技术领域本发明属于分子生物学技术发明领域，特别是设计一种基于电泳分析的多重pcr技术能同时筛查七种人乳头瘤病毒。
背景技术：
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)属于乳多空病毒科(papovaviridae)乳头瘤病毒属，hpv主要通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。hpv不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣以及粘膜生殖道上皮增生性损伤。持续hpv感染是导致宫颈癌和一些生殖器瘤样病变的主要原因。
hpv呈球形，无包膜，双链dna病毒。核壳呈对称20面体，由72个壳粒组成，壳粒由l1、l2两种衣壳蛋白组成。hpv基因组长8,000bp，编码8个主要开放读码框架(openreadingframes，orf)，分为3个功能区，即早期转录区(e区)，晚期转录区(l区)与长控制区(longcontrolregion，lcr)。
目前已有hpv基因型别100余个，近33％的基因型与生殖道损伤有关。感染生殖道的hpv可分为两种：低危型(lowrisk，lr)和高危型(highrisk，hr)。其中，hpv-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68是常见的hpv高危型感染，与宫颈癌有密切联系；而hpv-6和11则为hpv低危型。
流行病学研究表明，国内最常见的hpv基因型为hpv-16、18和52，在广东潮州地区，hpv-52的流行率甚至高于hpv-16和18。根据文献报道，广东潮州地区检出的hpv高危型样本中，hpv-52占33.4％，高于hpv-16(20.95％)，而hpv-18的比例仅为8.36％。此外，我国各地区报道的hpv-16和18的流行率分别为1.7-2.5％和0.3％-0.8％。而根据1995-2009年所有发表的hpv检测和基因分型研究的荟萃分析表明，全世界hpv-16和18的流行率为3.2％和1.4％，而且欧洲、非洲和北美洲的hpv-16和18的流行率高于亚洲。其它hpv基因型，国内较常见的有hpv-6、11、16、33、18、52和58，不同地区流行率有所不同，而根据国际上的报道，hpv-16、18、52、31等最为常见，全世界的流行率分别为3.2％、1.4％、0.9％和0.8％。此外，在欧洲和北美地区，51和39型也是较为常见的基因型，特别是在欧洲，hpv-39的流行率为0.8％，仅次于hpv-16、31和18。但是hpv-39在国内却少有报道。
基于以上特点，本研究拟采用一种基于电泳分析的多重pcr筛查技术能同时筛查七种常见的人乳头瘤病毒：hpv-6、11、16、18、33、52和58。简单快速和方便，并对该方法的特异性和灵敏度进行了分析，同时以荧光定量pcr方法为参考标准进行了140份临床筛选标本的验证。
技术实现要素：
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本研究发明设计了一种基于电泳分析的多重pcr筛查方法可以灵敏、快速地筛查出七种人乳头瘤病毒，能够用于人乳头瘤病毒感染的分子流行病学调查。
本发明首先包括一组筛查5种高危型和2种低危型hpv的引物，引物序列见表1.
表1.七种人乳头瘤病毒引物设计体系浓度及产物大小。
本发明还包括用上述引物扩增7种hpvdna的pcr方法。以dna为模板，用上述引物进行pcr反应并进行电泳分析，根据相应条带大小判定样品中是否含有hpvdna。反应体系如表2。反应条件为：：95℃，10min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s；35cycles；72℃，10min。反应体系中所述模板可以任意一种或任意2到7种上述靶标的混合。
表2.多重pcr反应体系
本发明还包括对pcr产物进行电泳分离和片段分析。观察电泳条带及峰图，根据峰图确定各个靶基因对应的实际检测长度。见附图。
在一个优选例中。上述7对引物按照一定浓度比例混合成多重体系。所得到的电泳条带可能是上述7个条带的1到7个，代表样品中1种或多种hpvdna的存在。
优选地，本发明的反应体系为25μl。
优选地，反应体系中hpv6上下游引物终浓度都为50nm。
