的检测试剂盒，其装有：

(a)上述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡；

(b)与所述利奈唑胺荧光免疫层析检测卡配套的利奈唑胺检测分析液；和

(c)利用所述利奈唑胺检测试剂盒检测利奈唑胺的使用说明书；

其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的本发明的单克隆抗体和抗兔igg抗体的检测分析液。

本领域技术人员可根据需要自主选择荧光标记，包括但不限于fitc(fluorescein)、alexafluor647、cftm647、tritc(rhodamine)和calfluor(r)red610等。

在优选的实施方式中，所述检测分析液的溶剂部分是含有bsa的磷酸缓冲液。

利奈唑胺半抗原以及人工抗原的免疫检测应用

本发明的利奈唑胺半抗原和人工抗原应用于抗体制备，所述抗体应为单克隆抗体或者多克隆抗体；本发明的利奈唑胺半抗原和人工抗原应用以及利用利奈唑胺人工抗原制备的相应抗体应用于各种检测利奈唑胺含量的免疫学检测领域，包括但不限于elisa、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测领域。

上述所述的“利奈唑胺半抗原和人工抗原应用于抗体制备”是指利用本发明的利奈唑胺半抗原衍生物制人工抗原，利用人工抗原去免疫实验动物，制备抗利奈唑胺多克隆抗体和单克隆抗体；所述实验动物不应该理解为具体实施方式中单纯的小鼠，应该包括但不限于：小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、马、驴、鸡、狗等实验动物。

上述所述的“利奈唑胺半抗原和人工抗原应用于测定利奈唑胺免疫检测领域”是指利用由利奈唑胺半抗原制备人的工抗原，及由利奈唑胺人工抗原制备得到的相应抗体作免疫检测原料建立各种检测利奈唑胺含量的免疫检测方法。所述免疫检测领域包括但不限于elisa、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测方法；所述检测利奈唑胺免疫检测方法不仅仅指定量检测，还包括半定量以及各中基于免疫学检测的定性检测方法。

在具体实施方式中，本发明以免疫小鼠制备特异性单克隆抗体为例，以及以elisa和荧光免疫层析法为具体实例阐述了利奈唑胺半抗原以及人工抗原在利奈唑胺免疫学检测中的应用。

本发明的优点：

1.本发明首次公开了一种利奈唑胺半抗原衍生物通式结构，以及该半抗原衍生物衍生化方法，即：以现有的脱乙酰利奈唑胺为原料，在其氨基端添加多碳链羧基完成衍生化，最大限度的保留了利奈唑胺的核心结构，用于制备特异性的利奈唑胺抗体；

2.本发明首次公开了一种利奈唑胺完全(人工)抗原的结构以及其制备方法；

3.本发明首次公开了利奈唑胺半抗原以及人工抗原在利奈唑胺抗体制备和免疫学检测领域的应用，为推进临床上利奈唑胺血药浓度检测提供了可靠地方法；

4.本发明的单克隆抗体可高灵敏度地检测利奈唑胺，且不与其它抗生素发生结合；和

5.本发明的利奈唑胺检测试剂盒可简单、快捷地现场检测利奈唑胺。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例.

实施例1.利奈唑胺半抗原的制备

以化合物脱乙酰利奈唑胺(cas：168828-90-8)(化合物1)为原料，通过一步反应制备，其制备路径如下所示：

在室温条件下，将5-(氨甲基)-3-(3-氟-4-吗啉苯基)噁唑烷酮化合物(1)(800mg，2.71mmol)在二氯甲烷/四氢呋喃(30ml/15ml)中溶解，向其中加入用二氯甲烷/四氢呋喃(5ml/2ml)溶解的环己烷-2,7-二酮化合物(2)。将此混合物在室温条件下搅拌三十分钟，然后向此混合液中加入1mol/l的氢氧化钠溶液(20ml),继续搅拌五分钟。此反应混合液用二氯甲烷(15ml×3)洗涤之后，去除有机相，用浓盐酸将水相ph值调到5。将沉淀物过滤收集，用冰水洗，最后真空干燥得6-((3-氟-4-吗啉苯基)-2-氧唑烷基)氨甲基)-6-含氧正己酸(即：利奈唑胺衍生物)(490mg，收率：47％)白色固体。经过¹h-nmr鉴定，其结果如图1所示。

实施例2.利奈唑胺完全抗原(免疫原和包被原)的制备

将实施例1所得的利奈唑胺衍生物(半抗原)分别与牛血清白蛋白(bsa)和卵清蛋白(ova)通过碳化亚胺法偶联。具体偶联方法如下：

称取40mg利奈唑胺衍生化合物，溶解于2mldmf中，形成20mg/ml的终浓度，取其中90μl与6μledc(100mg/ml)混合，再加入10ulnhs(50mg/ml)，均匀混合后在搅拌条件下反应15～60mins。

将上述反应混合液离心(1600rmp)后加入到1ml的6mg/mlbsa溶液中(或加入1ml的4.5mg/mlova溶液中)在室温搅拌条件下反应1～5h后，用磷酸缓冲液透析4次，12h换一次液。收集透析液，用美国伯乐(bio-rad)公司的quickstartbradfordproteinassaykit测定免疫原和包被原的浓度分别为5.1mg/ml和4.3mg/ml。得到的利奈唑胺人工抗原(免疫原和包被原)结构式如下所示，其中“protein”为bsa(牛血清蛋白)或ova(卵清蛋白)

利奈唑胺人工抗原(免疫原和包被原)用紫外扫描波峰结果比较如图2所示，偶联物的波峰与bsa以及ova波峰有区别说明偶联成功。

实施例3.利用利奈唑胺完全抗原制备单克隆抗体

1.免疫动物

将实施例2得到的利奈唑胺免疫原稀释成0.2mg/ml，取500ul免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合后，乳化完全，免疫balb/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，在小鼠背部皮下及足部进行注射免疫。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后用不完全弗氏佐剂。第四次免疫后一周眼眶取血，分离血清，测抗利奈唑胺抗体的效价。经elisa检测，小鼠四次免疫后的抗体效价为1:256,000。

2.细胞融合和筛选

四次免疫后的小鼠经腹腔注射约100μg免疫原再次加强免疫，3天后，取该小鼠脾脏用于融合。取sp2/0细胞(南京军事医学科学院)与脾细胞混合，加入无血清培养液(hyclonesh30022.018dmem(highglucose))，离心(1500rpm，3min)，取沉淀细胞，逐滴加入1ml50％聚乙二醇4000，静置90秒。然后逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5min。融合后细胞悬液离心(1000rpm，3min)，用完全培养液，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，每孔2×10⁴/ml骨髓瘤细胞。置37℃，5％co2培养箱内培养两天，加入2×hat的完全培养液，使孔内终浓度为1×hat。待杂交瘤细胞集落长至孔底1/10-1/5面积的时候，即用elisa方法筛选融合细胞抗体阳性孔。

3.腹水制备和抗体纯化

取balb/c小鼠，于腹腔注射0.5ml石蜡油，7天后，腹腔注射0.5ml1×10⁶阳性杂交瘤细胞。观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。利用亲和层析技术(proteingresin亲和纯化)纯化得到高纯度的单克隆抗体，蛋白量为4mg。

实施例4.利用利奈唑胺完全抗原进行免疫检测

1.荧光免疫层析检测

1)检测分析液制备

a.分别荧光标记实施例3得到的单克隆抗体以及抗兔igg抗体(杭州启泰生物技术有限公司)；

b.用含有bsa的磷酸缓冲液将荧光标记后的抗体稀释配制成检测分析液。

2)利奈唑胺荧光免疫层析试纸卡的制备

a.用包被缓冲液(磷酸缓冲液)分别将制备得到的利奈唑胺包被原(lin-ova)和兔抗体igg稀释到适当浓度(0.4-3.0mg/ml)。在25±5℃的温度下，将稀释后的lin-ova和兔抗体igg均匀喷于硝酸纤维膜上(分别形成检测线和质控线)，在12％-30％的湿度条件下烘干5～8小时左右，干燥保存备用；

b.在黑色pvc基片上分别依次粘贴步骤a所得到的包被硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水纸形成检测卡(如图3a所示)，视需要切割成适当宽度。

c.将步骤b所得到的检测卡装入卡盒的下盖中，盖上上盖，形成完整的带卡盒检测卡(如图3b所示)。

3)检测

取10μl稀释后的样本与100μl的检测分析液均匀混合，取100μl加入检测卡的加样窗口，反应5～10min后，在fcr荧光免疫分析仪(湖州海创生物科技有限公司)检测，根据样本的t线信号值与c线信号比值(t/c值)与内置的标准曲线比对显示检测结果。

4)利奈唑胺荧光免疫层析检测试纸卡检测原理

采用竞争法检测，样品中的利奈唑胺抗原和检测线(t线)上的利奈唑胺抗原(包被原)竞争结合检测分析液中的荧光标记的抗利奈唑胺抗体。当样本中抗原浓度很低时，检测线上结合的荧光抗体增多，进而检测线上的荧光信号就强，因此，检测线(t线)荧光信号与质控线(c线)上荧光信号的比值(t/c值)就大；反之，样本中利奈唑胺抗原浓度较高时，t/c值就很小。所以，样本中利奈唑胺含量越高，t/c值越低。根据t/c值与内置标准曲线比较并显示检测结果。