本发明的有益效果在于：本发明能够在一管pcr反应体系中同时筛查多种不同的hpv。方法特异性好，每个反应均显示明显可鉴别的电泳条带，且只出现特异信号，无交叉反应；灵敏度高：本发明所建立的筛查方法的最低检出限可达到1.2×102copyμl，见表3。成本较低：本发明建立的基于电泳分析分析的多重pcr方法筛查7种常见人乳头瘤病毒的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件简单无需复杂操作。
附图说明
七种人乳头瘤病毒电泳分析结果。1.阴性对照；2.hpv-6(157bp)；3.hpv-11(266bp)；4.hpv-16(294bp)；5.hpv-18(340bp)；6.hpv-33(377bp)；7.hpv-52(404bp)：8.hpv-58(442bp)9.七种人乳头瘤病毒同时检出结果；m.分子量参比。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1：病毒株及临床样本的筛选：
选用七种人乳头瘤病毒(hpv-6、hpv-11、hpv-16、hpv-18、hpv-33、hpv-52和hpv-58)病毒株及腺病毒(adenovirus，adv)、人博卡病毒(humanbocavirus，hbov)阳性标本。上述病毒株和标本用于本次实验设计及评价基于电泳分析的多重pcr筛查方法的特异性和灵敏度。
哨点医院共收集140份人乳头瘤病毒临床标本，阴道分泌物，并收集患者的临床资料。
实施例2：筛查引物设计及验证：
通过不同型别的人乳头瘤病毒的多序列比对，确定保守区靶基因，运用primerpremier5.0进行引物设计及分析评价，参考多序列比对结果，设计过程中不仅需要考虑不同目标基因的引物对在一个反应体系内共扩增的问题，即评估tm值、gc含量，避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，并且pcr产物tm值也能很好的区分，将设计的引物通过ncbiprimer-blast做进一步分析评价，并利用blast进行同源性比对。在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(tag)，构成特异性嵌合引物。见表1。
分别用已知病毒种类的阳性标本(已经其他方法验证的临床标本、灭活抗原)为模板，阴性临床样品为阴性对照，进行单引物单模板pcr反应，使用qiagen公司multiplexpcr试剂盒，25μlpcr反应体系扩增完成后，pcr产物进行电泳分析，确定各型引物的扩增效率及特异性。
实施例3：多重pcr体系的建立及条件优化：
采用qiagen公司multiplexpcr试剂盒进行pcr扩增，确定嵌合引物和通用引物的比例：体系中各嵌合引物的浓度为50nm见表1，反应体系终体积为25μl见表2。
对循环数、退火温度进行摸索，将最优条件组合，确定最优反应条件为第一步95℃10min；第二步，以dna为模板的pcr反应。
对pcr产物进行自动化电泳检测。观察电泳条带及峰图，根据峰图确定各个靶基因对应的实际检测长度。见附图。
实施例4.多重pcr体系特异性验证和检出限分析：
特异性验证：配制25μl多重混合引物工作液，使pcr体系中各嵌合引物终浓度为50nm，通用引物浓度为1μm，选择hpv-6、hpv-11、hpv-16、hpv-18、hpv-33、hpv-52、hpv-58、腺病毒(adenovirus，adv)、人博卡病毒(humanbocavirus，hbov)阳性标本的核酸作为特异性评估样本，采用前期建立和优化的反应条件进行检测，结果表明，表明该筛查方法具有较好的特异性，能够将目标与非目标微生物核酸有效区分开。。
最低检出限评估：将各病毒质粒标准品梯度稀释至108、107、106、105、104、103、102、101拷贝μl，配制25μl多重混合引物工作液，pcr产物在电泳仪上进行电泳分析，评价多重筛查体系的灵敏度。非同日三次平行实验。验证结果见表3。
表3.筛查体系中七种人乳头瘤病毒单模板和多模板检出限
实施例5.临床标本筛查验证体系：
哨点医院收集140份阴道分泌物，提取140份临床标本核酸，各取5μl为模板，用建立的多重体系筛查。同时，用已发表方法(荧光定量pcr)作为参考标准平行验证常见的七种 常见的人乳头瘤病毒。
结果表明，本研究所建立的多重pcr方法筛查人乳头瘤病毒感染的阳性标本为28份(20％)，其中7份为混合感染标本，均为两重感染，和前期建立的单一hpv荧光定量pcr法筛查结果完全一致。为进一步确认筛查结果，所有方法筛查的阳性结果均经过测序验证。见表4。
表4.140份标本中七种人乳头瘤病毒筛查情况