5)荧光免疫层析法检测利奈唑胺的灵敏度以及标准曲线

将空白血清中添加利奈唑胺标准品，配置成0ug/ml、0.39ug/ml、0.78ug/ml、1.56ug/ml、3.125ug/ml、6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml系列浓度样品。将上述系列浓度样品按照上述检测的步骤进行检测，每个样品重复3次，检测的实验结果如表1所示，根据表1数据以浓度为横坐标，t/c值为纵坐标绘制标准曲线(logit-log直线回归)如图4所示。图4中曲线对应的方程如表2所示，计算得ic50＝4.59ug/ml。

表1荧光免疫层析法检测不同浓度利奈唑胺样本

表2抑制曲线所对应的方程(logit-log直线回归)

将0ug/ml样品重复检测10次，分别计算其t/c值的平均值(x)、标准偏差(sd)以及精密度(cv值)。灵敏度的计算方式为，x-2*sd的t/c值在图4的标准曲线里所对应的利奈唑胺浓度值。

表3.荧光免疫层析法重复检测0ug/ml利奈唑胺样本结果

将表3数据中的x-2*sd的t/c值作为y值代入图4标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.56ug/ml，即灵敏度为0.56ug/ml。

6)荧光免疫层析法检测利奈唑胺的精密度以及准确度偏差

分别利用已经建立的利奈唑胺检测体系检测浓度为3.125ug/ml和25ug/ml的利奈唑胺标准品，各重复检测15次，计算检测高低浓度利奈唑胺的精密度(cv)以及检测的准确性。表4和5分别是检测利奈唑胺高低浓度的精密度以及准确性结果，其结果显示高低浓度精密度均小于10％，准确度偏差均小于5％。

表4.荧光免疫层析法重复检测25ug/ml利奈唑胺标准品结果

表5.荧光免疫层析法重复检测3.125ug/ml利奈唑胺标准品结果

7)利奈唑胺荧光免疫层析检测体系的交叉反应

将9种常见的临床用相关药物分别用空白混合血清配置成不同梯度浓度样本，进行荧光免疫层析检测，计算其ic50与利奈唑胺的ic50值比较计算交叉反应率。计算公式：交叉反应率＝(ic50利奈唑胺/ic50临床用相关药物)％，交叉反应率结果如表6所示：

表6.荧光免疫层析检测临床用相关药物的交叉反应结果

2.elisa定量检测利奈唑胺

1)elisa检测标准曲线建立

将制备好的利奈唑胺包被原(lin-ova)用碳酸缓冲液(0.05m，ph9.6)稀释到4-10ug/ml，包被96孔板，100ul/孔，4℃过夜，5％脱脂奶粉封闭3h，200ul/孔。洗涤3次，5min/次；将空白血清中添加利奈唑胺标准品，配置成0ug/ml、0.39ug/ml、0.78ug/ml、1.56ug/ml、3.125ug/ml、6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml系列浓度样品。分别将不同浓度的利奈唑胺50ul与利奈唑胺抗体50ul(稀释200倍后)混合加入微孔中，37度孵育1h；洗涤3次后，加入hrp标记的二抗孵育1h(100ul/孔)后，洗涤3次，加入显色液，室温15min，加终止液读数(450nm)。表8显示了elisa检测的标准曲线吸光值结果。

表8.elisa法检测不同浓度利奈唑胺

以表8中的数据为基础，利用logit-log直线回归法绘制表转曲线如图5所示。图5中曲线对应的方程如表9所示，r2＝0.99450。

表9.elisa检测抑制曲线所对应的方程(logit-log直线回归)

2)elisa检测利奈唑胺的灵敏度

将0ug/ml样品重复检测10次，分别计算其elisa吸光值的平均值(x)、标准偏差(sd)以及精密度(cv值)。灵敏度的计算方式为，x-2*sd的t/c值在图5的标准曲线里所对应的利奈唑胺浓度值。

表10.elisa法重复检测0ug/ml利奈唑胺样本结果

将表10数据中的x-2*sd的吸光值作为y值代入图5标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.28ug/ml，即灵敏度为0.28ug/ml。

3)elisa法检测利奈唑胺的精密度以及准确度偏差

分别利用已经建立的elisa检测体系检测浓度为3.125ug/ml和25ug/ml的利奈唑胺标准品，各重复检测15次，计算检测高低浓度利奈唑胺的精密度(cv)以及检测的准确度偏差。表11和12分别是检测利奈唑胺高低浓度的精密度以及准确性结果，其结果显示高低浓度精密度均小于8％，准确度偏差均小于5％。

表11.elisa法重复检测25ug/ml利奈唑胺标准品的结果

表12.elisa法重复检测3.125ug/ml利奈唑胺标准品的结果

4)elisa法检测利奈唑胺的交叉反应

交叉反应结果与荧光免疫层析法检测利奈唑胺的结果一致。

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